李欣然，康靖杰，夏林波，朱思晗，賈天柱，劉 蓮，陳曉霞

(1 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 大連 116600；2 北京斯丹姆賽爾生物技術(shù)有限責(zé)任公司，遼寧 沈陽(yáng) 110000)

白鮮為蕓香科(Rutaceae)白鮮屬多年生草本植物白鮮的根皮。我國(guó)有白鮮屬植物 2種，即白鮮(Dictamnusdasycarpus)產(chǎn)于東北(黑龍江、吉林、遼寧)、華北(內(nèi)蒙古、河北)、西北(陜西、甘肅)、東南(山東、江蘇、江西、安徽、)和華中(湖南、湖北)等地區(qū)；狹葉白鮮(Dictamnusangustifolius)產(chǎn)于新疆[1]。有羊膻氣、味微苦、咸，性寒，歸脾、胃、膀胱經(jīng)，主要含有生物堿、檸檬苦素、倍半萜及其苷、黃酮、香豆素、揮發(fā)油類(lèi)等化學(xué)成分[2]，其中2020版《中國(guó)藥典》以黃柏酮及梣酮為其指標(biāo)性成分進(jìn)行質(zhì)量控制[3]?！端幮哉摗分杏涊d治一切熱毒風(fēng)、惡風(fēng)、風(fēng)瘡、疥癬赤爛、眉發(fā)脫脆、皮肌急、壯熱惡寒。進(jìn)入21世紀(jì)后，白鮮皮獨(dú)特的療效和特殊用途被逐漸開(kāi)發(fā)利用，市場(chǎng)需求較上世紀(jì)增長(zhǎng)10多倍[4]，導(dǎo)致野生資源大量減少，人工大面積栽培迫切需要。中藥的道地性為人工栽培白鮮皮藥效的保證提供依據(jù)，遼寧產(chǎn)白鮮皮被公認(rèn)為質(zhì)量較好，但是目前沒(méi)有數(shù)據(jù)支持。本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同來(lái)源遼寧產(chǎn)白鮮皮與省外白鮮皮中三種主要成分白鮮堿、黃柏酮、梣酮含量及出膏率進(jìn)行測(cè)定，采用綜合加權(quán)評(píng)分法對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行評(píng)分，結(jié)果顯示遼寧產(chǎn)白鮮皮總體評(píng)分平均分較省外評(píng)分高，具有顯著性差異，尤其是其中白鮮堿含量顯著高于省外地區(qū)。這為遼寧產(chǎn)白鮮皮質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)遼寧產(chǎn)白鮮皮應(yīng)用提供研究方向。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與材料

Agilent 1290高效液相色譜儀(含四元低壓梯度泵及DAD檢測(cè)器)，美國(guó)安捷倫科技有限公司；AUW 220D十萬(wàn)分之一電子天平，日本島津有限公司；HH-M4電熱恒溫水浴鍋，上海赫田科學(xué)儀器有限公司；KQ5200DE超聲清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司；DFT-300小型粉碎機(jī)，溫州頂力醫(yī)療器械有限公司；101-2A電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津泰斯特儀器有限公司。

白鮮堿對(duì)照品(YJ0102),江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司；黃柏酮(111923-20160)及梣酮(111700-201603)對(duì)照品，中國(guó)食品藥品鑒定研究院；19批次白鮮皮藥材信息詳見(jiàn)表2，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室尹海波教授鑒定為蕓香科(Rutaceae)白鮮屬植物白鮮的根；純凈水；色譜純甲醇，天津科密歐；分析純甲醇，國(guó)藥集團(tuán)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱:Agilent HC-C18色譜柱(4.6 mm×5 μm×250 mm)；流動(dòng)相：甲醇-45%水；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：236 nm; 理論塔板數(shù)以梣酮計(jì)算應(yīng)不少于3000。

1.2.2 供試品溶液制備

取各產(chǎn)地白鮮皮藥材粗粉(過(guò)四號(hào)篩)1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

1.2.3 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取白鮮堿，黃柏酮和梣酮對(duì)照品9.30 mg、10.15 mg、10.66 mg，加甲醇分別定容，配制成0.3720 mg·mL-1、1.015 mg·mL-1、1.066 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，低溫、避光保存。分別取各對(duì)照品儲(chǔ)備液不同體積配置成分別含白鮮堿，黃柏酮和梣酮111.6, 507.5, 213.2 μg·mL-1混合標(biāo)準(zhǔn)品，依次按照2、4、10、20、40、100倍進(jìn)行稀釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件選擇

本實(shí)驗(yàn)對(duì)不用的色譜條件進(jìn)行了選擇，最終確定以Agilent HC-C18色譜柱，甲醇-45%水為流動(dòng)相，在1.0 mL·min-1流速及40 ℃柱溫條件下，236 nm波長(zhǎng)處測(cè)得的三個(gè)主要化學(xué)在混合對(duì)照品及樣品中得到較好的分離(見(jiàn)圖1)，可以用于樣品測(cè)定。

