李 志 薛曉焱 劉 震 蔡齊飛 耿曉東 馮 建 周慧娜 張 濤 李明婉 王艷梅

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院 鄭州 450002)

山桐子(Idesiapolycarpa)是大風(fēng)子科(Flacourtiaceae)山桐子屬落葉闊葉喬木，樹形優(yōu)美，木材松軟，果實艷麗，在不同立地環(huán)境均具有較好的適應(yīng)性，是良好的新型用材樹種和觀賞樹種(陳珺肄等， 2019)。山桐子果實含油率高且營養(yǎng)物質(zhì)豐富，其果肉和種子中不飽和脂肪酸含量可達(dá)到75%和85%以上，是優(yōu)良的木本油料樹種，可作為開發(fā)高檔保健型木本食用油的原料，素有“樹上油庫”的美譽(yù)(代莉， 2014)。山桐子作為木本油料樹種，具有抗逆性強(qiáng)、適生地廣、“不與糧爭地”的優(yōu)勢，在林業(yè)、食品、醫(yī)藥及生態(tài)等多個領(lǐng)域有巨大的開發(fā)前景(陳釗等， 2019； 房麗莎等， 2020)。近年來，國家正式制定頒布了山桐子、山桐子油、山桐子餅粕3個行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，并將山桐子納入到了國家儲備林建設(shè)的政策體系中。

在自然界，植物生長環(huán)境中有大量微生物，寄主在植物宿主體內(nèi)或附著其表面，這些微生物群體統(tǒng)稱為植物微生物組。細(xì)菌是這些微生物群落中最豐富的類群(Mülleretal., 2016)。同種植物不同器官區(qū)微生物存在一定差異，李聰聰?shù)?2020)比較了高寒草甸優(yōu)勢植物葉內(nèi)、根內(nèi)、土壤原核微生物組的組成，發(fā)現(xiàn)植物器官對微生物具有強(qiáng)烈選擇性，只有部分土壤微生物能夠進(jìn)入植物根內(nèi)和葉內(nèi)； Wu等(2020)研究結(jié)果表明柑桔(Citrusreticulata)葉片和韌皮部的微生物群落數(shù)量遠(yuǎn)低于根系和土壤。細(xì)菌與植物形成復(fù)雜、動態(tài)的關(guān)聯(lián)，包括互利共生或致病，Zarraonaindia等(2015)的研究發(fā)現(xiàn)葡萄(Vitisvinifera)葉子和果實中的甲基桿菌(Methylobacteriumspp.)可以通過產(chǎn)生植物激素的生產(chǎn)來刺激植物的發(fā)育； 尹詩琳等(2021)的研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌屬(Bacillus)對桑樹(Morusalba)病原菌存在著某種程度的拮抗作用，而泛菌屬(Pantoea)可能對桑輪紋病的發(fā)生有協(xié)同或者伴生作用。

山桐子林木出現(xiàn)感病現(xiàn)象，部分植株根系變黑腐爛，樹皮出現(xiàn)褐色水漬病斑，葉片邊緣枯萎且葉面有褐色斑點(diǎn)，病害發(fā)生原因及致病因子尚未明確。目前，山桐子相關(guān)研究主要集中在栽培技術(shù)、油脂提取、開發(fā)利用等方面，而微生物病害方面的研究相對薄弱。 李佛生等(2021)對山桐子內(nèi)生真菌進(jìn)行分離，鑒定出4種山桐子組織來源共同的內(nèi)生真菌為芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)； 有研究報道了山桐子葉斑病的病原真菌鏈格孢菌(Alternariaalternata)(Sunetal., 2015)。 細(xì)菌是否為造成山桐子病害的關(guān)鍵因子還有待進(jìn)一步探索。研究基于高通量測序技術(shù)，以健康和感病山桐子植株為對象，探究山桐子土壤、樹皮及葉片中細(xì)菌群落組成和多樣性，分析其差異，探討健康和感病山桐子不同器官區(qū)的優(yōu)勢菌屬及其潛在功能，探究各器官區(qū)的關(guān)鍵菌屬與山桐子感病之間的關(guān)系，以期為山桐子病害防治及經(jīng)營管理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

