方慧玲， 陳子齊， 朱宇清

（上海市臨床檢驗(yàn)中心，上海 200126）

自2019年世界范圍內(nèi)的新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）疫情暴發(fā)以來(lái)，各國(guó)為應(yīng)對(duì)疫情采取了不同的防控策略。我國(guó)采取動(dòng)態(tài)清零的防控政策。新型冠狀病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性是COVID-19確診的首要標(biāo)準(zhǔn)，新型冠狀病毒特異性抗體檢測(cè)可作為未接種疫苗患者的診斷參考依據(jù)[1]。隨著疫情防控形勢(shì)的變化，相關(guān)部門規(guī)定了3類人群可以應(yīng)用抗原檢測(cè)進(jìn)行自我檢測(cè)或人員篩查[2]，作為核酸檢測(cè)能力不足時(shí)的補(bǔ)充。本文對(duì)我國(guó)新型冠狀病毒抗原檢測(cè)試劑盒性能和國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究進(jìn)行綜述。

1 新型冠狀病毒病原學(xué)特征

新型冠狀病毒屬于β冠狀病毒屬，是有包膜的單股正鏈RNA病毒，病毒的顆粒直徑約為100 nm。其基因組從5'端開(kāi)始到3'端，分別有12個(gè)（ORF1a、ORF1b、S、ORF3a、E、M、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8、N、ORF10）開(kāi)放閱讀框和3'端多聚腺苷酸尾[3]。S、E、M、N分別編碼刺突（spike，S）蛋白、包膜（envelope，E）蛋白、膜（membrane，M）蛋白和核衣殼（nucleocapsid，N）蛋白4種結(jié)構(gòu)蛋白。因冠狀病毒的ORF1ab、N和E基因序列高度保守，現(xiàn)有的核酸檢測(cè)方法均選擇ORF1ab、N和E基因區(qū)域序列設(shè)計(jì)引物和探針。S基因是新型冠狀病毒高度可變的基因，其編碼的S蛋白（高度糖基化的Ⅰ型膜蛋白）通過(guò)與其受體結(jié)合進(jìn)入宿主細(xì)胞[4]，與病毒的傳染能力密切相關(guān)。N蛋白則與病毒基因組宿主RNA相互識(shí)別，參與基因組復(fù)制和細(xì)胞信號(hào)通路調(diào)節(jié)。因此，免疫學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)通常選用針對(duì)N蛋白或S蛋白抗原表位的抗體進(jìn)行系統(tǒng)構(gòu)建。

2 新型冠狀病毒抗原檢測(cè)

從病毒進(jìn)入人體到在人體樣本中檢測(cè)到新型冠狀病毒抗原的這段時(shí)間被稱為抗原檢測(cè)的窗口期。人體在感染新型冠狀病毒的平均5～6 d后會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)癥狀（部分人群無(wú)癥狀表現(xiàn)但也有傳染力），病毒大量繁殖，呼吸道樣本中病毒含量最高[5]。有文獻(xiàn)報(bào)道，冠狀病毒N蛋白抗原在臨床癥狀出現(xiàn)前1 d就可被檢測(cè)到[6]。有研究結(jié)果顯示，N蛋白抗原在患者出現(xiàn)癥狀的第2天開(kāi)始顯著上升，并在出現(xiàn)癥狀的第2～7天達(dá)到峰值，隨后開(kāi)始下降[7]。

2.1 新型冠狀病毒抗原檢測(cè)技術(shù)

病原微生物抗原檢測(cè)常用的方法有化學(xué)發(fā)光法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）、電化學(xué)發(fā)光法（electrochemiluminescence assay，ECLIA）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、側(cè)向流免疫層析法（lateral flow immunochromatography assay，LFIA）。目前的新型冠狀病毒抗原快速檢測(cè)試劑主要是基于LFIA。

