黃 國(guó)，陳 騏，池云峰，羅小雪，衣艷嬌，王 迪，隋曉楠

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

黑米作為我國(guó)一類有色稻米，因其良好的口感和香氣而被廣泛食用。黑米的“有色”歸因于較高含量的花青素和原花青素。黑米中游離花青素對(duì)其總量的貢獻(xiàn)率在99.5%～99.9%之間[1]。黑米中主要花青素有矢車菊素-3-葡萄糖苷（cyanidin-3-glucoside，C3G）和芍藥色素-3-葡萄糖苷，前者的含量明顯高于后者[2]。花青素被視為自然界的天然色素，具有預(yù)防、治療心血管疾病、抗癌抗炎、調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)以及良好的清除自由基能力，在食品與醫(yī)療、保健等領(lǐng)域的產(chǎn)品生產(chǎn)、開(kāi)發(fā)中起到重要作用[3]。但由于易受pH值、溫度、輻射與氧氣等環(huán)境因素的影響，花青素在加工與貯藏過(guò)程中往往發(fā)生高度降解或破壞，導(dǎo)致其加工穩(wěn)定性差，生物利用度低下，成為在食品工業(yè)應(yīng)用中的最大阻礙[4]。因此，防止和控制花青素的降解將有助于提高花青素的穩(wěn)定性和生物活性。

近年來(lái)，由于蛋白質(zhì)優(yōu)異的生物相容性和良好的功能特性，以蛋白質(zhì)為載體的多酚穩(wěn)定方式引起了眾多學(xué)者的研究興趣。蛋白質(zhì)作為一種生物大分子，可以通過(guò)氫鍵、疏水相互作用等與多酚小分子發(fā)生結(jié)合進(jìn)一步改善其穩(wěn)定性[5]?；ㄇ嗨赜捎讵?dú)特的多酚結(jié)構(gòu)，已被證實(shí)是一種優(yōu)良的蛋白親和性小分子，可以與包括大豆蛋白在內(nèi)的多種蛋白質(zhì)結(jié)合[6]。一方面，多酚與蛋白質(zhì)的結(jié)合可以影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能特性。You Yaohui等[7]報(bào)道了表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（(-)-epigallocatechin gallate，EGCG）誘導(dǎo)大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）的三級(jí)結(jié)構(gòu)解折疊，暴露出更多的活性基團(tuán)，從而提高起泡、乳化等功能特性。黑米花青素與SPI交聯(lián)后，促使SPI的二級(jí)結(jié)構(gòu)由β-折疊向β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲轉(zhuǎn)變，其起泡和乳化性得到改善[8]。另一方面，蛋白質(zhì)可以充當(dāng)載體進(jìn)而影響多酚的抗氧化能力及生理活性。Zang Zhihuan等[4]發(fā)現(xiàn)牛血清蛋白與乳清分離蛋白可以通過(guò)疏水相互作用和氫鍵與藍(lán)莓花青素結(jié)合，其蛋白顆?？梢宰鳛榛ㄇ嗨氐谋Ｗo(hù)載體。Zou Yucong等[9]研究表明葡萄籽原花青素以靜態(tài)猝滅的方式猝滅SPI的內(nèi)源熒光，并通過(guò)以氫鍵為主導(dǎo)的作用力與SPI形成復(fù)合物，其抗氧化性與穩(wěn)定性顯著提高。水稻谷蛋白分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)表明二聚原花青素能在蛋白質(zhì)內(nèi)腔保持穩(wěn)定，從而提高原花青素的穩(wěn)定性和抗氧化能力[10]。β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白作為大豆蛋白中最主要的2種儲(chǔ)存蛋白，兩者的構(gòu)象、分子質(zhì)量及功能特性上的差異已被眾多學(xué)者所深究[11]。然而更多的集中于多酚對(duì)SPI結(jié)構(gòu)及功能特性的影響，而對(duì)于β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白與多酚的相互作用鮮有研究。Wu Di等[12]研究表明β-伴大豆球蛋白對(duì)金絲桃苷的運(yùn)載能力強(qiáng)于大豆球蛋白；并指出這可能是因?yàn)棣?伴大豆球蛋白/大豆球蛋白的分子質(zhì)量和氨基酸殘基數(shù)量的差異影響了金絲桃苷的運(yùn)載效率。Ochnio等[13]發(fā)現(xiàn)葉酸能夠通過(guò)疏水相互作用結(jié)合至大豆蛋白中并誘導(dǎo)其發(fā)生變化；與β-伴大豆球蛋白相比，大豆球蛋白能夠被葉酸誘導(dǎo)成更加廣泛的聚集體，有利于自組裝以形成更高效的維生素運(yùn)輸載體，并使葉酸的裝載能力高于β-伴大豆球蛋白。研究表明β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白與C3G的相互作用是由疏水相互作用和靜電力共同驅(qū)動(dòng)的，其相互作用改變了大豆蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)和表面活性并在一定程度上降低其熱穩(wěn)定性[14]。盡管該研究詳細(xì)探究了兩者的相互作用及對(duì)蛋白質(zhì)功能特性的影響，然而缺少對(duì)多酚小分子穩(wěn)定性等的探討及兩者在分子水平上相互作用的見(jiàn)解。β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白因不同的結(jié)構(gòu)特征、分子質(zhì)量等特性可能會(huì)影響它們與花青素等多酚小分子的互作機(jī)制（如相互作用力差異），從而影響了多酚的穩(wěn)定性和抗氧化活性。因此，從分子水平機(jī)制上了解β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白與C3G的相互作用的差異，對(duì)揭示β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白對(duì)C3G的穩(wěn)定性和抗氧化活性的影響十分必要[8]。

