白文慧 ，彭韻志 ，胡 海，靳 敏 ，陳張軍 ，王占黎 ，于 慧

(1.包頭醫(yī)學(xué)院研究生院，內(nèi)蒙古 包頭 014040;2.包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院;3.內(nèi)蒙古自治區(qū)疾病相關(guān)生物標(biāo)志物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)是一種慢性腸道疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(crohn’s disease，CD)。其中UC主要累及結(jié)腸[1]，主要表現(xiàn)為炎癥和腸上皮細(xì)胞的屏障功能破壞[2-3]。芳香烴受體AhR/I-κB信號通路介導(dǎo)了機(jī)體的免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)，在UC發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色[4- 5]。天然藥物香青蘭乙醇提取物含有豐富黃酮類活性化合物[6]，具有良好的抗炎、抗氧化活性[7-8]。前期研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物通過與AhR受體結(jié)合發(fā)揮抗炎作用[9-10]。本研究擬通過硫酸葡聚糖鈉鹽(dextran sulfate sodium，DSS)建立 UC 大鼠模型，從AhR/I-κB信號通路分析香青蘭乙醇提取物治療UC的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動物與試劑 SPF級SD雄性大鼠30只，體質(zhì)量160～180 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK(蒙)2020-0004。香青蘭(中國內(nèi)蒙古通遼市扎魯特旗巴彥塔拉村)。硫酸葡聚糖鈉鹽(DSS)(美國MP Biomedical公司)。水合氯醛、蘇木精、伊紅(中國北京索萊寶有限公司)。Real-time PCR擴(kuò)增試劑盒(中國寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)。引物(中國上海生物工程股份有限公司)。p-I-κB抗體(美國Cell Signaling Technology公司)。

1.2儀器及設(shè)備 全自動脫水機(jī)(德國Leica 公司，型號：HistoCore PEARL)、石蠟包埋機(jī)(德國Leica 公司，型號：HISTOCORE)、石蠟切片機(jī)(德國Leica 公司，型號：RM2016)、光學(xué)顯微鏡(德國Leica 公司，型號：471465)， 7500實(shí)時熒光定量PCR儀(美國ABI公司，7500)，梯度PCR儀(美國賽洛捷克公司，SCI1000-G)、冰凍切片機(jī)(德國Leica 公司，型號：CM1950)

1.3模型制備及給藥 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為3組，每組10只，分別為空白組、模型組和香青蘭組。除空白組外，其余組給予5 %的DSS飲用。造模時長為7 d。造模結(jié)束后，香青蘭組灌胃給予400 mg/kg香青蘭提取物，空白組和模型組灌胃給予等量生理鹽水。給藥7 d后，水合氯醛腹腔注射麻醉，取血液和組織標(biāo)本于-80 ℃保存。

1.4疾病活動指數(shù)(disease activity index,DAI) 每日記錄各組大鼠的體重、大便性狀(正常、松散、腹瀉)及便血情況，并根據(jù)以上評分計(jì)算DAI，DAI評分標(biāo)準(zhǔn)。見表1。

表1 DAI評分標(biāo)準(zhǔn)

1.5HE染色 縱向剖開大鼠結(jié)腸，用預(yù)冷的生理鹽水洗凈，截取大鼠結(jié)腸潰瘍病變部位，放入4 %的多聚甲醛中固定48 h后，將各組大鼠結(jié)腸組織常規(guī)石蠟包埋、切片，進(jìn)行常規(guī)HE染色，顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.6實(shí)時熒光定量PCR法檢測AhR、IL-1β、IL-6和IL-8 mRNA表達(dá)水平 將結(jié)腸組織于液氮中研磨后，按組織 ∶液體=1 ∶10的比例加入Trizol溶液進(jìn)行裂解，靜置5 min，待充分反應(yīng)后加入氯仿，離心后，分離上層水相至新的離心管中，再加入異丙醇進(jìn)行萃取，提取總 RNA。參照試劑盒提供的操作步驟，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模版擴(kuò)增目的基因。Real-time PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括cDNA模板2 μL，引物對各0.8 μL(10 pmol/μL)，TB Green Premix 10 μL，ROX Reference Dye 0.08 μL ，水6.32 μL。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性(95 ℃，30 s)；擴(kuò)增過程(95 ℃，5 s；60 ℃，30 s)，循環(huán)40次；溶解曲線分析：(95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，95 ℃，15 s)。引物序列見表2。

表2 引物序列

1.7Western blot檢測結(jié)腸組織中p-I-κB蛋白表達(dá)水平 取結(jié)腸組織，液氮研磨，按組織 ∶抽提液=1 ∶5的比例加入蛋白抽提液，充分混勻，靜置10 min。離心后取上清液。BCA法檢測蛋白濃度，蛋白采用10 %十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠 (SDS-PAGE)電泳分離后轉(zhuǎn)膜。5 %脫脂奶粉溶液搖床上封閉1 h，封閉后按1 ∶1000的比例加入p-I-κB的一抗，密封4 ℃孵育過夜。孵育一抗后用TBST洗膜5 min，重復(fù)清洗3次，之后加入二抗，避光孵育1.5 h，TBST洗膜3次。采用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.8免疫熒光檢測結(jié)腸組織中AhR蛋白表達(dá)水平 取結(jié)腸組織于4 %多聚甲醛固定2 h，而后轉(zhuǎn)入30 %蔗糖中，室溫下脫水48 h，用冰凍切片機(jī)取10 μm厚度的結(jié)腸組織在0.3 %Triton中破膜10 min，然后進(jìn)行抗原抗體染色。AhR一抗4 ℃孵育過夜，PBS清洗三次，滴加熒光信號標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，DAPI染核10 min。采用激光共聚焦拍照觀察。

