張強,王勝光,吳利民,姜志龍,孟潔,陸寧海

（河南科技學院 資源與環(huán)境學院,河南 新鄉(xiāng) 453003）

由假禾谷鐮刀菌（Fusarium pseudograminearum）為主要病原侵染引起的小麥莖基腐病,在我國河南、陜西等小麥產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生,已成為嚴重威脅我國小麥生產(chǎn)的重要病害[1-4].病原菌在小麥的不同生長階段都能產(chǎn)生危害,可以使莖基部變褐壞死,嚴重時導致死苗或后期出現(xiàn)白穗[5].小麥莖基腐病在造成產(chǎn)量損失的同時,病原菌產(chǎn)生的鐮刀菌毒素還可以在小麥中積累,嚴重影響糧食及飼料品質(zhì)[6-7].

目前,小麥莖基腐病主要采用農(nóng)業(yè)和化學相結(jié)合的防治策略[3,7].與化學防治相比,對環(huán)境友好的生物防治也成為防治小麥莖基腐病的重要措施[8].隋麗娜[9]研究發(fā)現(xiàn)深綠木霉（Trichoderma atroviride）HB20111對假禾谷鐮刀菌有較強的抑制作用,并且進行拌種后可以有效降低小麥莖基腐病的發(fā)生.灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens 21-3）對假禾谷鐮刀菌的生長具有一定的拮抗作用[10].張潔等[11]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）YB-05 不僅能夠抑制假禾谷鐮刀菌,而且與申嗪霉素復配可以起到更好的防病效果.解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）YB-161 對小麥莖基腐病也具有良好的防治效果[12].但是,對小麥莖基腐病生物防治的相關(guān)研究依然較少.本研究以假禾谷鐮刀菌為靶標菌,從女貞葉片中分離篩選出具有較好拮抗能力的內(nèi)生細菌,對優(yōu)良拮抗菌株進行鑒定的同時,評價其對小麥莖基腐病的防治效果,以期為小麥莖基腐病的生物防治提供菌種資源及理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌株:鏈格孢菌（Alternaria alternata）、果生炭疽菌（Colletotrichum fructicola）、膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）、甜櫻間座殼菌（Diaporthe eres）、大斑突臍蠕孢菌（Exserohilum turcicum）、禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）、尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）、層出鐮刀菌（F. proliferatum）、假禾谷鐮刀菌（F. pseudograminearum）、美澳型核果褐腐菌（Monilinia fructicola）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）HB-081 均由河南科技學院資源與環(huán)境學院植物病理學實驗室分離、保存.

小麥:百農(nóng)4199,河南科技學院小麥研究中心提供.

PDA 培養(yǎng)基:馬鈴薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、瓊脂粉15.0 g、蒸餾水1 L.

LB 液體培養(yǎng)基:胰蛋白胨10.0 g、酵母粉5.0 g、NaCl 10.0 g、蒸餾水1 L.

LB 液體培養(yǎng)基中加入15.0 g/L 瓊脂粉為LB 固體培養(yǎng)基.

CMC 培養(yǎng)基:羥甲基纖維素鈉15.0 g、酵母提取物1.0 g、MgSO4·7H2O0.5 g、NH4NO31.0 g、KH2PO41.0 g、蒸餾水1 L.

YEPD 液體培養(yǎng)基:酵母提取物3.0 g、葡萄糖20.0 g、蛋白胨10.0 g、蒸餾水1 L.

1.2 生防細菌的分離與篩選

2021年9 月于河南科技學院校園內(nèi)采集女貞葉片,用自來水沖洗干凈,稱取2.0 g 后剪成2～3 cm 大小,浸入體積分數(shù)為75%的酒精中2 min,取出后再用質(zhì)量分數(shù)為10%次氯酸鈉浸泡1 min.無菌水沖洗3次后,用無菌剪刀剪碎并加入10 mL 無菌水研磨至勻漿.靜置15 min 后,取上清液按10-1～10-5梯度稀釋,各取0.1 mL 涂布于LB 固體培養(yǎng)基,每個濃度設(shè)置3 個重復,28 ℃培養(yǎng)3～5 d 后,挑取單菌落純化培養(yǎng).