研究試驗地位于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林業(yè)試驗站，屬于暖溫帶大陸性氣候，年平均氣溫14.2℃，極端最高氣溫43℃，極端最低氣溫-17.9℃，年平均降水量650.1mm，全年日照時數(shù)約2 400 h。試驗地0～20cm土壤的基礎(chǔ)化學(xué)性質(zhì)為： pH 8.0，土壤全碳(TC)17.76 g·kg-1，全氮(TN)0.81 g·kg-1，有效磷(AP)2.43 mg·kg-1，有效鉀(AK)75.78 mg·kg-1。

1.2 樣品采集

2020年5月，在樣地內(nèi)采集健康山桐子植株和感病山桐子植株的根際土壤、樹皮、葉片樣品，以及樣地非根際土壤樣品。土壤樣品采集時，每樣株隨機(jī)選取3個樣點(diǎn)，去除植株基部表層土壤及雜物，取5～20cm土層側(cè)根或須根表面0.4cm左右的土壤作為根際土壤，空地同土層隨機(jī)取3個樣點(diǎn)作為非根際土壤，將每個樣點(diǎn)采集的土壤分別裝入無菌自封袋中充分混勻，共計9份土樣，土壤樣品編號為健康植株根際土壤(G)、感病植株根際土壤(BG)、非根際土壤(FG)。用無菌剪刀和鑷子采集植物樹皮和葉片，每樣株2個部位分別采3份，共6份皮樣、6份葉樣，編號分別為健康植株樹皮(P)、感病植株樹皮(BP)、健康植株葉片(Y)和感病植株葉片(BY)。采集好的樣品用冰盒保存帶回實驗室后，置于-80℃冰箱保存，供檢測使用。

1.3 測定指標(biāo)及方法

對健康、感病山桐子植株根際土壤、樹皮、葉片及非根際土的總DNA進(jìn)行提取，提取的DNA用1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，用紫外分光光度計檢測其質(zhì)量和濃度。選擇引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，對樣品細(xì)菌16 S rRNA 基因的V3-V4 區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增(Claessonetal., 2009)。采用的25μL擴(kuò)增體系包括5×reaction buffer 5μL，5×GC buffer 5μL，dNTP(2.5mmol·L-1)2μL，F(xiàn)orwardprimer(10μmol·L-1)1μL，Reverseprimer(10μmol·L-1)1μL，DNA Template 2μL，ddH2O 8.75μL，Q5 DNA Polymerase 0.25μL。擴(kuò)增參數(shù)為98℃ 2min，98℃ 15 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，72℃ 5min，30個循環(huán)，10℃保存。Illumina miseq測序平臺進(jìn)行高通量測序，測序由上海派森諾生物科技有限公司完成。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用QIIME2(2019.4)軟件調(diào)用DADA2進(jìn)行質(zhì)控、去噪、拼接、去嵌合體，采用97%的序列相似度作為OTU(operational taxonomic unit，OTU)的劃分閾值，獲得的OTU代表序列用于細(xì)菌群落組成分析、α多樣性分析和β多樣性分析、菌群功能預(yù)測等； 運(yùn)用R軟件等工具，繪制稀疏曲線； 根據(jù)ASV/OTU豐度表制作upsetR圖； 對樣本中相對豐度前20位的屬進(jìn)行聚類分析并繪制熱圖； 根據(jù)樣本差異距離進(jìn)行主坐標(biāo)分析(Principal coordinate analysis，PCoA)； 利用SPSS 24.0分析α多樣性指數(shù)在各樣本間的差異(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物測序結(jié)果分析

對山桐子林地非根際土壤及健康、感病山桐子植株的根際土壤、樹皮、葉片進(jìn)行高通量測序，21個樣本(3個重復(fù)/處理)中的細(xì)菌16 S rRNA V3-V4序列過濾后，共獲得1 193 103條高質(zhì)量序列。稀疏曲線可以用來比較測序數(shù)量不同的樣本物種豐富度，也可說明樣本的取樣大小是否合理。根據(jù)樣本的測序數(shù)據(jù)，繪制對應(yīng)的稀疏曲線(圖1)。結(jié)果表明，各樣本的稀疏曲線均趨于平緩，說明該測序深度包含了樣本中絕大多數(shù)細(xì)菌類型，測序深度充足，可以反映真實的細(xì)菌群落生物多樣性。