LFIA是一種快速免疫層析方法，已被廣泛應(yīng)用于臨床多種病原微生物檢測(cè)，與其他免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)相比，其最大的特點(diǎn)就是快速、簡(jiǎn)便。檢測(cè)卡主要由樣品墊、結(jié)合墊、醋酸纖維素膜、吸水墊，以及用于支撐的聚氯乙烯背板卡盒組成。結(jié)合墊上包被有不同示蹤技術(shù)的標(biāo)記抗體，醋酸纖維素膜上有通過(guò)劃線靜電吸附的方式分別在測(cè)試線和對(duì)照線上包被單克隆抗體及抗標(biāo)記抗體的二抗。當(dāng)樣品從進(jìn)樣孔進(jìn)入樣品墊后，樣品中的新型冠狀病毒抗原通過(guò)毛細(xì)作用迅速移動(dòng)，與結(jié)合墊上的標(biāo)記抗體結(jié)合，并進(jìn)一步移動(dòng)，與測(cè)試線上的單克隆抗體結(jié)合，而過(guò)量的標(biāo)記抗體則繼續(xù)移動(dòng)，與控制線上的二抗結(jié)合。最終通過(guò)肉眼或特定儀器讀取測(cè)試線和控制線上標(biāo)記物的信號(hào)強(qiáng)弱來(lái)判定結(jié)果。近年來(lái)，隨著量子點(diǎn)、上轉(zhuǎn)發(fā)光、碳納米管、納米酶等新型技術(shù)與材料科學(xué)的發(fā)展，LFIA與傳統(tǒng)的膠體金技術(shù)相比，檢測(cè)性能更加穩(wěn)定[8]。GRANT等[9]應(yīng)用half-strip LFIA技術(shù)檢測(cè)新型冠狀病毒抗原，靈敏度可達(dá)0.65 ng/mL。

通過(guò)電化學(xué)、光學(xué)、微流控等生物傳感技術(shù)也可實(shí)現(xiàn)病毒抗原定量檢測(cè)。YAKON等[10]發(fā)明了一種新型紙基電化學(xué)傳感器，將其應(yīng)用于新型冠狀病毒S抗原檢測(cè)，最低檢測(cè)限可達(dá)0.11 ng/mL，該方法為非標(biāo)記定量技術(shù)，因此不需要依賴于任何抗體。材料科技的進(jìn)步在大大提高生物樣本檢測(cè)靈敏度的同時(shí)也縮短了檢測(cè)時(shí)間。儀器尺寸的縮小使設(shè)備的應(yīng)用場(chǎng)景更為靈活，有學(xué)者研發(fā)出一種基于高密度導(dǎo)電納米線陣列的柔性免疫傳感器的智能口罩，小型化的阻抗電路和無(wú)線通信單元嵌入，以及<100 nm的納米線尺寸和相鄰納米線間距，可成功鎖定納米級(jí)別的病毒顆粒，有效識(shí)別從口腔呼出氣體中的冠狀病毒S蛋白；對(duì)霧化氣溶膠中冠狀病毒的檢測(cè)能力達(dá)到7 PFU/mL，耗時(shí)僅5 min[11]。