因此，本實(shí)驗(yàn)在前人研究基礎(chǔ)上以C3G與β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白為研究對(duì)象，借助多重光譜以及分子模擬對(duì)接等技術(shù)手段，揭示C3G與β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白之間的相互作用，深入分析C3G與大豆蛋白的互作機(jī)理與差異。該研究旨在分子水平上為花青素的保護(hù)提供見(jiàn)解，從而更深層次了解大豆蛋白對(duì)花青素等酚類物質(zhì)的穩(wěn)態(tài)化作用及生理活性特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑米花青素由實(shí)驗(yàn)室自制[15]，以C3G含量為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)花青素純度為（95.05±0.92）%；低溫脫脂豆粕 山東禹王實(shí)業(yè)有限公司；所用試劑均為分析純，水均為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

ALPHA 1-4LSC冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司；FTIR-8400S傅里葉變換紅外（Fourier transform infrared，F(xiàn)TIR）光譜儀 日本島津公司；F-7100熒光光譜儀日本Hitachi公司；Chirascan圓二色譜（circular dichroism，CD）儀 英國(guó)應(yīng)用光物理公司。

1.3 方法

1.3.1β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白的制備

根據(jù)Nagano等[16]描述的方法稍作改動(dòng)。將脫脂豆粕粉碎過(guò)100 目篩，得到脫脂大豆粉。將脫脂大豆粉分散溶解在10 倍體積的去離子水中。在室溫下用2 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.5，在4 ℃，10 000×g離心30 min，棄沉淀物；取上清液加入固體無(wú)水亞硫酸氫鈉（0.98 g/L）并用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至6.4，保持4 ℃過(guò)夜。在4 ℃、6 500×g離心20 min，所得沉淀為大豆球蛋白。其上清液中按照最終濃度為0.25 mol/L添加固體NaCl并用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至5.0，在4 ℃、10 000×g離心30 min，棄沉淀物。取上清液用等體積去離子水稀釋，而后調(diào)節(jié)pH值至4.8，在4 ℃、6 500×g離心20 min，所得沉淀物即為β-伴大豆球蛋白。用去離子水水洗沉淀物β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白后再溶解，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.5，在3 500 Da透析袋中透析48 h后，冷凍干燥得到β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白粉末備用。經(jīng)凱氏定氮法測(cè)定（N×6.25），分別得到基于干基蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（92.40±1.03）%、（97.25±0.92）%的β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白。而后，通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定分別得到純度為（83.21±2.18）%、（92.65±1.73）%的β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白[8]。

1.3.2β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白-C3G溶液的制備

將β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白溶解于10 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）后，將C3G按比例分別溶于上述蛋白溶液中，在室溫避光隔氧的條件下攪拌90 min分別制成β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白的C3G復(fù)合溶液。將未添加C3G的大豆蛋白溶液設(shè)置為空白對(duì)照，編號(hào)為0，添加C3G的溶液按照濃度梯度依次編號(hào)為1～10。