圖1 各區(qū)域樣本中細(xì)菌稀釋曲線

2.2 山桐子健康、感病植株不同器官區(qū)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

2.2.1 山桐子健康、感病植株不同器官區(qū)OTU數(shù) 使用upset圖分析山桐子不同器官區(qū)細(xì)菌的物種組成(圖2)。土壤樣本健康植株根際土壤感病植株根際土壤(G)、感病植株根際土壤(BG)、非根際土壤(FG)中包含的OTU 數(shù)目分別是17 236、17 403、15 461 個，3組共有OTU 數(shù)量為1 100個，各自特有OTU 數(shù)目分別是14 517、14 577、12 776個，根際土壤樣本特有的OTU 數(shù)均高于非根際土壤，預(yù)示著根際土壤中含有較多的特有微生物種類； G和BG兩組特有OTU分別占其總OTU的84.22%和83.76%。樹皮樣本P、BP中的特有OTU數(shù)量為737、857個，分別占其總OTU的74.29%和80.77%。葉片樣本Y、BY中特有OTU數(shù)量為181、156個，分別占其總OTU的69.35%和70.91%。以上數(shù)據(jù)表明，健康植株根際土壤和樹皮中特有OTU數(shù)量少于感病植株，葉片特有OTU數(shù)量多于感病植株，7組樣本中特有OTU數(shù)量均占較大比例。

圖2 各器官區(qū)細(xì)菌群落

2.2.2 山桐子健康、感病植株不同器官區(qū)細(xì)菌門、綱、目、科水平群落結(jié)構(gòu) 對各樣本中得到的OTU序列進(jìn)行分類注釋，所有樣本的細(xì)菌OTU隸屬于37個門，118個綱，291個目，511個科，1051個屬，2772個種。

各分類水平上物種相對豐度前10位的細(xì)菌分布見圖3。在門水平上(圖3a)，土壤樣本的優(yōu)勢菌門為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)； 其中變形菌門在G、BG和FG中所占比例為BG>G>FG，在根際土壤中相對豐度較大； FG中的酸桿菌門和綠彎菌門(Chloroflexi)占比數(shù)量顯著高于根際土壤(P<0.05)，且綠彎菌門為FG的優(yōu)勢菌門。樹皮、葉片樣本的優(yōu)勢菌門為藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)和變形菌門。在樹皮樣本中，變形菌門在P、BP中的相對豐度分別為30.52%、62.26%，P的相對豐度顯著低于BP； 藍(lán)細(xì)菌門在P、BP中的相對豐度分別為61.57%、28.39%，P的相對豐度顯著高于BP(P<0.05)。在葉片樣本中占比最多的是藍(lán)細(xì)菌門84.58%(Y)、88.42%(BY)，其次是變形菌門15.16%(Y)、11.33%(BY)，2個門的細(xì)菌占總數(shù)量的99.7%以上。

在綱水平上(圖3b)，變形菌門中α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteo-bacteria)和放線菌門中放線菌鋼(Actinobacteria)在G和BG中占比較為接近，但均高于FG，其中放線菌綱在根際與非根際土壤中差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)； 而放線菌門中嗜熱油菌綱(Thermoleophilia)在FG中的相對豐度顯著高于根際土壤。在樹皮樣本中，藍(lán)細(xì)菌門中產(chǎn)氧光細(xì)菌綱(Oxyphotobacteria)在P(61.57%)中的相對豐度顯著高于BP(28.39%)，γ-變形菌綱在BP(43.82%)中的相對豐度顯著高于P(5.15%)。綱水平上，葉片樣本主要綱為產(chǎn)氧光細(xì)菌綱和α-變形菌綱，兩者在Y和BY中占比接近。

在目(圖3c)、科(圖3d)水平上，產(chǎn)氧光細(xì)菌綱中葉綠體(Chloroplast)是樹皮、葉片的主要組成，在P、BP、Y、BY中占比分別為61.56%、28.39%、84.54%、88.41%； α-變形菌綱中立克次氏體目(Rickettsiales)及其下屬線粒體(Mitochondria)的相對豐度在P、Y、BY 3組樣本中占比分別為14.03%、14.06%和10.76%； γ-變形菌綱中腸桿菌目及其下屬腸桿菌科(Enterobacteriaceae)在樹皮樣本BP(41.03%)中的相對豐度顯著高于P(1.02%)。