以假禾谷鐮刀菌為靶標, 用直徑5 mm 打孔器在培養(yǎng)3 d 的假禾谷鐮刀菌的菌落邊緣打取菌餅,接于PDA 平板中央,采用平板對峙法將分離獲得的細菌4 點對稱接種在距平板中心2.5 cm 處,以只接種假禾谷鐮刀菌為對照,每個處理重復3 次.28 ℃下培養(yǎng)5 d 左右,待對照即將長滿培養(yǎng)皿時,計算抑菌率

1.3 菌株HB-081 的鑒定

1.3.1 形態(tài)學鑒定將菌株HB-081 劃線接種于LB 培養(yǎng)基,28 ℃下培養(yǎng)2 d,對菌落形態(tài)進行觀察.經(jīng)革蘭氏染色后,在光學顯微鏡下對菌體形態(tài)進行觀察.

1.3.2 生理生化鑒定參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[13],對菌株HB-081 進行碳源利用、淀粉水解、纖維素利用、明膠液化、V-P、H2S、耐鹽性等試驗,每個試驗重復3 次.

1.3.3 分子生物學鑒定利用細菌基因組DNA 提取試劑盒提取菌株HB-081 的基因組DNA.采用通用引物27 F（5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇）和1492 R（5＇-GGCTACCTTGTTACGACTT-3＇）、7237 F（5＇-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCC-3＇）和8261 R（5＇-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTG-3＇）分別對16S rRNA 及gyrA 基因序列進行PCR 擴增[14-15].PCR 反應體系為:2×Taq PCR Mix 12.5 μL、27 F/7237 F（10 μmol/L）1.0 μL、1492 R/8261 R（10 μmol/L）1.0 μL,DNA 模板1.0 μL,ddH2O 9.5 μL.PCR 反應條件為:95 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s,57 ℃退火30 s,72℃延伸2 min,30 個循環(huán);72 ℃終延伸5 min.PCR 擴增產(chǎn)物在質(zhì)量分數(shù)為1%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測, 擴增成功后的產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行純化測序.將所得序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行BLAST 比對,并提交GenBank 以獲取登錄號.利用Mega 7.0 軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,1 000 次重復檢驗,以確定菌株的分類地位.

1.4 對假禾谷鐮刀菌菌落生長的抑制作用

挑取菌株HB-081 菌體于LB 液體培養(yǎng)基中,28 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)24 h,再按照2%接種量置于新的LB 液體培養(yǎng)基中,28 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)48 h,以獲得發(fā)酵液.收集發(fā)酵液后,于12 000 r/min離心20 min,再將上清液用0.22 μm 微孔濾膜過濾,進而獲得無菌發(fā)酵液.

將菌株HB-081 無菌發(fā)酵液,按照10%體積分數(shù)處理并冷卻至60 ℃的PDA 培養(yǎng)基混合倒板,培養(yǎng)基凝固后在平板中心接入5 mm 的假禾谷鐮刀菌菌餅,以不加無菌發(fā)酵液的PDA 培養(yǎng)基為對照,每個處理重復3 次.28 ℃下培養(yǎng)5 d 左右,待對照即將長滿培養(yǎng)皿時,按照1.2.2 的方法計算抑菌率.

1.5 對假禾谷鐮刀菌菌絲形態(tài)及孢子萌發(fā)的抑制作用

挑取適量新鮮假禾谷鐮刀菌菌絲體于YEPD 培養(yǎng)基中,同時分別按照10%、20%及50%體積分數(shù)加入菌株HB-081 無菌發(fā)酵液,以只接種假禾谷鐮刀菌為對照,每個處理重復3 次.28 ℃、150 r/min 條件下培養(yǎng)12 h,然后在光學顯微鏡下對假禾谷鐮刀菌的菌絲形態(tài)進行觀察.

將假禾谷鐮刀菌菌塊接種于CMC 培養(yǎng)基中,28 ℃、150 r/min 條件下培養(yǎng)3～5 d,用雙層濾布過濾以去除菌絲,濾液3 500 r/min 離心10 min 后收集孢子,用YEPD 液體培養(yǎng)基重懸浮,并調(diào)整孢子懸浮液濃度為1×106個/mL.在孢子懸浮液中,分別按照10%、20%及50%體積分數(shù)加入菌株HB-081 無菌發(fā)酵液,以不加無菌發(fā)酵液為對照,每個處理重復3 次.28 ℃、150 r/min 條件下培養(yǎng)12 h,利用光學顯微鏡對孢子萌發(fā)情況進行觀察與統(tǒng)計,計算萌發(fā)率和抑制率