1.3.3 內(nèi)源熒光光譜測(cè)定

按照1.3.2節(jié)的方法制備β-伴大豆球蛋白-C3G、大豆球蛋白-C3G溶液（β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白最終質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL、C3G的最終濃度在0～45 μmol/L之間），置于熒光比色杯中后利用熒光光譜儀分別測(cè)定各樣品的熒光光譜。其中，掃描發(fā)射波長(zhǎng)在290～460 nm之間，激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均設(shè)定為5 nm，掃描速率設(shè)定為1 200 nm/min，電壓設(shè)定為600 V。

1.3.4 同步熒光光譜測(cè)定

按照1.3.3節(jié)方法（溶液的量與濃度均相同）室溫條件下，激發(fā)和發(fā)射的波長(zhǎng)差值分別為Δλ＝15 nm和Δλ＝60 nm，進(jìn)行同步熒光光譜掃描。

1.3.5 三維熒光光譜測(cè)定

按照1.3.2節(jié)方法制備β-伴大豆球蛋白-C3G、大豆球蛋白-C3G溶液（β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白的質(zhì)量濃度均為10 mg/mL、C3G質(zhì)量濃度分別為0、0.10 mg/mL）。在室溫條件下，將樣品稀釋至200 倍后，記錄樣品三維熒光光譜。其中，激發(fā)波長(zhǎng)范圍200～350 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為200～500 nm，波長(zhǎng)間隔均為5 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm，掃描速率為1 200 nm/min，電壓設(shè)定為600 V。

1.3.6 FTIR光譜分析

將1.3.5節(jié)制備的β-伴大豆球蛋白-C3G、大豆球蛋白-C3G樣品冷凍干燥后，將樣品粉末與溴化鉀粉末質(zhì)量比為1∶100的比例混合后利用模具進(jìn)行壓片，在分辨率為1 cm-1的條件下掃描32次，波數(shù)范圍為4 000～400 cm-1條件下掃描紅外光譜。

1.3.7 CD光譜分析

將1.3.5節(jié)制備的β-伴大豆球蛋白-C3G、大豆球蛋白-C3G溶液在遠(yuǎn)紫外區(qū)190～250 nm進(jìn)行掃描，速率為60 nm/min，分辨率為0.2 nm，響應(yīng)時(shí)間為0.25 s，狹縫寬度為1 nm。使用CD Pro軟件對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的組成成分及相對(duì)含量進(jìn)行擬合[17]。

1.3.8 分子對(duì)接

分子對(duì)接在結(jié)果分析前的全部操作均在AutoDockTools-1.5.6軟件中進(jìn)行。β-伴大豆球蛋白（PDB ID：1UIK）/大豆球蛋白（PDB ID：1OD5）的晶體結(jié)構(gòu)取自Protein Data Bank蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，C3G（黑米花青素主要成分）的結(jié)構(gòu)取自PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)。分別利用Autodock對(duì)β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白與C3G進(jìn)行去水與加全氫等預(yù)處理。由于缺乏對(duì)接位點(diǎn)的信息，采用盲對(duì)接的方式，建立可包含整個(gè)蛋白質(zhì)的對(duì)接網(wǎng)格盒子。隨后利用Lamarckian genetic algorithm算法對(duì)接50次，其他參數(shù)采取默認(rèn)值，根據(jù)結(jié)合能大小對(duì)結(jié)果進(jìn)行排序，借助Pymol、Discovery Studio 2019等軟件對(duì)最低能量構(gòu)象進(jìn)一步分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每組數(shù)據(jù)均做平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，利用SPSS 17.0軟件進(jìn)行相關(guān)分析及ANOVA差異顯著性分析，P＜0.05，差異顯著。采用Origin 8.0、CD Pro、Pymol 2.3、Discovery Studio 2019等軟件進(jìn)行圖表制作與CD光譜數(shù)據(jù)分析等操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)源熒光光譜分析

2.1.1 C3G對(duì)β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白內(nèi)源熒光光譜的影響

熒光光譜已成為表征蛋白質(zhì)與多酚相互作用后微環(huán)境變化的主要手段。蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光主要是在280 nm激發(fā)波長(zhǎng)下，由色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）殘基所引起[18]。如圖1所示，C3G的加入使蛋白的內(nèi)源熒光強(qiáng)度降低，降低程度與C3G的添加量呈正相關(guān)，說(shuō)明C3G可以猝滅β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白的內(nèi)源熒光，且具有濃度依賴性。另外，大豆球蛋白的熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)大于β-伴大豆球蛋白，可能是由于大豆球蛋白具有更高含量的Trp和Tyr殘基導(dǎo)致[19]，這與Ren Cong等[14]的研究結(jié)果一致。C3G對(duì)β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白的猝滅效率分別為（62.14±1.06）%和（70.35±1.14）%，即C3G與大豆球蛋白的相互作用更強(qiáng)。