圖3 各分類水平上相對豐度前10物種在各樣本的分布和豐度

2.2.3 山桐子健康、感病植株不同器官區(qū)細(xì)菌屬水平群落結(jié)構(gòu) 對3組土壤樣本中相對豐度排名前20位的細(xì)菌屬進(jìn)行UPGMA聚類分析，結(jié)果表明(圖4)，根際土壤G、BG具有相似的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，聚為一類； FG與根際土壤差異較大，單獨(dú)為一類。20個細(xì)菌屬可以分為3組(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)。FG中Ⅰ組細(xì)菌屬豐度較高，主要包括變形菌門中的bacteriap25、Haliangium、MND1； 放線菌門中的Gaiella、MB-A2-108、67-14、IMCC26256； 綠彎菌門中的A4b、KD4-96； 酸桿菌門中的Subgroup_17、RB41； 以及浮霉菌門的OM190，Rokubacteria的Rokubacteriales，共13個菌屬。G中Ⅲ組細(xì)菌屬豐度較高，主要包括放線菌門中的類諾卡氏菌屬(Nocardioides)、芽球菌屬(Blastococcus)、土壤紅桿菌屬(Solirubrobacter)； 酸桿菌門中的Subgroup_6； 變形菌門的鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)，共5個菌屬。BG中Ⅱ組細(xì)菌屬豐度較高，主要包括變形菌門中Dongia以及放線菌門中的鏈霉菌屬(Streptomyces)，共2個菌屬。

圖4 土壤在屬水平上的細(xì)菌豐度聚類熱圖

選取2組樹皮樣本中豐度排名為前20位細(xì)菌屬進(jìn)行UPGMA聚類，繪制物種豐度聚類熱圖(圖5)。由圖5可知，2組樹皮中的細(xì)菌群落在屬水平上差異明顯。P中豐度較高的細(xì)菌屬，主要包括變形菌門中的鞘氨醇單胞菌屬、不動桿菌屬(Acinetobacter)、Aureimonas； 放線菌門中的Quadrisphaera、貧養(yǎng)桿菌屬(Modestobacter)和擬桿菌門的薄層菌屬(Hymenobacter)，共6個菌屬。BP中豐度較高的細(xì)菌屬，主要包括變形菌門中的Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium、果膠桿菌屬(Pectobacterium)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、小坂菌屬(Kosakonia)、Brenneria、Hafnia-Obesumbacterium、玫瑰單胞菌屬(Roseomonas)； 厚壁菌門中的類芽胞桿菌屬(Paenibacillus)、丹毒絲菌屬(Erysipelothrix)、Saccharibacillus； 放線菌門的芽球菌屬，共12個菌屬。

對樹皮樣本中的細(xì)菌進(jìn)行優(yōu)勢菌屬分析，在健康和感病山桐子樹皮細(xì)菌中，細(xì)菌豐度10%以上且存在顯著差異(P<0.05)的屬有2個，分別是Brenneria和Hafnia-Obesumbacterium，在健康山桐子樹皮中相對豐度僅為0.79%和0，顯著低于感病山桐子樹皮中Brenneria(18.33%)和Hafnia-Obesumbacterium(17.5%)的相對豐度。

選取2組葉片樣本中豐度排名為前20位細(xì)菌屬進(jìn)行UPGMA聚類(圖6)。由圖6可知，Y中豐度較高的細(xì)菌屬，主要包括變形菌門中的鞘氨醇單胞菌屬、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia、短波單胞菌屬(Brevundimonas)、不動桿菌屬、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、腸桿菌屬(Enterobacter)、Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium、假單胞菌屬、貪銅菌屬(Cupriavidus)、草螺菌屬(Herbaspirillum)； 以及綠彎菌門的KD4-96，共11個菌屬。BY中豐度較高的細(xì)菌屬，主要包括厚壁菌門中的魏斯氏菌屬(Weissella)、芽孢桿菌屬、乳桿菌屬(Lactobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)； 以及變形菌門中的Escherichia-Shigella、Phreatobacter、Pusillimonas，共7個菌屬。