2 結(jié)果

2.1香青蘭顯著降低UC大鼠DAI評分：空白組大鼠毛色光亮，飲食及大便正常。模型組大鼠毛色干枯，進(jìn)食減少，體重下降，大便次數(shù)增多并且伴有血便。香青蘭組大鼠的血便、毛色、精神狀態(tài)逐漸好轉(zhuǎn)，體重也較之前增加。見圖1。

圖1 各組大鼠DAI評分

2.2香青蘭有效緩解UC大鼠結(jié)腸黏膜損傷：對照組大鼠結(jié)腸黏膜上層完整,杯狀細(xì)胞形狀規(guī)則平整，黏膜層無炎性細(xì)胞浸潤。模型組大鼠黏膜上層破損嚴(yán)重、黏膜下水腫、出血，已無明顯的腺細(xì)胞形狀，黏膜下層大量炎性細(xì)胞浸潤。香青蘭組大鼠黏膜層細(xì)胞形狀規(guī)則，腺體排列整齊，黏膜層基本完整。見圖2。

圖2 各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化(HE 染色，×100)

2.3香青蘭降低UC大鼠結(jié)腸組織炎癥因子的轉(zhuǎn)錄水平：與空白組比較，模型組IL-1β、IL-6和IL-8 mRNA表達(dá)上調(diào)，AhR表達(dá)下調(diào)(P<0.05)；與模型組比較，香青蘭組IL-1β、IL-6和IL-8 mRNA表達(dá)下調(diào)，AhR表達(dá)則上調(diào)(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠結(jié)腸組織 AhR、IL-1β、IL-6和

2.4香青蘭降低UC大鼠結(jié)腸組織p-I-κB蛋白表達(dá)：與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織p-I-κB蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。與模型組比較，香青蘭組大鼠結(jié)腸組織、p-I-κB 蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。見圖4。

圖4 各組大鼠結(jié)腸組織 p-I-κB 蛋白表達(dá)水平

2.5香青蘭增加UC大鼠結(jié)腸組織AhR蛋白表達(dá)：與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織AhR蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。與模型組比較，香青蘭組大鼠結(jié)腸組織AhR蛋白表達(dá)上升(P<0.05)。見圖5。

圖5 各組大鼠結(jié)腸組織AhR表達(dá)結(jié)果(免疫熒光，×40)

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎是一類原因不明的慢性炎癥疾病。近年來研究重點(diǎn)在于尋找天然藥物來代替化學(xué)療法。天然植物香青蘭具有抗菌、抗氧化的作用[11]，廣泛應(yīng)用于冠心病、心肌缺血、哮喘等疾病的治療[12-13]，目前尚無針對潰瘍性結(jié)腸炎的研究報(bào)道。本文擬探討香青蘭通過調(diào)節(jié)AhR/I-κB通路相關(guān)蛋白及炎癥因子的表達(dá)對潰瘍性結(jié)腸炎的保護(hù)作用。

芳香烴受體(AhR)是一種核轉(zhuǎn)錄因子，在無配體時，與熱休克蛋白(HSP90)結(jié)合，游離在細(xì)胞質(zhì)中，在與配體結(jié)合后，進(jìn)入核內(nèi)，與芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白(ARNT)結(jié)合，促進(jìn)相關(guān)基因的表達(dá)[14]。AhR受體在不同的組織或細(xì)胞中表達(dá)，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮的作用也不同。在腸道組織中，腸上皮黏膜屏障是抵御病原體入侵的第一道防線，對于保護(hù)腸組織的完整具有重大意義。AhR的缺失不僅影響腸上皮細(xì)胞(IECs)的再生和發(fā)育[15]，并且會大大減少杯狀細(xì)胞和黏液的產(chǎn)生。香青蘭乙醇提取物富含豐富的黃酮類物質(zhì)，可以作為AhR受體激動劑，激活A(yù)hR,從而降低由DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸黏膜反應(yīng)[16]。

NF-κB作為一種核轉(zhuǎn)錄因子，正常情況下與其抑制蛋白(I-κB)結(jié)合，以無活性方式游離在細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)發(fā)生刺激時，激活信號可激活I(lǐng)-κB激酶 (IKK)，IKK可誘導(dǎo)I-κB發(fā)生磷酸化，從而解除I-κB對NF-κB的抑制作用，使 NF-κB進(jìn)入核內(nèi)[17]，促進(jìn)炎癥因子的轉(zhuǎn)錄。P-I-κB在潰瘍性結(jié)腸炎模型中高度表達(dá)[18]，從而使IL-1B、IL-6、IL-8等炎癥因子的表達(dá)增加[19- 20]。AhR的激活可以抑制I-κB的磷酸化水平，提示AhR通路對炎癥因子轉(zhuǎn)錄信號的控制[21- 22]。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)香青蘭灌胃治療后，大鼠結(jié)腸黏膜層恢復(fù)完整，說明香青蘭對結(jié)腸黏膜有保護(hù)作用。與空白組比較，模型組AhR的mRNA水平、蛋白表達(dá)水平均降低，p-I-κB蛋白表達(dá)升高，IL-1B、IL-6、IL-8 mRNA水平升高。與模型組比較，香青蘭組AhR的mRNA水平、蛋白表達(dá)水平均升高，p-I-κB蛋白表達(dá)降低， IL-1B、IL-6、IL-8 mRNA水平降低。提示香青蘭乙醇提取物可作為配體激活A(yù)hR，促進(jìn)AhR基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，降低p-I-κB的磷酸化水平，減少IL-1B 、IL-6、IL-8等炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，達(dá)到控制結(jié)腸粘膜免疫反應(yīng)、維護(hù)腸黏膜完整的目的，為潰瘍性結(jié)腸炎的治療提供了新思路。