王勃， 陳瑞花， 王昆， 李志強， 魏琴， 姜濤, 張春**

(1.新疆醫(yī)科大學(xué) 動物實驗中心， 新疆 烏魯木齊 830011； 2.新疆醫(yī)科大學(xué) 新疆醫(yī)學(xué)動物模型研究重點實驗室， 新疆 烏魯木齊 830011)

細(xì)粒棘球蚴病是一種因感染細(xì)粒棘球蚴絳蟲蟲卵所致的慢性人獸共患寄生性傳染病，可對人的肝臟、肺以及其他器官造成嚴(yán)重傷害[1]。細(xì)粒棘球蚴蟲隨血液循環(huán)遷移至中間宿主的肝、肺和其他臟器中，出現(xiàn)原發(fā)囊性病變，其中在肝臟中最為常見[2]。細(xì)粒棘球蚴蟲早期定植引起機體急性炎癥反應(yīng)而被清除，殘留的幼蟲待包囊形成，產(chǎn)生代謝產(chǎn)物[3]，影響免疫細(xì)胞和細(xì)胞趨化因子功能，可逃避宿主的免疫反應(yīng)[4]。G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)是最大的受體超家族，位于細(xì)胞膜表面，參與介導(dǎo)生物過程與多種疾病[5]。G蛋白偶聯(lián)受體97(G protien-coupled recepter 97，GPR97)具有經(jīng)典的黏附GPCR結(jié)構(gòu)，具有7個跨膜螺旋、1個N端片段和1個C端片段，通過與下游G蛋白相互作用，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[6-7]。在免疫細(xì)胞中，GPR97在白細(xì)胞中表達(dá)，如中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞[8]，GPR97有可能與炎癥相關(guān)，但GPR97對免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用及機制仍然不清楚。GPR97基因敲除的腎臟保護(hù)作用是通過腦信號蛋白3A(semaphorin 3A，Sema3A)信號通路進(jìn)行的，同時在體外基因沉默GPR97可減輕低氧細(xì)胞模型引起的腎小管上皮的凋亡和促炎因子的產(chǎn)生，加入Sema3A重組蛋白可逆轉(zhuǎn)這一作用，而GPR97對Sema3A的表達(dá)調(diào)控是通過人抗原R(human antigen R，HuR)蛋白進(jìn)行的。HuR蛋白在肝臟多種疾病中均扮演著重要的角色[9]，如在肝炎中，HuR可以促進(jìn)炎癥介質(zhì)表達(dá)[10]、還可調(diào)控巨噬細(xì)胞的活性[11]。目前，關(guān)于GPR97、Sema3A和HuR蛋白在細(xì)粒棘球蚴感染小鼠肝臟中的表達(dá)情況還未見報道。因此，本研究通過建立細(xì)粒棘球蚴感染小鼠模型，采用免疫組織化學(xué)法觀察GPR97、Sema3A和HuR蛋白在細(xì)粒棘球蚴感染小鼠肝臟中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步闡述這3種蛋白與細(xì)粒棘球蚴病的相互作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物及細(xì)粒棘球蚴原頭蚴 選擇6～8周齡雌性C57BL/6小鼠12只，飼養(yǎng)在新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心屏障系統(tǒng)環(huán)境[SYXK(新)2018-0002]。購買當(dāng)?shù)赝涝讏龈腥炯?xì)粒棘球蚴病的羊肝臟，抽取病灶組織囊液，收集原頭蚴。

1.1.2主要試劑與儀器 兔抗GPR97、Sema3A、HuR多克隆抗體(Affinity公司，美國)，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體、DAB顯色試劑盒、蘇木精和伊紅染液、天狼星紅染液、磷酸鹽緩沖液PBS(北京索萊寶科技有限公司)。試驗儀器主要有石蠟切片機(Leika公司，德國)和生物顯微鏡(Motic實業(yè)有限公司，廈門)等。

1.2 研究方法

1.2.1建立細(xì)粒棘球蚴感染肝臟模型 檢測原頭蚴活力并計數(shù)，通過小鼠肝門靜脈注射細(xì)粒棘球蚴500個，建立細(xì)粒棘球蚴感染小鼠肝臟模型。