圖1 C3G對(duì)β-伴大豆球蛋白（A）、大豆球蛋白（B）內(nèi)源熒光光譜的影響Fig. 1 Effect of C3G on the intrinsic fluorescence spectra of β-conglycinin (A) and glycinin (B)

2.1.2 猝滅類型、表觀結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

熒光猝滅根據(jù)形成機(jī)理不同可分為動(dòng)態(tài)和靜態(tài)猝滅機(jī)制。其中靜態(tài)猝滅由猝滅劑和熒光團(tuán)形成的復(fù)合物引起，隨著溫度的提高，復(fù)合物的穩(wěn)定性下降，靜態(tài)猝滅常數(shù)降低；而動(dòng)態(tài)猝滅則由二者的碰撞引起，猝滅常數(shù)隨溫度的變化與靜態(tài)猝滅相反[20]。依據(jù)Stern-Volmer方程進(jìn)行計(jì)算，如式（1）所示：

式中：F0、F分別為未加入和加入猝滅劑時(shí)蛋白的熒光強(qiáng)度；Q為猝滅劑的濃度/（mol/L）；Ksv為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)/（L/mol）；Kq為雙分子猝滅速率常數(shù)/（L/（mol·s））；τ0為無(wú)猝滅劑時(shí)熒光體的壽命，蛋白的平均壽命約為10-8s。

圖2 不同溫度下C3G猝滅β-伴大豆球蛋白（A）、大豆球蛋白（B）的Stern-Volmer圖Fig. 2 Stern-Volmer plots for quenching of β-conglycinin (A) and glycinin (B) by C3G at different temperatures

圖2和表1表明，隨著溫度的提高，β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白的Stern-Volmer方程線性斜率逐漸增大，說(shuō)明存在動(dòng)態(tài)猝滅。但C3G對(duì)β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白的熒光猝滅速率（1012L/（mol·s）），遠(yuǎn)大于最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù)（2×1010L/（mol·s）），表明猝滅方式中也存在靜態(tài)猝滅[21]。此類動(dòng)態(tài)與靜態(tài)兼具的猝滅方式在多酚與蛋白質(zhì)的相互作用中較為常見(jiàn)，如在麥醇溶蛋白與C3G[22]、β-酪蛋白與低聚原花青素[20]的研究中均有報(bào)道。

表1 不同溫度下C3G與β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白相互作用的熒光猝滅常數(shù)及其決定系數(shù)Table 1 Fluorescence quenching constants and determination coefficients for C3G binding to β-conglycinin/glycinin at different temperatures

兩者的表觀結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)使用雙對(duì)數(shù)曲線方程計(jì)算，如式（2）所示：

式中：Ks為表觀結(jié)合常數(shù)；n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

如圖3和表2所示，一方面，C3G和β-伴大豆球蛋白之間的Ks值隨著溫度的升高而增加，這表明C3G-β-伴大豆球蛋白的形成是吸熱反應(yīng)，其穩(wěn)定性隨著溫度的升高而增加；而大豆球蛋白則相反，表明升溫不利于復(fù)合物的穩(wěn)定[22]。另一方面，大豆球蛋白較β-伴大豆球蛋白具有更大的Ks值，并大于104數(shù)量級(jí)，說(shuō)明C3G對(duì)大豆球蛋白的結(jié)合親和力強(qiáng)于β-伴大豆球蛋白[23]。此外，2 組復(fù)合物的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n均接近于1，說(shuō)明C3G與2種蛋白均形成了物質(zhì)的量比約為1∶1的靜態(tài)復(fù)合物[24]。

圖3 不同溫度下C3G猝滅β-伴大豆球蛋白（A）、大豆球蛋白結(jié)合（B）的雙對(duì)數(shù)圖Fig. 3 Double logarithmic plots for C3G quenching of β-conglycinin (A) and glycinin (B) at different temperatures