2.2 新型冠狀病毒抗原檢測(cè)試劑性能

盡管新型冠狀病毒快速檢測(cè)試劑具有簡(jiǎn)單、快速等諸多優(yōu)點(diǎn)，但其臨床檢測(cè)性能一直存在爭(zhēng)議。SCOHY[12]等對(duì)106份新型冠狀病毒逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的鼻咽拭子樣本進(jìn)行了抗原快速檢測(cè)，結(jié)果僅有32份（30.2%）陽(yáng)性。而PORTE等[13]對(duì)82份鼻/口咽拭子樣本的比對(duì)結(jié)果顯示，其測(cè)試的快速檢測(cè)試劑的敏感性和特異性分別為93.9%和100.0%。全球創(chuàng)新診斷基金會(huì)（the Foundation for Innovative New Diagnostics，F(xiàn)IND）在一項(xiàng)全球范圍內(nèi)的新型冠狀病毒快速檢測(cè)試劑評(píng)估計(jì)劃中，評(píng)估了28個(gè)品牌的檢測(cè)試劑[14]，其中包括14個(gè)中國(guó)企業(yè)研發(fā)的試劑盒，截至2022年3月16日，已經(jīng)完成評(píng)估的9家中國(guó)企業(yè)研發(fā)的10種試劑盒的評(píng)估數(shù)據(jù)顯示，抗原檢測(cè)試劑敏感度多為70.5%～92.1%，特異性多為98.3%～100%，≤7 d敏感度為74.2%～96.2%；檢測(cè)RT-PCR循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）≤25的樣品的敏感性為80.3%～100.0%，檢測(cè)Ct值≤33的樣品的敏感性為76.3%～100.0%。德國(guó)聯(lián)邦疫苗及生物醫(yī)學(xué)研究所（Paul-Ehrlich Institute，PEI）的性能評(píng)估數(shù)據(jù)也反映了相似的結(jié)果[15]，其中部分中國(guó)品牌的檢測(cè)試劑的驗(yàn)證結(jié)果顯示，在Ct值≤25時(shí)，所驗(yàn)證試劑的敏感度均>85%；但在Ct值為25～30時(shí)，僅有3個(gè)品牌的試劑敏感度>85%；而當(dāng)Ct值≥30時(shí)，所有品牌試劑的驗(yàn)證敏感度均<70%；各品牌試劑最終評(píng)估的總體臨床靈敏度為34%～92%。RT-PCR檢測(cè)的Ct值代表檢測(cè)樣本中的病毒載量，Ct值越低，說(shuō)明檢測(cè)樣本中病毒載量越高，提示抗原檢測(cè)的窗口時(shí)間要長(zhǎng)于核酸檢測(cè)；評(píng)估樣本中病毒載量越高，受評(píng)抗原快速檢測(cè)試劑的靈敏度也越高。FIND多中心研究數(shù)據(jù)[14]顯示，即使同一個(gè)品牌的檢測(cè)試劑，在不同的檢測(cè)點(diǎn)呈現(xiàn)的性能參數(shù)也不一致，如印度地區(qū)的檢測(cè)靈敏度比其他地區(qū)低，具體機(jī)制尚不明確，可能與印度地區(qū)的溫度和濕度有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)試劑盒于37 ℃溫浴10 min后，再于37 ℃下進(jìn)行檢測(cè)，45.5%的試劑盒靈敏度下降了90%，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，靈敏度下降的試劑更多，而2～4℃環(huán)境則有可能使試劑盒的特異性降低[16]。值得注意的是，目前關(guān)于新型冠狀病毒抗原檢測(cè)試劑性能的研究均以核酸檢測(cè)方法為參比方法，但不同方法學(xué)的核酸檢測(cè)性能不盡相同，同一品牌的抗原檢測(cè)試劑以不同的核酸檢測(cè)方法為參比方法時(shí)，其性能評(píng)價(jià)結(jié)果也不同[17]。DINNES等[18]對(duì)新型冠狀病毒抗原快速檢測(cè)方法的相關(guān)研究進(jìn)行了薈萃分析，發(fā)現(xiàn)不同品牌試劑盒的檢測(cè)靈敏度存在顯著差異。

表1 中國(guó)品牌新型冠狀病毒抗原快速診斷試劑FIND的評(píng)估數(shù)據(jù)

續(xù)表1

3 新型冠狀病毒抗原檢測(cè)的應(yīng)用

截至2022年4月13日，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局緊急授權(quán)使用CLIA、ECLIA、LFIA、MIFA和生物傳感器等方法進(jìn)行新型冠狀病毒抗原檢測(cè)的50個(gè)試劑，其中19個(gè)品牌試劑被授權(quán)用于家庭自測(cè)。我國(guó)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局共批準(zhǔn)了27個(gè)品牌新型冠狀病毒抗原檢測(cè)試劑作為國(guó)家應(yīng)急儲(chǔ)備。這27個(gè)品牌的抗原檢測(cè)試劑均為基于LFIA的快速檢測(cè)產(chǎn)品，均可在30 min內(nèi)給出檢測(cè)結(jié)果，差異在于部分試劑覆蓋識(shí)別的抗原表位和標(biāo)記顯色技術(shù)不同。27種檢測(cè)試劑中，有15種通過(guò)了PEI的性能驗(yàn)證，并被德國(guó)聯(lián)邦藥品和醫(yī)療器械管理局列入專業(yè)使用或家庭自測(cè)白名單。