2.3 不同器官區(qū)細(xì)菌群落多樣性分析

2.3.1 α多樣性分析 對山桐子植株不同器官區(qū)細(xì)菌多樣性指數(shù)進(jìn)行差異分析(表1)。采用Chao1指數(shù)反映物種豐富度； 采用Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映細(xì)菌群落的多樣性； Goods coverage指數(shù)反映群落覆蓋度。山桐子植株不同器官區(qū)細(xì)菌的Chao1、Shannon、Simpson指數(shù)值都表現(xiàn)為土壤樣本最高，其次是樹皮樣本，最后是葉片樣本，說明土壤細(xì)菌群落豐富度和多樣性是最高的。土壤各組的Chao1指數(shù)由大到小排列依次為： BG>G>FG，感病植株根際土壤細(xì)菌群落豐富度最高； Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)由大到小依次為： G>FG>BG，說明健康植株根際土壤細(xì)菌群落多樣性最高。葉片中Y組的Chao1、Shannon、Simpson指數(shù)均高于BY，表明健康植株葉片細(xì)菌群落豐富度和多樣性高于感病植株葉片。但健康植株與感病植株土壤、葉片細(xì)菌群落的Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)差異均未達(dá)到顯著水平(P>0.05)。樹皮細(xì)菌群落Chao1指數(shù)表現(xiàn)為P高于BP，而Shannon、Simpson指數(shù)均表現(xiàn)為BP高于P，其中Simpson指數(shù)差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)，說明健康植株樹皮細(xì)菌群落豐富度較高，但細(xì)菌群落多樣性低于感病植株樹皮。

圖5 樹皮在屬水平上的細(xì)菌豐度聚類熱圖

圖6 葉片在屬水平上的細(xì)菌豐度聚類熱圖

2.3.2 β多樣性分析 為進(jìn)一步明晰樣本間在群落物種組成上的差異性，采用PCoA分析山桐子不同器官區(qū)細(xì)菌群落物種組成的相似度。如圖7所示，PCo1和PCo2分別解釋變量方差的42.9%、8.6%，兩者累計貢獻(xiàn)率達(dá)51.5%。PCo1可以將土壤的細(xì)菌群落與樹皮、葉片明顯區(qū)分開，土壤分布在PCo1負(fù)方向，樹皮和葉片主要分布在正方向，說明樹皮和葉片與土壤細(xì)菌群落差異較大。不同健康狀態(tài)山桐子的土壤和樹皮細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在差異性，其中健康、感病樹皮細(xì)菌組成差異明顯。而Y和BY相聚較近，表明健康和感病山桐子葉片細(xì)菌組成相似度較高。

表1 不同器官區(qū)細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)①

圖7 不同器官區(qū)細(xì)菌PCoA分析

2.4 菌群代謝功能預(yù)測分析

使用PICRUSt2軟件對健康、感病山桐子中不同器官區(qū)的細(xì)菌微生物群落進(jìn)行代謝功能預(yù)測。通過KEGG數(shù)據(jù)庫比對，結(jié)果共注釋到6條一級代謝通路，包括生物進(jìn)程(cellular processes)、環(huán)境信息處理(environmental information processing)、遺傳信息處理(genetic information processing)、人類疾病(human diseases)、代謝(metabolism)和生物體系統(tǒng)(organismal systems)； 一級代謝通路中代謝、遺傳信息處理為主要代謝通路，占全功能分類的80.68%～82.24%、11.26%～13.48%。在二級代謝通路中共注釋到34種代謝通路子功能，選取豐度占總豐度比值大于1.00%的子功能進(jìn)行統(tǒng)計(表2)。山桐子不同器官區(qū)的微生物群落功能相似，但在子功能通路豐度上存在較大差異； 感病、健康山桐子的代謝功能，在土壤和葉片樣本中組內(nèi)差異較小，樹皮樣本組內(nèi)差異較大。細(xì)胞進(jìn)程中的細(xì)胞運(yùn)動(0.64%～2.72%)和環(huán)境信息處理中的膜運(yùn)輸(1.58%～2.32%)，在子功能通路豐度上呈P低于BP。遺傳信息處理中復(fù)制和修復(fù)(4.73%～4.87%)、折疊、分類和降解(3.08%～4.46%)、翻譯(2.52%～3.22%)為主要子功能，在子功能通路豐度上呈P高于BP。與代謝有關(guān)的主要子功能有11種，在各樣本中豐度均較高，其中5種子功能通路豐度為土壤>樹皮>葉片，包括碳水化合物代謝(12.01%～13.21%)、氨基酸代謝(11.63%～13.13%)、萜類化合物和聚酮類化合物的代謝(7.02%～9.72%)、外源生物降解與代謝(4.49%～7.74%)、脂質(zhì)代謝(4.06%～7.25%)； 輔助因子和維生素的代謝(11.4%～16.58%)、能量代謝(5.01%～9.51%)2種子功能通路豐度表現(xiàn)為葉片高于土壤和樹皮； 氨基酸代謝、能量代謝、聚糖生物合成與代謝、輔助因子和維生素的代謝、其他氨基酸代謝在子功能通路豐度上呈P高于BP； 脂質(zhì)代謝、外源生物降解與代謝在子功能通路豐度上呈G高于BG，P低于BP。