表2 不同溫度下C3G與β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白相互作用的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、表觀結(jié)合常數(shù)及其決定系數(shù)Table 2 Number of binding sites, apparent binding constants and determination coefficients for interaction between C3G and β-conglycinin/glycinin at different temperatures

2.1.3 熱力學(xué)參數(shù)及作用力類型

根據(jù)式（3）～（5）計(jì)算熱力學(xué)參數(shù)：

式中：K為對(duì)應(yīng)溫度下的表觀結(jié)合常數(shù)；R為理想氣體常數(shù)8.314 J/（mol·K）；ΔG為吉布斯自由能/（kJ/mol）；ΔH為焓變/（kJ/mol）；ΔS為熵變/（J/（mol·K））。

利用熱力學(xué)參數(shù)分析蛋白質(zhì)與多酚互作中的主導(dǎo)作用力。當(dāng)ΔH＞0、ΔS＞0時(shí)，為疏水相互作用；當(dāng)ΔH＞0、ΔS＜0時(shí)，靜電相互作用和疏水相互作用為主導(dǎo)；當(dāng)ΔH＜0、ΔS＜0時(shí)，范德華力和氫鍵共同主導(dǎo)；ΔH＜0、ΔS＞0時(shí)，為靜電作用力[25]。如表3所示，C3G與β-伴大豆球蛋白結(jié)合時(shí)，ΔG＜0、ΔH＞0、ΔS＞0，說(shuō)明兩者發(fā)生了吸熱的自發(fā)結(jié)合，且疏水作用力是兩者結(jié)合的主要結(jié)合力。作為在多酚與蛋白質(zhì)互作中最常見(jiàn)的主導(dǎo)作用力，同樣在EGCG與SPI的互作中起穩(wěn)定復(fù)合物構(gòu)象的關(guān)鍵作用[26]；而C3G與大豆球蛋白結(jié)合時(shí)，ΔG＜0、ΔH＜0、ΔS＜0，說(shuō)明二者之間的相互作用是自發(fā)的放熱反應(yīng)，范德華力和氫鍵為兩者結(jié)合的主要結(jié)合力，這與Tang Lin等[27]對(duì)C3G與肌紅蛋白、血清蛋白和血紅蛋白的互作情況所得到的結(jié)果一致。

表3 不同溫度下C3G與β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)Table 3 Thermodynamic parameters for the binding of C3G to β-conglycinin/glycinin at different temperatures

類似的，劉勤勤[28]和Zhou Yucong[9]等分別研究了SPI與茶多酚及SPI與原花青素的相互作用，均發(fā)現(xiàn)氫鍵為兩者結(jié)合的主導(dǎo)作用力；大豆球蛋白作為大豆蛋白的主要成分，當(dāng)與多酚相互作用時(shí)，在大豆蛋白整體上其氫鍵可能占據(jù)了主導(dǎo)作用。而β-伴大豆球蛋白作為含量?jī)H次于大豆球蛋白的大豆蛋白，其分子表面具有許多的疏水性區(qū)域[12]，當(dāng)單獨(dú)與多酚相互作用時(shí)，疏水性區(qū)域可能有利于疏水作用的發(fā)生。這與You Yaohui等[7]對(duì)SPI與EGCG的相互作用研究結(jié)果一致。然而，在結(jié)合過(guò)程中，由于蛋白質(zhì)、配體和溶劑分子之間的各種相互作用和能量交換，很難同時(shí)剖析其貢獻(xiàn)，因此基于熱力學(xué)分析只能確定主導(dǎo)作用力[29]。

盡管如此，應(yīng)當(dāng)指出維持多酚與蛋白質(zhì)相互作用力不只有或僅有唯一作用力，兩者之間的相互作用力受多種因素影響。Yang Yaxuan等[30]發(fā)現(xiàn)EGCG與β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)為ΔH＜0、ΔS＞0，即靜電作用力為主要結(jié)合力；Lan Tian等[31]通過(guò)溶劑組合發(fā)現(xiàn)了大豆蛋白肽與EGCG主要通過(guò)3種相互作用力穩(wěn)定，疏水相互作用最為重要，其次是氫鍵，最后是二硫鍵；陳爽等[32]在VD3與SPI互作研究中發(fā)現(xiàn)SPI-VD3復(fù)合物的穩(wěn)定性主要由靜電作用力與疏水作用力共同維持。以上研究結(jié)果說(shuō)明這可能是由不同的配體結(jié)構(gòu)導(dǎo)致配體分子疏水/親水性質(zhì)的差異以及配體與蛋白質(zhì)氨基酸殘基間的相互作用差異所導(dǎo)致[33]。因此，大豆蛋白與多酚的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，未來(lái)應(yīng)結(jié)合多種分析技術(shù)進(jìn)一步詳細(xì)分析兩者之間的相互作用。