世界衛(wèi)生組織提出，新型冠狀病毒抗原快速檢測(cè)試劑在滿足最低檢測(cè)性能要求（敏感性80%，特異性97%）的情況下可用于有癥狀人群的檢測(cè)[19]。定性檢測(cè)方法的性能評(píng)價(jià)指標(biāo)除靈敏度和特異性外，還包括檢出限、重復(fù)性、符合率、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值[20-21]。在方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中，增加靈敏度，就一定會(huì)損失一部分特異性，反之亦然。當(dāng)靈敏度的增加幅度超過(guò)一定范圍時(shí)（1-特異性），陽(yáng)性預(yù)測(cè)值就會(huì)增加，反之將下降。但在有更為“準(zhǔn)確”的驗(yàn)證方法的情況下，作為用于普通人群篩查的快速檢測(cè)試劑，首先應(yīng)該保證的是對(duì)“真陰性”人群的準(zhǔn)確識(shí)別，提高其篩查的陰性樣本為陰性的可能性（陰性預(yù)測(cè)值）。選擇高靈敏度的檢測(cè)方法，可以最大限度地減少漏診活躍病例（假陰性）的可能性，快速切斷傳播鏈。而這些試劑在真實(shí)世界中檢測(cè)的陽(yáng)性結(jié)果，對(duì)于不同的應(yīng)用場(chǎng)景，會(huì)有不同的解讀：在發(fā)病率（患病率）為1%的地區(qū)或人群中，用敏感性為85%、特異性為98.9%的檢測(cè)試劑對(duì)10 000人進(jìn)行篩查，可檢出陽(yáng)性184例，但其中真實(shí)陽(yáng)性的僅有85例，另外99例均為假陽(yáng)性，此時(shí)陽(yáng)性預(yù)測(cè)值僅為46.20%；但當(dāng)該試劑被應(yīng)用于發(fā)病率（患病率）為10%的地區(qū)或人群時(shí)，10 000人檢測(cè)的陽(yáng)性結(jié)果將會(huì)有940例，其中真陽(yáng)性為850例，假陽(yáng)性為90例，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為90.43%；此時(shí)的陽(yáng)性結(jié)果對(duì)于疾病診斷的指示作用大幅提高[18]。因此，世界衛(wèi)生組織并不建議在預(yù)期患病率低的地區(qū)或人群中使用快速檢測(cè)試劑。

2022年3—5月，新型冠狀病毒奧密克戎變異株在上海市流行，當(dāng)?shù)卣畬?duì)不同風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域采取了差異化的篩查方式，抗原快速檢測(cè)作為核酸檢測(cè)的補(bǔ)充，有效彌補(bǔ)了大規(guī)模核酸檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)的不足。對(duì)低風(fēng)險(xiǎn)地區(qū)增加抗原篩查，利用抗原檢測(cè)速度快的特點(diǎn)，快速固定異常人群，以降低人員流動(dòng)帶來(lái)的疾病傳播風(fēng)險(xiǎn)，提高檢測(cè)效率。同時(shí)，在醫(yī)院門急診患者無(wú)有效核酸檢測(cè)報(bào)告的情況下，可根據(jù)現(xiàn)場(chǎng)抗原篩查的陰性結(jié)果先行救治，在提升就醫(yī)效率的同時(shí)，也避免產(chǎn)生醫(yī)患矛盾。