圖1 HPLC色譜分離圖

2.2 線性關(guān)系

將配置好的系列對(duì)照品溶液，按“2.1”下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積(y)為縱坐標(biāo)，濃度(x)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 三種成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍

2.3 精密度測(cè)驗(yàn)

精密吸取同一白鮮皮供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，分別以白鮮堿、黃柏酮、梣酮含量的RSD值為1.94%、1.98%、1.57%，表明儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一白鮮皮的供試品溶液，分別在制備0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果各主要色譜峰相對(duì)峰面積的RSD值為1.83%、1.99%、1.66%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批白鮮皮供試品6份,按照供試品方法制備樣品進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果各主要色譜峰相對(duì)峰面積的RSD值為1.43%、1.36%、1.03%，表明方法重復(fù)性良好。

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的6份白鮮皮樣品粉末各0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加入一定量的對(duì)照品物質(zhì)，按照“1.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液。進(jìn)行測(cè)定測(cè)定各成分的含量，計(jì)算白鮮堿、黃柏酮、梣酮平均加樣回收率為在95.5%～96.2%之間，RSD均小于2.2%，表明方法的準(zhǔn)確度良好。

2.7 樣品含量測(cè)定

取收集的19種不同產(chǎn)地的白鮮皮，按“1.2.2”項(xiàng)制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下分別進(jìn)行含量測(cè)定。

2.8 出膏率測(cè)定

稱取不同產(chǎn)地白鮮皮5 g，分別加入12倍量的水，煎煮1 h后再加入10倍量的水，煎煮1 h，趁熱抽濾，蒸干，烘成浸膏備用，出膏率如表2所示。

2.9 樣品質(zhì)量評(píng)價(jià)

中藥成分負(fù)復(fù)雜，往往不能以單一成分來(lái)評(píng)價(jià)其質(zhì)量好壞。綜合評(píng)分法是通過(guò)打分來(lái)對(duì)根據(jù)品質(zhì)劃分等級(jí)的項(xiàng)目進(jìn)行量化處理，是對(duì)評(píng)價(jià)的不同等級(jí)賦予不同的分值，并以此為基礎(chǔ)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，被廣泛引用在中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)中。本實(shí)驗(yàn)分別采用層次分析(AHP)、CRITIC 及AHP-CRITIC混合加權(quán)法來(lái)確定權(quán)重系數(shù)。

(1)層次分析(AHP)法確定權(quán)重系數(shù) AHP法是基于主觀賦值權(quán)重的一種方法[5]。查閱文獻(xiàn)中對(duì)白鮮皮中主要三個(gè)有效成分的藥理作用及藥典規(guī)定指標(biāo)，對(duì)白鮮堿、黃柏桐和梣酮的含量、出膏率作為權(quán)重指標(biāo)予以量化。將4個(gè)指標(biāo)分為4個(gè)層次，確定4項(xiàng)指標(biāo)的優(yōu)先順序?yàn)椋狐S柏桐=梣酮>白鮮堿>出膏率。黃柏桐及梣酮含量為2020版《中國(guó)藥典》規(guī)定白鮮皮中檢測(cè)的兩個(gè)指標(biāo)，因此認(rèn)為其同樣重要。但較白鮮堿含量而言比較重要賦值5；較出膏率而言十分重要，賦值6；白鮮堿含量較出膏率而言比較重要，賦值4。進(jìn)行權(quán)重系數(shù)計(jì)算分別為0.12、0.41、0.41、0.06.

(2)指標(biāo)重復(fù)性相關(guān)法(CRITIC)確定權(quán)重系數(shù) 主觀賦權(quán)不能有效全面地體現(xiàn)各指標(biāo)中成分對(duì)藥材質(zhì)量的影響，而CRITIC法以評(píng)價(jià)指標(biāo)間的對(duì)比強(qiáng)度及沖突性作為基礎(chǔ)，通過(guò)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差將對(duì)比強(qiáng)度體現(xiàn)出來(lái)，是一種能客觀反映各評(píng)價(jià)指標(biāo)權(quán)重的計(jì)算方法[6]，故考察采用CRITIC法確定各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)。將19批不同產(chǎn)地樣品中白鮮堿、黃柏桐、梣酮含量及出膏率輸入spssau軟件中，計(jì)算其各自權(quán)重系數(shù)為0.18,0.49,0.32,0.01。

(3)AHP-CRITIC混合加權(quán)法確定權(quán)重系數(shù) AHP法依據(jù)中藥主要成分與有效成分概念，賦予主要有效成分黃柏桐、梣酮最大的權(quán)重系數(shù)，次要有效成分白鮮堿權(quán)重系數(shù)次之，出膏率權(quán)重系數(shù)最小。CRITIC法計(jì)算結(jié)果顯示，黃柏桐、梣酮的權(quán)重系數(shù)相差較大，雖然客觀真實(shí)，但不能反映中藥中多種主要有效成分起作用的意義。AHP-CRITIC混合加權(quán)法兼具兩者優(yōu)點(diǎn)，能全面體現(xiàn)樣本的數(shù)據(jù)信息，故決定采用AHP-CRITIC混合加權(quán)法確定指標(biāo)權(quán)重系數(shù)，即:ω綜和ij=ωAHPijωCRITICij/∑ωAHPijωCRITICij。(ωAHPij表示AHP法計(jì)算的權(quán)重系數(shù)，ωCRITICij表示CRITIC法計(jì)算的權(quán)重系數(shù)，i表示第i個(gè)因素，j表示第j個(gè)樣本)。根據(jù)AHP-CRITIC混合加權(quán)法計(jì)算得白鮮堿、黃柏桐、梣酮及出膏率權(quán)重系數(shù)分別為0.06、0.57、0.36、0.02。