1.6 對假禾谷鐮刀菌的抑制作用

分別將菌株HB-081 發(fā)酵液及無菌發(fā)酵液各0.1 mL 均勻涂布于PDA 培養(yǎng)基,再將5 mm 的假禾谷鐮刀菌菌餅接種于PDA 培養(yǎng)皿中心,然后將2 個培養(yǎng)皿對扣.以只接種假禾谷鐮刀菌為對照,每個處理重復3 次.28 ℃下培養(yǎng)5 d 左右,待對照即將長滿培養(yǎng)皿時,按照1.2.2 的方法計算抑菌率.

1.7 對小麥莖基腐病防效的測定

小麥種子加水浸泡過夜后,121 ℃滅菌30 min, 然后接入新鮮的假禾谷鐮刀菌菌塊,28 ℃下培養(yǎng)7～10 d,期間每天搖瓶一次,從而獲得接種用病麥粒.挑選顆粒飽滿的小麥種子,表面消毒后用菌株HB-081發(fā)酵液浸種12 h,之后播種到塑料盆缽中（口徑為15 cm）,每盆20 粒種子,以清水和12.5%質(zhì)量分數(shù)的烯唑醇可濕性粉劑（江蘇劍牌農(nóng)化股份有限公司）拌種為對照,每處理重復3 次.光周期為14 L∶10 D,25 ℃條件下培養(yǎng).待小麥長到1 葉1 心時,在小麥莖基部埋入病麥粒,每株一粒并覆土,30 d 后參照潘婭梅等[16]的方法對小麥莖基腐病的發(fā)病情況進行調(diào)查,并計算病情指數(shù)和防治效果

1.8 抑菌譜的測定

參考1.2.2 的方法,采用平板對峙的方式分析菌株HB-081 對鏈格孢菌、果生炭疽菌、膠孢炭疽菌、甜櫻間座殼菌、大斑突臍蠕孢菌、禾谷鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、層出鐮刀菌、美澳型核果褐腐菌等9 種植物病原真菌的拮抗作用,每個處理重復3 次.28 ℃培養(yǎng)5 d 左右,按照1.2.2 的方法計算抑菌率.

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016 和SPSS 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,用Duncan 氏新復極差法進行差異顯著性檢驗.

2 結(jié)果與分析

2.1 對假禾谷鐮刀菌的抑制作用

菌株HB-081 對假禾谷鐮刀菌的抑制作用如圖1所示.

圖1 菌株HB-081 對假禾谷鐮刀菌的抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of strain HB-081 against Fusarium pseudograminearum

由圖1中1-b 可以看出,菌株HB-081 能夠明顯抑制假禾谷鐮刀菌的菌落生長,抑菌率為61.86%±0.56%.由圖1-c 可以看出,菌株HB-081 在LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)后,獲得的無菌發(fā)酵液對假禾谷鐮刀菌的生長同樣具有明顯的抑制能力,抑菌率為41.81%±0.94%.

2.2 菌株HB-081 的鑒定

2.2.1 形態(tài)學及生理生化特征菌株HB-081 在LB 培養(yǎng)基上的形態(tài)特征如圖2所示.

圖2 菌株HB-081 的形態(tài)學特征Fig.2 Morphological characteristics of strain HB-081

由圖2可以看出,菌株HB-081 菌落為白色,表面粗糙,邊緣不整齊.菌體桿狀,革蘭氏染色陽性.菌株HB-081 的生理生化特征見表1.

表1 菌株hb-081 的生理生化特征Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of strain HB-081

由表1可知,菌株HB-081 能夠利用葡萄糖、阿拉伯糖、甘露醇、果糖、麥芽糖和蔗糖,可以水解淀粉,液化明膠,利用纖維素,V-P 反應陽性,不能產(chǎn)生H2S,在質(zhì)量分數(shù)為2%、5%、7%的NaCl 條件下都可以正常生長.