1.2.2采集、處理肝臟標(biāo)本 感染細(xì)粒棘球蚴2周和8周的小鼠經(jīng)二氧化碳安樂處死，采集肝臟組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定后，經(jīng)梯度乙醇脫水、石蠟包埋，制備肝臟石蠟切片。

1.2.3蘇木精-伊紅染色法 (hematoxylin-eosin staining，HE)和天狼星紅染色 肝臟石蠟切片置于60 ℃恒溫箱中烘烤30 min后，經(jīng)脫蠟、二甲苯、梯度乙醇復(fù)水，用于進(jìn)行蘇木素-伊紅染色和苦味酸-天狼星紅染色，再梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察肝組織病理變化。

1.2.4免疫組織化學(xué)染色 經(jīng)梯度乙醇復(fù)水后的肝臟石蠟切片，依次進(jìn)行檸檬酸鹽溶液微波中火加熱15 min，3%過氧化氫處理15 min，加封閉液室溫孵育1 h，PBS洗3次；加GPR97、Sema3A、HuR一抗4 ℃孵育過夜，PBS洗3次，加二抗室溫孵育2 h，PBS洗3次，加DAB顯色，顯微鏡下觀察，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水后，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察GPR97、Sema3A、HuR蛋白表達(dá)情況，每個樣本隨機選取5張切片，每張片子隨機選取不重疊的5個包囊放大視野(200×)，在Motic生物顯微鏡下拍照、記錄，進(jìn)行蛋白表達(dá)染色評分。染色評分由染色強度與程度的乘積確定，染色強度按照不著色為陰性(0分)、著淺黃色為弱陽性(1分)、著中黃色或著棕色且無背景著色或者著深棕色但有淺棕色背景為中等陽性(2分)、細(xì)胞著深棕色或棕褐色且無背景著色為強陽性(3分)，染色程度陽性細(xì)胞的頻率<5%為0分(-)、5%～25%為1分(+)、26%～50為2分(++)、51%～75%為3分(+++)、>75%為4分，包囊相關(guān)陽性細(xì)胞的頻率為占包囊的整體細(xì)胞。綜合評分分為0～1分為陰性(-)、2～4分為弱陽性(+)、5～8分為中度陽性(++)、9～12分為強陽性(+++)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 肝組織細(xì)胞學(xué)

HE染色和苦味酸-天狼星紅結(jié)果顯示，細(xì)粒棘球蚴感染第2周時小鼠的肝組織結(jié)構(gòu)完整、肝索排列整齊，偶見纖維細(xì)胞大量增生、肉芽腫形成，炎性細(xì)胞增多，將炎癥組織放大觀察可見纖維化包囊逐漸成型；感染第8周時小鼠肝組織結(jié)構(gòu)不完整，肝索排列紊亂，部分肝細(xì)胞被破壞、有炎性病灶，包囊出現(xiàn)空泡化，外囊外膜層纖維化組織增生且致密。見圖1、圖2。

注：A、C為第2周肝組織，B、D為第8周肝組織。圖1 細(xì)粒棘球蚴感染小鼠肝組織感染第2周和第8周時小鼠肝組織HE染色結(jié)果Fig.1 HE staining of liver tissues in mice with echinococcus granulosus infection in 2nd and 8th week

注：A、C為第2周肝組織，B、D為第8周肝組織。圖2 細(xì)粒棘球蚴感染小鼠肝組織第2周和第8周時苦味酸-天狼星紅染色結(jié)果Fig.2 Picric acid-Sirius red staining of liver tissues in mice with echinococcus granulosus infection in 2nd and 8th week

2.2 肝組織GPR97蛋白表達(dá)