表2 KEGG 數(shù)據(jù)庫主要代謝通路豐度

對已有代謝通路的豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，使用metagenomeSeq方法對樣本組進(jìn)行兩兩比較，分析相同器官區(qū)、不同樣本之間在功能上的差異(圖8)，篩選條件為P<0.05。分析結(jié)果表明，在土壤中，BG組12，14和16元大環(huán)內(nèi)酯的生物合成(Biosynthesis of 12-, 14-and 16-membered macrolides)、植物晝夜節(jié)律(Circadian rhythm-plant)、軸突導(dǎo)向(axon guidance)、倍半萜生物合成(sesquiterpenoid biosynthesis)、Ⅱ型聚酮主鏈的生物合成(biosynthesis of type II polyketide backbone)、Ⅱ型聚酮產(chǎn)品的生物合成(biosynthesis of type II polyketide products)、糖胺聚糖降解(Glycosaminoglycan degradation)和溶酶體(Lysosome)通路相關(guān)功能基因?qū)φ誈組顯著增加，而萘降解(Naphthalene degradation)通路相關(guān)功能基因?qū)φ誈組極顯著降低。在樹皮中，BP組的D-精氨酸和D-鳥氨酸代謝(D-Arginine and D-ornithine metabolism)和金黃色葡萄球菌感染(Staphylococcus aureus infection)通路相關(guān)功能基因?qū)φ誔組極顯著增加，而類胡蘿卜素生物合成(Carotenoid biosynthesis)、弓形體病(Toxoplasmosis)和志賀菌病(Shigellosis)相關(guān)功能基因?qū)φ誔組顯著降低。

圖8 兩兩組間代謝通路存在顯著差異的功能分類

3 討論

3.1 健康和感病山桐子各器官區(qū)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征

本研究采用Illumina miseq高通量測序技術(shù)分析健康和感病山桐子土壤、樹皮、葉片細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的差異。結(jié)果表明，山桐子不同器官區(qū)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異，OTU數(shù)量由高到低為土壤>樹皮>葉片，土壤相較于植物組織含有較多的OTU數(shù)量，這與其他林木研究結(jié)果相似(劉海燕等， 2019； 楊多等， 2022)，一定程度上也反映了不同器官區(qū)環(huán)境的特性。進(jìn)一步的物種分析注釋發(fā)現(xiàn)，山桐子不同器官區(qū)細(xì)菌群落的主要成分存在差異，在分類學(xué)上不同種類細(xì)菌的相對豐度發(fā)生變化。山桐子根際土壤細(xì)菌群落主要由變形菌門、放線菌門和酸桿菌門構(gòu)成，這些優(yōu)勢菌門在根際環(huán)境中富集，與其較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性有關(guān)(王安寧等， 2019； Lietal., 2020)。其中變形菌門包括多種病原菌和固氮菌，因為其外膜主要由脂多糖組成可以保護(hù)其內(nèi)部遺傳物質(zhì)不受外部干擾，可以在大多數(shù)環(huán)境中生存并繁衍成為優(yōu)勢菌(葛藝等， 2021； 翟婉璐等， 2017)。山桐子樹皮和葉片細(xì)菌群落主要由藍(lán)細(xì)菌門和變形菌門構(gòu)成，這一結(jié)果與前人的研究發(fā)現(xiàn)相似(暴家兵等， 2020； 李慧娟等， 2021)。藍(lán)細(xì)菌門在山桐子葉際細(xì)菌中處于優(yōu)勢地位，相對豐度范圍為84.58%～88.42%，產(chǎn)氧光細(xì)菌綱是其主要的細(xì)菌類群，有研究表明，藍(lán)細(xì)菌是地球上廣泛存在的一種自養(yǎng)型細(xì)菌，種類繁多，有些種類能夠進(jìn)行產(chǎn)氧的光合作用，有些種類在暗環(huán)境下也能生長，營養(yǎng)要求低，對極端環(huán)境適應(yīng)性很強(qiáng)(王文曉等， 2020)。山桐子樹皮和葉片中的微生物群落與土壤微生物群落差異較大，可能與不同器官區(qū)域的周邊環(huán)境有關(guān)，藍(lán)細(xì)菌能夠為山桐子樹皮、葉片區(qū)域提供更適宜生長的微環(huán)境，促進(jìn)山桐子的生長。