4 討論

現(xiàn)有的新型冠狀病毒檢測(cè)方法中，核酸檢測(cè)只針對(duì)特定病毒基因的特定片段進(jìn)行擴(kuò)增，從方法學(xué)來(lái)說(shuō)，其特異性為100%，因此是新型冠狀病毒抗原檢測(cè)準(zhǔn)確與否的“金標(biāo)準(zhǔn)”?，F(xiàn)有的核酸檢測(cè)方法靈敏度多為10～150拷貝/反應(yīng)，已有研究報(bào)道部分檢測(cè)方法靈敏度可達(dá)到1拷貝/反應(yīng)[17]，是抗原檢測(cè)的靈敏度的100～1 000倍。核酸檢測(cè)具有嚴(yán)格的環(huán)境與儀器設(shè)備要求，需要熟練的操作人員，樣本周轉(zhuǎn)時(shí)間為4～6 h，甚至更長(zhǎng)。而抗原檢測(cè)快速、簡(jiǎn)便，可大大提升檢測(cè)效率，推動(dòng)防控哨點(diǎn)前移，在疾病流行時(shí)的人群篩查中有良好的輔助功能。對(duì)于抗原檢測(cè)試劑的應(yīng)用，有幾個(gè)方面的問(wèn)題需要持續(xù)關(guān)注。

（1）新型冠狀病毒的變異性。與更早的毒株相比，奧密克戎株（B.1.1.529型）發(fā)生了重大變異，50個(gè)變異位點(diǎn)中有超過(guò)30個(gè)氨基酸位點(diǎn)的變異發(fā)生在S蛋白處。有學(xué)者[22]評(píng)估了商品化新型冠狀病毒中和抗體對(duì)不同變異株的中和能力，發(fā)現(xiàn)44個(gè)中和抗體中，僅有6個(gè)單抗對(duì)奧密克戎毒株仍舊保持較強(qiáng)的中和能力，這6個(gè)單抗均識(shí)別奧密克戎或其他冠狀病毒保守的抗原位點(diǎn)。提示S蛋白作為病毒的豐富的跨膜蛋白具有很強(qiáng)的免疫原性，同時(shí)其氨基酸序列的多樣性也使其更容易與其他冠狀病毒區(qū)別開(kāi)，試劑開(kāi)發(fā)者和專業(yè)的檢測(cè)機(jī)構(gòu)有必要采取一些措施來(lái)降低與新型冠狀病毒突變相關(guān)的敏感性或無(wú)反應(yīng)性導(dǎo)致假陰性結(jié)果的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

（2）醫(yī)學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展抗原檢測(cè)的質(zhì)量保證。專業(yè)技術(shù)人員在項(xiàng)目開(kāi)展前應(yīng)對(duì)試劑性能進(jìn)行充分的評(píng)估，必須關(guān)注每個(gè)批次的試劑質(zhì)量。盡管快速抗原檢測(cè)試劑卡上設(shè)計(jì)了控制線，可對(duì)試劑卡的有效性進(jìn)行判斷，但控制線呈反應(yīng)性僅代表標(biāo)記抗體完成了從結(jié)合墊到吸水墊的層析過(guò)程，并不能保證層析過(guò)程中標(biāo)記抗體-抗原-單克隆抗體的結(jié)合反應(yīng)。因此，專業(yè)技術(shù)人員面對(duì)大量檢測(cè)樣品時(shí)，應(yīng)采用第三方質(zhì)量控制產(chǎn)品確保實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)質(zhì)量。此外，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)加強(qiáng)其分析前質(zhì)量控制，規(guī)范技術(shù)人員樣本采集。采樣時(shí)，應(yīng)使用試劑配套的樣本保存液，不能使用被篩查人員核酸檢測(cè)樣本保存液內(nèi)的樣本進(jìn)行抗原檢測(cè)。

（3）自測(cè)人員應(yīng)仔細(xì)閱讀試劑說(shuō)明書(shū)，按要求完成樣本采集和檢測(cè)。應(yīng)規(guī)范處理檢測(cè)產(chǎn)生的廢棄物，尤其是檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，應(yīng)作為醫(yī)療廢棄物交由專業(yè)人員處理。