2.2.2 分子生物學鑒定 以菌株HB-081 基因組DNA 為模板,利用通用引物對該菌株的16S rRNA 基因序列進行擴增和測序,獲得長度為1403 bp 的序列（登錄號:ON573379）.在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對后, 發(fā)現(xiàn)菌株HB-081 的16S rRNA 基因序列與芽孢桿菌屬內(nèi)多個種的16S rRNA 基因序列相似性達到100%.進一步選擇菌株HB-081 的gyrA 基因序列（登錄號:ON603980）進行BLAST 比對,選擇相關(guān)菌株的gyrA 基因序列,利用MEGA 7.0 軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示.

圖3 基于gyrA 基因序列構(gòu)建的菌株HB-081 及相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain HB-081 and related strains based on gyrA gene sequence

由圖3可以看出,菌株HB-081 與解淀粉芽孢桿菌KCTC 1660T、NRRL B-14393 處于一個分支.結(jié)合形態(tài)學、生理生化特征、16S rRNA 及gyrA 基因序列分析,最終將菌株HB-081 鑒定為解淀粉芽孢桿菌.

2.3 對假禾谷鐮刀菌菌絲形態(tài)及孢子萌發(fā)過程的抑制作用

為了分析菌株HB-081 無菌發(fā)酵液對假禾谷鐮刀菌菌絲形態(tài)及孢子萌發(fā)的抑制作用,分別用不同體積分數(shù)的無菌發(fā)酵液對假禾谷鐮刀菌的菌絲及孢子進行處理.菌株HB-081 無菌發(fā)酵液對假禾谷鐮刀菌菌絲形態(tài)的影響如圖4所示.

圖4 菌株HB-081 無菌發(fā)酵液對假禾谷鐮刀菌菌絲生長的抑制作用Fig.4 Inhibitory effects of strain HB-081 cell-free fermentation liquid on mycelial growth of F.pseudograminearum

由圖4可以看出,不同體積分數(shù)的無菌發(fā)酵液都能夠影響假禾谷鐮刀菌菌絲的生長,無菌發(fā)酵液體積分數(shù)為10%及20%時,假禾谷鐮刀菌菌絲生長變慢,且分支增多.當體積分數(shù)增大到50%時,假禾谷鐮刀菌菌絲出現(xiàn)畸形,部分細胞液泡化.

菌株HB-081 無菌發(fā)酵液對假禾谷鐮刀菌孢子萌發(fā)的抑制作用如表2所示.

表2 菌株HB-081 對假禾谷鐮刀菌孢子萌發(fā)的抑制作用Tab.2 Inhibitory effects of strain HB-081 on conidiospores germination of F. pseudograminearum %

由表2可以看出,不同體積分數(shù)的無菌發(fā)酵液都能夠抑制假禾谷鐮刀菌孢子萌發(fā)過程,體積分數(shù)越高,抑制效果越強.50%體積分數(shù)時,孢子萌發(fā)率僅有15.61%,抑制率達到82.49%.

2.4 對假禾谷鐮刀菌的抑制作用

為了分析菌株HB-081 揮發(fā)性物質(zhì)對假禾谷鐮刀菌的抑制作用, 分別將涂布有菌株HB-081 發(fā)酵液和無菌發(fā)酵液的平板與接種假禾谷鐮刀菌的平板進行對扣培養(yǎng).揮發(fā)性物質(zhì)對假禾谷鐮刀菌菌落生長的抑制作用如圖5所示.

圖5 菌株HB-081 揮發(fā)性物質(zhì)對假禾谷鐮刀菌的抑制作用Fig.5 Inhibitory effects of volatiles from strain HB-081 against F. pseudograminearum

由圖5可以看出,菌株HB-081 發(fā)酵液和無菌發(fā)酵液的存在都可以影響假禾谷鐮刀菌的生長,抑菌率分別為19.39%±3.27%和18.68%±1.25%,此結(jié)果說明,菌株HB-081 能夠產(chǎn)生抑制假禾谷鐮刀菌的揮發(fā)性氣體.

2.5 對小麥莖基腐病的防病效果

利用盆栽試驗分析菌株HB-081 發(fā)酵液對小麥莖基腐病的防病效果如表3所示.

表3 菌株HB-081 發(fā)酵液對小麥莖基腐病的防病效果Tab.3 Effect of strain HB-081 fermentation liquid against wheat crown rot

由表3可以看出,對照組小麥莖基腐病的病情指數(shù)為19.34,菌株HB-081 發(fā)酵液處理后,病情指數(shù)降低到6.46,防治效果達到66.69%.另外,12.5%烯唑醇可濕性粉劑的防治效果為81.13%.由此說明,菌株HB-081 具有一定的防病能力.