3.2 健康和感病山桐子各器官區(qū)細(xì)菌群落差異菌屬

健康和感病山桐子各器官區(qū)細(xì)菌在屬水平有顯著差異。本研究中鞘氨醇單胞菌屬是健康山桐子各器官區(qū)共有的優(yōu)勢菌屬，不動桿菌屬是健康山桐子樹皮、葉片的優(yōu)勢菌屬，與抑病能力密切相關(guān)。鞘氨醇單胞菌屬具有植物促生特性(陳兆進(jìn)等， 2021)，鞘氨醇單胞菌在降解有毒物質(zhì)、抵抗病原菌(秦立金等， 2018)、促進(jìn)植物生長(葛藝等， 2021)等方面的功能。不動桿菌屬能產(chǎn)生生物表面活性劑和一些酶類物質(zhì)，具有較高的促生、抗菌和降解有機(jī)污染物性能(程淺， 2020； 顧美英等， 2021)。從核桃根際土壤中分離到的2種不動桿菌屬菌株，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)對核桃細(xì)菌性疫病具有明顯拮抗作用，可以抑制病原菌生長，進(jìn)而提高植物的抗病性(涂昌等， 2020)。本研究從感病山桐子樹皮中篩選出的優(yōu)勢菌屬為腸桿菌科的Brenneria和Hafnia-Obesumbacterium，在感病山桐子樹皮中的相對豐度均顯著高于健康山桐子樹皮。Brenneria是重要的林木病原細(xì)菌，該屬細(xì)菌侵染林木樹皮后會引起不規(guī)則的潰瘍病斑，對經(jīng)濟(jì)林木生長有嚴(yán)重的威脅(Frutos， 2010)。國內(nèi)外研究表明，Brenneria細(xì)菌會引起許多林木病害，例如Brennerianigrifluens是核桃樹皮潰瘍病的病原菌(Morettietal.， 2007)；Brenneriasalicis是柳樹水紋病的病原菌(Martineetal.， 2009)；Brenneriaquercina和B.corticissp. nov.是中國歐美楊潰瘍病的致病菌(楊莉， 2013； Lietal.， 2019);Brenneriarubrifaciens可引起核桃深層樹皮潰瘍病(Amirsardarietal., 2017)等。Brenneria可能對山桐子樹皮區(qū)域病害的發(fā)生有協(xié)同或伴生作用，但其是否為山桐子感病的致病菌仍需進(jìn)一步的研究。Hafnia-Obesumbacterium近年來已經(jīng)被證明某些細(xì)菌具有較高的耐鹽性(王改萍等， 2021)，而Qing等(2020)研究發(fā)現(xiàn)Hafnia-Obesumbacterium在感病林蛙腸道菌群中的相對豐度較高，可能與動物腹瀉相關(guān)。但是，對于Hafnia-Obesumbacterium在植物致病性方面的報道還較少，有待進(jìn)一步探究。