GPR97蛋白免疫組化染色結(jié)果顯示，第2周時，小鼠肝組織初步形成的包囊內(nèi)部分呈黃褐色陽性著色，肝細(xì)胞胞質(zhì)有不同程度的黃色著色；第8周時，包囊空泡化后生發(fā)層細(xì)胞呈黃褐色陽性著色，外囊層無陽性表達(dá)；與感染第2周時比較，感染第8周時細(xì)粒棘球蚴感染小鼠肝內(nèi)囊生發(fā)層細(xì)胞、外囊外膜層細(xì)胞、周圍肝組織細(xì)胞的GPR97蛋白表達(dá)免疫評分均升高(P<0.05)。見圖3。

2.3 肝組織HuR蛋白表達(dá)

HuR蛋白免疫組化染色結(jié)果顯示，第2周時，小鼠肝組織形成的包囊內(nèi)基本無陽性表達(dá)，偶見褐色陽性著色，肝胞質(zhì)呈黃色陽性；第8周時，包囊空泡化后生發(fā)層細(xì)胞呈黃色或黃褐色陽性著色，外膜層無陽性表達(dá)，周邊肝細(xì)胞胞質(zhì)為黃色陽性；與感染第2周時比較，感染第8周時細(xì)粒棘球蚴感染小鼠肝內(nèi)囊生發(fā)層細(xì)胞、外囊外膜層細(xì)胞、周圍肝組織細(xì)胞的HuR蛋白表達(dá)免疫評分均升高(P<0.05)。見圖4。

注：A、C為第2周肝組織GPR97蛋白免疫組化，B、D為第8周肝組織GPR97蛋白免疫組化。(1)與感染肝臟第2周時比較，P<0.05。圖3 細(xì)粒棘球蚴感染小鼠肝組織的GPR97蛋白表達(dá)Fig.3 Expression of GPR97 protein in liver tissues of mice with echinococcus granulosus infection

注：A、C為第2周肝組織HuR蛋白免疫組化，B、D為第8周肝組織HuR蛋白免疫組化。(1)與感染肝臟第2周時比較，P<0.05。圖4 細(xì)粒棘球蚴感染小鼠肝組織的HuR蛋白表達(dá)Fig.4 Expression of HuR protein in liver tissues of mice with echinococcus granulosus infection

2.4 肝組織Sema3A蛋白表達(dá)

Sema3A蛋白免疫組化染色結(jié)果顯示，第2周時，小鼠肝組織包囊內(nèi)有黃褐色陽性著色，肝細(xì)胞質(zhì)呈不同程度的黃色陽性；第8周時，包囊空泡化后生發(fā)層細(xì)胞呈黃色陽性，外膜層無陽性表達(dá)，周邊肝細(xì)胞質(zhì)呈黃色陽性著色；與感染第2周時比較，感染第8周時細(xì)粒棘球蚴感染小鼠肝內(nèi)囊生發(fā)層細(xì)胞、外囊外膜層細(xì)胞、周圍肝組織細(xì)胞的Sema3A蛋白表達(dá)免疫評分均升高(P<0.05)。見圖5。

注：A、C為第2周肝組織Sema3A蛋白免疫組化，B、D為第8周肝組織Sema3A蛋白免疫組化。(1)與感染肝臟第2周時比較，P<0.05。圖5 細(xì)粒棘球蚴感染小鼠肝組織Sema3A的蛋白表達(dá)Fig.5 Expression of Sema3A protein in liver tissues of mice with echinococcus granulosus infection