2.6 菌株HB-081 的抑菌譜

利用平板對峙的方法分析菌株HB-081 對不同植物病原真菌的拮抗能力結(jié)果見表4.

表4 菌株HB-081 對9 種不同植物病原真菌的拮抗作用Tab.4 The inhibitory effects of strain HB-081 against nine plant pathogens

由表4可知,菌株HB-081 對供試的9 種植物病原真菌都有不同程度的拮抗能力,其中對美澳型核果褐腐菌的抑制作用最強,抑菌率為65.58%.對禾谷鐮刀菌及層出鐮刀菌的抑菌率相對較低,分別為48.08%和48.76%.由此表明,菌株HB-081 具有一定的抑菌譜.

3 結(jié)論與討論

大量研究表明,解淀粉芽孢桿菌可作為重要的生防資源,能夠?qū)Χ喾N植物病害起到生防作用,如黃瓜灰霉病[17]、煙草青枯病[18]、馬鈴薯黑痣病[19]、水稻基腐病[20]、人參灰霉病[21]及苜蓿炭疽病[22]等.本研究從女貞葉片中分離篩選到1 株對假禾谷鐮刀菌具有較好抑制效果的菌株HB-081,經(jīng)形態(tài)學、生理生化特征、16S rRNA 及gyrA 基因序列分析后,將其鑒定為解淀粉芽孢桿菌.此外,通過抗菌譜分析發(fā)現(xiàn)該菌株對鏈格孢菌等9 種植物病原真菌具有拮抗效果.

在抑菌機制方面的研究表明,解淀粉芽胞桿菌主要利用其產(chǎn)生的脂肽類物質(zhì)、聚酮類物質(zhì)等多種活性物質(zhì)發(fā)揮其生物防治效果[23].本研究發(fā)現(xiàn),菌株HB-081 的無菌發(fā)酵液可以導致假禾谷鐮刀菌的菌絲出現(xiàn)畸形,并影響孢子的萌發(fā)過程.解淀粉芽胞桿菌HRH317 發(fā)酵上清液能夠破壞串珠鐮孢菌的細胞膜通透性,進而抑制串珠鐮孢菌菌絲體的生長[24].解淀粉芽孢桿菌HMB33604 可以產(chǎn)生泛革素和伊枯草菌素等抑菌活性物質(zhì),從而實現(xiàn)對立枯絲核菌的抑制作用,并導致病原菌菌絲出現(xiàn)畸形[20].此外,芽孢桿菌可以產(chǎn)生多種揮發(fā)性物質(zhì),能夠在不同程度上抑制植物病原菌的生長[25].例如解淀粉芽孢桿菌CPA-8 產(chǎn)生的噻吩等物質(zhì)可以對甜櫻桃3 種采后病害起到抑制作用[26].解淀粉芽孢桿菌BEB17 產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)能夠破壞香蕉枯萎病菌的細胞膜,并對孢子萌發(fā)過程具有抑制作用[27].于此類似,菌株HB-081 也能夠產(chǎn)生抑制假禾谷鐮刀菌菌落生長的揮發(fā)性物質(zhì).所以下一步還需對菌株HB-081 的抑菌活性物質(zhì)組成及抑菌機理進行深入研究.

本研究通過盆栽試驗發(fā)現(xiàn)菌株HB-081 發(fā)酵液處理后,能夠降低小麥莖基腐病的病情指數(shù),防病效果為66.69%.林琪童等[12]發(fā)現(xiàn),解淀粉芽孢桿菌YB-161 對小麥莖基腐病的盆栽防治效果為68.15%,田間防治效果高于52.35%.本研究只進行了盆栽試驗,該菌株在田間條件下是否也能實現(xiàn)其生防效果有待后續(xù)研究.芽孢桿菌不僅能夠防治植物病害,而且對植物還具有促生作用.例如解淀粉芽孢桿菌LY79 不僅能夠防治煙草根黑腐病,而且對煙草具有較好的促生效果[28].枯草芽孢桿菌Y-10 具有固氮及產(chǎn)生鐵載體的能力,從而對黃瓜的生長起到促進作用[29].因此,后續(xù)還將開展菌株HB-081 促生作用相關(guān)的研究.