3.3 健康和感病山桐子各器官區(qū)細(xì)菌群落多樣性

本研究對不同器官區(qū)山桐子細(xì)菌群落多樣性分析可知，山桐子各器官區(qū)細(xì)菌群落多樣性和豐富度由高到低均表現(xiàn)為土壤>樹皮>葉片，這與Wu等(2020)的研究結(jié)果類似，表明山桐子不同器官區(qū)細(xì)菌群落在多樣性和豐富度方面存在顯著差異。本研究中，感病山桐子樹皮細(xì)菌多樣性高于健康植株，樹皮細(xì)菌豐富度低于健康植株，這與林馬水等(2019)以健康和干腐病山核桃植株為研究對象，得出感病山核桃(Caryacathayensis)樹皮多樣性及豐富度指數(shù)均低于健康植株的結(jié)果不同，這可能是由于病菌在寄主體內(nèi)存在時間的長短，對樹體生態(tài)平衡造成的影響不同； 同時，植株發(fā)病時間的長短也可能是造成感病山桐子樹皮組內(nèi)細(xì)菌多樣性差異較大的主要原因。

3.4 健康和感病山桐子各器官區(qū)細(xì)菌功能特征

菌群代謝功能預(yù)測結(jié)果表明，山桐子中的細(xì)菌主要涉及代謝、遺傳信息處理等6條一級代謝通路和34種子功能，表現(xiàn)出功能上的豐富度。山桐子不同器官區(qū)樣本中所含的功能基因種類大致相同，說明山桐子相關(guān)細(xì)菌群的功能基因具有一定相似性。對山桐子不同器官區(qū)樣本細(xì)菌功能基因相對豐度進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)代謝通路在山桐子不同器官區(qū)中相對豐度均最大。在代謝通路中，代謝功能注釋相對豐度大多表現(xiàn)為土壤微生物組含有更多的碳水化合物代謝、氨基酸代謝、萜類化合物和聚酮類化合物的代謝、外源生物降解與代謝和脂質(zhì)代謝，這可能與土壤益生菌的含量有關(guān)(馬欣等， 2021)，其中碳水化合物代謝調(diào)控著生物體內(nèi)碳水化合物的代謝形成、分解和互相轉(zhuǎn)化，有益于植物的氮、磷循環(huán)(馬欣等， 2021； 丁鈺珮等， 2021)； 氨基酸代謝與碳代謝和氮代謝相關(guān)(南鎮(zhèn)武等， 2021)； 萜類化合物代謝與植物抗病性和抗逆性有關(guān)(叢微等， 2021)，間接說明土壤細(xì)菌代謝功能活躍有利于植物生長發(fā)育。而輔助因子和維生素的代謝、能量代謝在葉片微生物組中注釋豐度明顯高于土壤和樹皮，這2種代謝功能可能在維持植物葉際環(huán)境中發(fā)揮重要功能。通過代謝通路差異分析可知，感病山桐子根際土壤和樹皮中相關(guān)生物合成與氨基酸代謝的功能基因富集，說明感病后山桐子感病區(qū)域微生物群落的結(jié)構(gòu)及其功能已做出了有益于生長發(fā)育的響應(yīng)。而感病山桐子樹皮中金黃色葡萄球菌感染功能基因富集，造成代謝紊亂，降低山桐子抗病性，進(jìn)而導(dǎo)致山桐子病害的發(fā)生。因PICRUSt功能預(yù)測分析只是初步預(yù)測相關(guān)細(xì)菌的功能，未來的研究將需要進(jìn)一步驗證山桐子的致病菌，明晰引起山桐子病害的機(jī)制，更好地為山桐子病害防治及高質(zhì)量經(jīng)營提供理論支撐。

4 結(jié)論

健康和感病山桐子植株根際、樹皮及葉片細(xì)菌結(jié)構(gòu)組成、多樣性和功能存在差異。山桐子土壤主要優(yōu)勢菌門為變形菌門、放線菌門和酸桿菌門，樹皮和葉片主要優(yōu)勢菌門為藍(lán)細(xì)菌門和變形菌門。健康山桐子各器官區(qū)中主要的優(yōu)勢菌屬為鞘氨醇單胞菌屬和不動桿菌屬，感病后群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，健康樹皮與感病樹皮細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著，感病山桐子樹皮的主要優(yōu)勢菌屬為腸桿菌科的Brenneria和Hafnia-Obesumbacterium。功能預(yù)測表明山桐子各器官區(qū)細(xì)菌生態(tài)功能較為豐富，健康和感病山桐子的土壤及樹皮區(qū)域代謝功能有明顯差異。