3 討論

細(xì)粒棘球蚴病是由細(xì)粒棘球絳蟲引起的一種人畜共患疾病，其在人體中通常保持無癥狀，直到包囊破裂或不斷生長變大，足以對周圍組織施加壓力，產(chǎn)生類似于占位性腫塊的癥狀[12]。本研究建立細(xì)粒棘球蚴感染小鼠模型，HE染色和天狼星紅染色結(jié)果表明，感染第2周時炎性細(xì)胞明顯增多、纖維化包囊逐漸形成，纖維化組織逐步增生且致密；第8周時，包囊空泡化，形成內(nèi)囊和外囊結(jié)構(gòu)。包蟲囊內(nèi)側(cè)的生發(fā)層向囊腔內(nèi)產(chǎn)生育囊，外側(cè)為無細(xì)胞角質(zhì)層，具有彈性、機械抗性和過濾器的作用，保護(hù)生發(fā)層不被宿主細(xì)胞接觸。寄生蟲的生存策略不僅依賴于謀劃物理屏障，還依賴于下調(diào)宿主反應(yīng)。囊外側(cè)被宿主炎癥細(xì)胞以及不同數(shù)量的纖維組織包圍[13]，常見情況還有包蟲立即被未過濾的膠原層包圍，而在寄生蟲較遠(yuǎn)的地方發(fā)現(xiàn)一些炎癥灶[14]。在免疫細(xì)胞中，GPR97在白細(xì)胞中表達(dá)，如中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞[8]，GPR97最初發(fā)現(xiàn)于小鼠腸淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，在調(diào)節(jié)B細(xì)胞命運和淋巴內(nèi)皮細(xì)胞遷移中起重要作用[15]。本研究結(jié)果顯示，在細(xì)粒棘球蚴感染小鼠模型中，GPR97在初形成的包囊中有弱陽性表達(dá)。感染初期炎性細(xì)胞增多，局部炎癥的維持與寄生蟲活力低下有關(guān)，而炎癥的消退與幼蟲的繁衍有關(guān)[13]。GPCRs位于細(xì)胞表面可以調(diào)控多種生理功能，但是關(guān)于GPR97在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中的作用仍存在爭議。在高脂飲食喂養(yǎng)誘導(dǎo)的肥胖型小鼠體內(nèi)，GPR97基因敲除可減輕脂肪組織炎癥，減少M1型巨噬細(xì)胞浸潤，增加M2型巨噬細(xì)胞浸潤，從而導(dǎo)致促炎因子表達(dá)降低，抑炎因子表達(dá)升高[16]，但在卵清蛋白誘導(dǎo)的過敏性哮喘的小鼠體內(nèi)，GPR97基因敲除對炎癥因子產(chǎn)生沒有影響[17]。本研究結(jié)果表明，隨著包囊空泡化的形成，內(nèi)囊生發(fā)層細(xì)胞中GPR97呈現(xiàn)強陽性表達(dá)，炎性病灶增多，可能參與介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。

HuR作為一類RNA結(jié)合蛋白，參與炎癥和免疫反應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。研究表明，糖尿病患者心臟HuR表達(dá)升高與炎癥標(biāo)志物水平增高相關(guān)[18]。本研究結(jié)果顯示在細(xì)粒棘球蚴感染初期，包囊內(nèi)基本無HuR陽性表達(dá)，待包囊空泡化后，HuR在內(nèi)囊生發(fā)層細(xì)胞呈中等陽性，與GPR97陽性表達(dá)趨勢相近。Wei Fang等[19]發(fā)現(xiàn)缺血再灌注損傷模型小鼠腎臟HuR表達(dá)上調(diào)且與GPR97表達(dá)量呈正相關(guān)，并且GPR97通過影響HuR蛋白表達(dá)可對Sema3A進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，從而影響Sema3A蛋白表達(dá)。Sema家族參與調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)，Sema3A與巨噬細(xì)胞共同培養(yǎng)時，誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞凋亡，而炎癥因子會下調(diào)Sema3A受體，阻止Sema3A誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡[20-21]。本研究結(jié)果顯示，細(xì)粒棘球蚴感染初期時，Sema3A在形成的纖維化包囊中心細(xì)胞為弱陽性表達(dá)，在空泡化包囊生發(fā)層細(xì)胞也為弱陽性表達(dá)，提示炎性病灶增多可能會影響Sema3A蛋白表達(dá)。

綜上所述，GPR97、HuR和Sema3A在細(xì)粒棘球蚴感染小鼠第2周和第8周肝臟空泡化包囊中均有不同程度的陽性表達(dá)，可能參與感染相關(guān)的炎癥反應(yīng)，是否為膜蛋白GPR97影響RNA結(jié)合蛋白HuR參與Sema3A信號通路調(diào)控，需進(jìn)一步研究。