2.2 同步熒光光譜分析

圖4 C3G與β-伴大豆球蛋白（A、B）、大豆球蛋白（C、D）結(jié)合的同步熒光光譜Fig. 4 Synchronous fluorescence spectra of C3G binding to β-conglycinin (A, B) and glycinin (C, D)

同步熒光已選擇性地應(yīng)用于研究蛋白質(zhì)的構(gòu)象，特別是熒光團(tuán)微環(huán)境的變化。同步熒光光譜最大吸收峰所對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)的偏移可以反映蛋白氨基酸殘基所在微環(huán)境極性的變化。當(dāng)波長(zhǎng)間隔為Δλ＝15 nm和Δλ＝60 nm時(shí)，分別表示Tyr殘基和Trp殘基的特征熒光信息[14]。如圖4所示，Trp殘基的熒光強(qiáng)度明顯大于Tyr殘基，表明Trp殘基是蛋白熒光的主要貢獻(xiàn)者。隨著C3G濃度的增加，Trp殘基的熒光猝滅程度遠(yuǎn)強(qiáng)于Tyr殘基，這可能表明Trp殘基比Tyr殘基對(duì)蛋白質(zhì)熒光的猝滅貢獻(xiàn)更大[34]。對(duì)于Tyr殘基，β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白的最大吸收波長(zhǎng)變化均不明顯，表明C3G對(duì)大豆蛋白的Tyr殘基微環(huán)境的影響較小。對(duì)于Trp殘基，大豆球蛋白最大吸收波長(zhǎng)變化不明顯，而β-伴大豆球蛋白的最大吸收波長(zhǎng)產(chǎn)生輕微的紅移；這暗示C3G可能誘導(dǎo)β-伴大豆球蛋白的Trp殘基微環(huán)境向親水環(huán)境轉(zhuǎn)變，且與Tyr殘基相比，結(jié)合位點(diǎn)可能更靠近Trp殘基[7]。而對(duì)大豆球蛋白Trp殘基微環(huán)境無(wú)明顯影響。類似的，Cheng Jing等[35]實(shí)驗(yàn)觀察到C3G使β-乳球蛋白的Tyr殘基的最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生輕微紅移，而Trp殘基無(wú)明顯變化。這表明Tyr殘基周圍親水性增強(qiáng)，而Trp殘基微環(huán)境無(wú)顯著改變；并推測(cè)C3G結(jié)合位點(diǎn)可能更靠近Tyr殘基。

2.3 三維熒光光譜分析

圖5 C3G與β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白結(jié)合的三維熒光光譜Fig. 5 Three-dimensional fluorescence spectra of C3G binding to β-conglycinin/glycinin

如圖5所示，峰1（λEm＝340 nm，λEx＝280 nm）、峰2（λEm＝350 nm，λEx＝230 nm）、峰a（λEm＝λEx）和峰b（λEm＝2λEx）分別對(duì)應(yīng)于Trp和Tyr殘基的熒光特征峰、多肽鏈骨架結(jié)構(gòu)的特征峰、瑞利散射和拉曼散射的特征峰[36]。β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白的拉曼散射峰都有所降低，表明C3G-大豆蛋白復(fù)合物的形成并降低了光散射作用[37]；C3G的添加猝滅了β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白峰1的熒光強(qiáng)度，表明大豆蛋白部分Trp、Tyr殘基與C3G發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用[8]。此外，峰2的熒光強(qiáng)度也有所降低，這表明β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白多肽鏈的展開(kāi)和解折疊[38]。上述現(xiàn)象與Jiang Lianzhou等[15]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，即表明C3G誘導(dǎo)大豆蛋白多肽鏈發(fā)生解折疊，并表示由于蛋白質(zhì)部分或完全的展開(kāi)，促使部分Trp等殘基暴露于親水性環(huán)境中，進(jìn)而表現(xiàn)出熒光強(qiáng)度的降低。

2.4 FTIR光譜分析

圖6 C3G與β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白結(jié)合的FTIR光譜Fig. 6 FTIR spectra of C3G binding to β-conglycinin/glycinin