(4)3種賦權(quán)法的綜合評(píng)分結(jié)果比較 分別用 3種賦權(quán)法得到的權(quán)重系數(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合評(píng)分，結(jié)果見(jiàn)表2。通過(guò)SPSS 16.0軟件對(duì)3種賦權(quán)法得到的綜合評(píng)分進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果AHP法與CRITIC法得到的綜合評(píng)分之間的相關(guān)系數(shù)為0.982，AHP法與AHP-CRITIC混合加權(quán)法得到的綜合評(píng)分之間的相關(guān)系數(shù)為0.969，CRITIC法與AHP-CRITIC混合加權(quán)法得到的綜合評(píng)分之間的相關(guān)系數(shù)為0.981，三者間的相關(guān)性均顯著(P<0.05)，說(shuō)明這3種賦權(quán)法得到的評(píng)分結(jié)果具有一致性。相較之下，AHP-CRITIC混合加權(quán)法結(jié)合了AHP法與CRITIC法兩種方法的優(yōu)勢(shì)，能從主、客觀兩方面體現(xiàn)提取藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)的實(shí)際情況。

表2 19種不同產(chǎn)地的白鮮皮指標(biāo)性成分含量測(cè)定及評(píng)分結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)AHP-CRITIC混合加權(quán)法對(duì)19批藥材綜合評(píng)分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)12批遼寧產(chǎn)地藥材，包括直接購(gòu)買(mǎi)3批，野生采挖3批及種植基地人工栽培6批，除S5及S8外均評(píng)分高于50。另外，我們對(duì)遼寧產(chǎn)的12批藥材與遼寧外的其他省外7批綜合評(píng)分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，發(fā)現(xiàn)二者平均值分別為57.33及41.70，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.02)。由此可見(jiàn)遼寧產(chǎn)地白鮮皮質(zhì)量較高。但遼寧產(chǎn)的S8樣品為人工栽培三年生品種，其梣酮含量不符合2020版中國(guó)藥典不得少于0.05%的規(guī)定，可能是由于其生長(zhǎng)年限不夠，S5為野生品種采挖，其評(píng)分低可能也是生長(zhǎng)周期不夠長(zhǎng)。另外五個(gè)栽培品生長(zhǎng)期高于四年均能滿足《中國(guó)藥典》要求，由此我們推斷遼寧栽培白鮮皮生長(zhǎng)年限至少要達(dá)到四年才能采挖。另對(duì)不同產(chǎn)地白鮮皮中三種主要化學(xué)成分直觀分析(見(jiàn)圖2)，發(fā)現(xiàn)遼寧產(chǎn)白鮮皮中白鮮堿的含量明顯高于省外產(chǎn)地，黃柏酮和梣酮沒(méi)有明顯規(guī)律。白鮮堿雖然沒(méi)有被納入《中國(guó)藥典》檢測(cè)范圍中，但由于白鮮堿對(duì)某些腫瘤細(xì)胞有著抑制細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用[7]，因此一直是研究熱點(diǎn)。由此推測(cè)遼寧產(chǎn)白鮮皮可值得更進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)。

圖2 19種產(chǎn)地白鮮皮中三種主要化學(xué)成分含量比較

3 結(jié) 論

隨著白鮮皮藥用價(jià)值的不斷開(kāi)發(fā)及野生資源的枯竭，人工栽培白鮮皮受到了重視。近年來(lái)市場(chǎng)上陸續(xù)出現(xiàn)了種植品。中草藥的栽培質(zhì)量受到很多因素影響，其中栽培地的選擇應(yīng)盡量遵循“道地”原則。本實(shí)驗(yàn)對(duì)遼寧產(chǎn)的白鮮皮與省外產(chǎn)白鮮皮進(jìn)行了評(píng)分分析，遼寧產(chǎn)白鮮皮平均值高，且人工栽培品與市售和野生產(chǎn)品三個(gè)主要成分及出膏率未見(jiàn)顯著差異。從目前收集樣本分析可見(jiàn)遼寧產(chǎn)白鮮皮中白鮮堿含量普遍較高，有可能為遼寧產(chǎn)白鮮皮種植及引用開(kāi)發(fā)提供可靠支持。但是本實(shí)驗(yàn)收集的樣本數(shù)量還存在不足，遼寧產(chǎn)地白鮮覆蓋地域較窄，省外樣品數(shù)目較少，有待于收集更多的樣本采用HPLC-MS/MS對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行更全面分析。