利用FTIR光譜研究C3G與β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白分子間的相互作用及二級(jí)結(jié)構(gòu)變化，其中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化情況主要由酰胺I帶（反映C＝O伸縮振動(dòng)）、II帶（反映C—N伸縮振動(dòng)與N—H彎曲振動(dòng)）吸收峰的變化反映[21]。如圖6所示，C3G的加入使β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白的酰胺A帶（反映N—H的伸縮振動(dòng)）、酰胺I帶和酰胺II帶的峰值下降及峰位均發(fā)生紅移或藍(lán)移；這意味著氫鍵和疏水相互作用參與C3G與β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白結(jié)合的過(guò)程[39]，并可能引起了蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[30]。該現(xiàn)象可能是由于C3G的羥基和大豆蛋白中—OH或C＝O氫鍵供體/受體基團(tuán)之間發(fā)生非共價(jià)作用[40]。此外，大豆蛋白還可以與C3G中的芳香環(huán)之間形成疏水相互作用。因此，大豆蛋白和C3G之間的氫鍵與疏水相互作用，可能被認(rèn)為是促進(jìn)兩者結(jié)合的主要作用力；并進(jìn)一步影響了蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[22]。Chen Zhongqin等[21]指出，C3G可能與蛋白質(zhì)的疏水腔結(jié)合，導(dǎo)致多肽鏈中氫鍵網(wǎng)絡(luò)的重新排列和相關(guān)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。

2.5 CD光譜分析

圖7 β-伴大豆球蛋白-C3G（A）與大豆球蛋白-C3G（B）復(fù)合物的CD光譜Fig. 7 CD spectra of β-conglycinin-C3G (A) and glycinin-C3G (B)complexes

如圖7和表4所示，C3G的加入使大豆蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生微小變化，即α-螺旋相對(duì)含量降低，β-折疊相對(duì)含量提高；而β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量則無(wú)明顯變化。這暗示C3G可能結(jié)合到大豆蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)的疏水區(qū)域，誘導(dǎo)其向β-折疊轉(zhuǎn)變，使肽鏈輕微解折疊[41]。朱穎等[17]通過(guò)CD光譜發(fā)現(xiàn)，黑米花青素誘導(dǎo)SPI中α-螺旋部分轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊，即黑米花青素對(duì)SPI和具體組分二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量的影響結(jié)果一致。這可能由于C3G結(jié)合至蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域中，并誘導(dǎo)多肽鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)單元間氫鍵發(fā)生重排，導(dǎo)致α-螺旋含量的下降及β-折疊含量的上升，從而產(chǎn)生了更穩(wěn)定的構(gòu)象[21,42]。穩(wěn)定的構(gòu)象可能會(huì)對(duì)C3G的穩(wěn)態(tài)化起到良好作用，正如Attaribo等[43]和Chen Zhongqin等[21]的研究結(jié)果表明：與C3G混合后，蛋白質(zhì)α-螺旋含量降低和β-折疊含量增加可以提高C3G的穩(wěn)定性。因此，β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白可能有望成為保護(hù)、遞送C3G的優(yōu)良載體。

表4 β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量變化Table 4 Changes in relative contents of secondary structures in β-conglycinin/glycinin

2.6 分子對(duì)接分析

表5 C3G-β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白互作能量細(xì)則Table 5 Energy requirements associated with interaction between C3G and β-conglycinin/glycinin

選取黑米花青素中含量最高的C3G為模型多酚，進(jìn)行分子對(duì)接。隨后從50種對(duì)接結(jié)果中選出結(jié)合能前5的對(duì)接姿態(tài)進(jìn)行展示（表5），并遵循最小能量原則選出最優(yōu)結(jié)果（圖8），進(jìn)行對(duì)接細(xì)節(jié)分析。從Autodock對(duì)接結(jié)果中可以提取出結(jié)合能（ΔG）、分子間作用力能量（Eintermol）、范德華力能量+氫鍵能量+疏水作用力能量總和（Evhd）、靜電相互作用能量（Eelec），其中Eintermol＝Evhd+Eelec。從結(jié)合能而言，ΔG的數(shù)值表明C3G均自發(fā)與兩種蛋白結(jié)合，且與大豆球蛋白的結(jié)合程度更大，在大豆球蛋白-C3G體系中表明該復(fù)合物更穩(wěn)定[44]。該結(jié)果表明，與β-伴大豆球蛋白相比，大豆球蛋白-C3G體系的組合降低了生物體內(nèi)小分子的利用度。小分子的生理活性及其在體內(nèi)的功能與載體蛋白的親和力有關(guān)，因此推測(cè)大豆球蛋白對(duì)C3G的運(yùn)輸能力可能要比β-伴大豆球蛋白強(qiáng)。在Wu Di等[12]研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象：與大豆球蛋白相比，β-伴大豆球蛋白對(duì)金絲桃苷具有更好的遞送性能。此外，在所有分子間作用力中以Evhd為主，表明范德華力、氫鍵和疏水作用力是兩者結(jié)合過(guò)程中的主要作用力；靜電作用力數(shù)值極小，表明其不是主要作用力，但對(duì)維持構(gòu)象穩(wěn)定有一定的貢獻(xiàn)[27]。

圖8 C3G-β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白互作3D、局部、2D圖Fig. 8 Three-dimensional and two-dimensional illustration of interaction between C3G and β-conglycinin/glycinin

圖8B和C表明β-伴大豆球蛋白共有7個(gè)氨基酸殘基參與了C3G的結(jié)合。其中疏水性氨基酸Asp-934、Ile-921、Lys-951和Arg-933的疏水部分與C3G距離較近，形成4個(gè)疏水相互作用，從而減少了水的介入，有助于C3G與β-伴大豆球蛋白形成穩(wěn)定的復(fù)合物；Arg-918、Asp-934、Thr-948、Glu-950、Lys-951與C3G共形成10個(gè)氫鍵。與疏水相互作用類似，這些氫鍵也加強(qiáng)了非共價(jià)作用的強(qiáng)度，使二者結(jié)合更加穩(wěn)固；此外，C3G中的二羥基苯環(huán)與Lys-951帶正電的氨基形成π-陽(yáng)離子作用力。

圖8E和F顯示大豆球蛋白共有6個(gè)氨基酸殘基參與了C3G的結(jié)合。其中Arg-522、Val-523和Glu-533參與形成疏水相互作用；Arg-522、Val-523、Asp-531、Glu-533、Thr-537、Gly-542參與形成氫鍵，C3G的二羥基苯環(huán)與Arg-522具有正電性的胍基形成π-陽(yáng)離子作用力。因此，在C3G與β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白分子對(duì)接過(guò)程中，疏水作用力起重要作用。并且，由于C3G是一種被廣泛認(rèn)同的良好氫供體，其與蛋白質(zhì)基團(tuán)形成的氫鍵對(duì)維持復(fù)合物穩(wěn)定性也起決定性作用。此外，還兼具π-陽(yáng)離子結(jié)合力的作用。不僅如此，大豆蛋白與C3G的芳香環(huán)結(jié)合，大部分酚羥基參與成鍵；因此β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白可能對(duì)C3G形成保護(hù)，進(jìn)而提升C3G的穩(wěn)定性[45]。玉米醇溶蛋白以相似的模式與EGCG結(jié)合，其已被證實(shí)可成為有效的茶多酚遞送系統(tǒng)[46]。然而，由于C3G的B環(huán)上酚羥基全部參與成鍵，因此在一定程度上導(dǎo)致其抗氧化能力下降，這可能與蛋白質(zhì)的屏蔽作用有關(guān)[47]。

3 結(jié) 論

通過(guò)多重光譜技術(shù)及分子對(duì)接等手段研究了β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白與C3G的相互作用，主要結(jié)論如下：1）C3G可以通過(guò)靜態(tài)和動(dòng)態(tài)兼具的猝滅方式猝滅的大豆蛋白內(nèi)源熒光。C3G主要通過(guò)范德華力、氫鍵或疏水作用分別與β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白形成復(fù)合物；2）C3G可以結(jié)合至大豆蛋白的疏水空腔中，依靠多種作用力共同維持復(fù)合物的穩(wěn)定性；C3G誘導(dǎo)部分蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)α-螺旋向β-折疊轉(zhuǎn)變，多肽鏈發(fā)生解折疊。此外，還引起了β-伴大豆球蛋白的Try殘基微環(huán)境的變化；3）C3G與大豆球蛋白的親和力強(qiáng)于β-伴大豆球蛋白。C3G與大豆蛋白的結(jié)合可能有利于C3G的遞送，但一定程度上減弱C3G的利用度和生理活性。