趙君寧 梁國棟 臧玲 徐瑾 何偉

1 老年肝纖維化的現(xiàn)況

隨著人口老齡化及社會環(huán)境的變化，老年慢性肝病如代謝性肝病[1]的發(fā)病率逐漸上升。肝纖維化是慢性肝病共有的病理改變，對老年肝病的轉(zhuǎn)歸、預(yù)后有十分重要的影響。老年肝纖維化的發(fā)病機制是目前的研究熱點和難點。肝纖維化是指肝臟中肝細胞產(chǎn)生壞死或受到炎癥刺激而引起的纖維結(jié)締組織反常性增生的病理進程，是多種慢性肝病向肝硬化發(fā)展時都會經(jīng)過的病理階段，是絕大部分慢性肝病共有的病理基礎(chǔ)[2]。

2 微小RNA在肝纖維化中的作用

微小RNA(microRNAs, miRNAs或miR)是一類大小在22 nt左右的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA。miRNAs可以通過靶向結(jié)合到mRNA的3′或5′非翻譯區(qū)(UTR)，從而調(diào)控轉(zhuǎn)錄后的基因表達[3-4]。miRNAs廣泛存在于真核生物體內(nèi)，控制著動植物體內(nèi)大量基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，是最主要的基因表達調(diào)控因子之一。目前研究估計人體內(nèi)大約2/3的基因都受到某個或一組miRNA的調(diào)控，參與體內(nèi)細胞增殖、分化、凋亡、器官發(fā)育以及維持器官生理機能等各種過程[5]，與生命過程中發(fā)育、疾病密切相關(guān)。由于它們廣泛的生理學(xué)特性，在過去的十年里，在人體內(nèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過1800多種miRNAs[6]。研究表明miRNAs在各種肝臟病理改變中起著關(guān)鍵作用，包括肝炎、肝硬化和肝癌[7-8]。這些慢性肝病有著共同的病理過程——肝纖維化。因此，本文就miRNAs與肝纖維化關(guān)系的研究進展作一綜述。

3 肝星狀細胞(HSCs)在肝纖維化中的作用

HSCs是受損肝臟膠原表達增加的主要來源，也是肝纖維化的主要標志之一。任何原因引起肝纖維化之后， HSCs被激活，靜止HSCs轉(zhuǎn)化成增殖性、成纖維性和收縮性肌成纖維細胞[9]。有研究表明，抑制HSCs的活化可以預(yù)防和治療肝纖維化[10]；內(nèi)皮細胞衍生的細胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)可以調(diào)控病理性HSCs的遷移[11]。除此之外，許多研究表明，與EVs相關(guān)的非編碼RNAs可以通過上調(diào)抗纖維化或促纖維化基因的表達調(diào)控HSCs的增殖和分化[12]。在近期的一項研究中發(fā)現(xiàn)，結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)可以促進HSCs的纖維化過程。miR-214可以靶向結(jié)合CTGF的3′-UTR區(qū)，激活HSCs。來源于HSCs的EVs所攜帶的miRNAs可以通過結(jié)合CTGF的3′-UTR區(qū)抑制CTGF的表達。然而，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)EVs釋放的miRNAs在HSCs間傳遞，可以升高HSCs中肝纖維化相關(guān)標志物——α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達[13]。另外，有研究表明，miR-128-3p靶向結(jié)合過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors, PPAR)γ調(diào)控HSCs的活化，肝細胞衍生的囊泡所攜帶的miRNAs是抑制攜帶miR-128-3p的PPRY-γ表達最有效的抑制劑[14]。 此外，miR-378可能通過抑制Gli3的表達從而限制HSCs的活化和肝臟纖維化進程[15]。小鼠脂毒性肝細胞產(chǎn)生的外泌體中富含miR-27a，可通過負向調(diào)節(jié)PINK1的表達，在抑制線粒體吞噬和促進代謝相關(guān)脂肪性肝病的肝纖維化中發(fā)揮關(guān)鍵作用[16]。因此，EVs中的非編碼RNA可通過促進HSCs的遷移和活化發(fā)揮促纖維化作用，或者具有強效的抗纖維化作用，從而成為肝纖維化調(diào)控過程中一個關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因素。

4 肝纖維化與多種信號通路

多種信號通路和細胞因子參與到肝纖維化的調(diào)節(jié)中，下面將這些重要的信號通路與miRNAs的關(guān)系作進一步的闡述。

4.1 轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β/smad通路 TGF-β1作為TGF-β家族中重要的成員，在肝臟纖維化的過程中起著重要的作用。在相關(guān)的臟器中，TGF-β1的表達是升高的，與細胞外基質(zhì)的沉積呈正比。Smad蛋白作為轉(zhuǎn)錄影響因子，對TGF-β1在細胞內(nèi)的效應(yīng)起著關(guān)鍵的作用。在用四氯化碳(CCl4)處理的動物肝臟中，肝纖維化大鼠中膠原蛋白Ⅰ含量、p-Smad2和p-Smad3的含量增加[17]。TGF-β1通過激活Smad依賴和非依賴通路來發(fā)揮生物學(xué)活性。目前大家熟知的是TGF-β1通過激活下游的中介產(chǎn)物Smad2 和Smad3來發(fā)揮生物活性，而Smad7在這過程中起著抑制劑的作用[18]。近年來的研究認為，TGF-β可能通過調(diào)控一些微小RNA的表達從而影響肝纖維化的過程[19]。Tu等[20]發(fā)現(xiàn)，在大鼠肝纖維化模型中，miR-101可以抑制TGF-β1在肝細胞和HSCs中的表達，從而阻斷TGF-β信號通路，促進活化的HSCs轉(zhuǎn)為靜態(tài)的HSCs，從而干擾肝纖維化進程；同時，在人肝細胞中，miR-101通過抑制TGF-β信號通路減少肝纖維化相關(guān)的細胞因子釋放，從而減緩肝纖維化進程。另外，有研究表明miR-19b的表達水平升高可以抑制HSCs中TGF-β信號通路的活性[21]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)miR-30c和miR-193可能作用于TGF-β2及snail1(調(diào)控細胞外基質(zhì)的關(guān)鍵因子)而干擾纖維化進程[22]。

4.2 NF-κB通路 NF-κB通過調(diào)控炎性因子和抗炎因子影響肝臟炎性反應(yīng)，從而干擾肝纖維化的進程；同時，NF-κB還能影響HSCs的凋亡，繼而對肝纖維化的進程產(chǎn)生影響[23]。一項研究表明，miR-126可以上調(diào)IκBα(NF-κB抑制劑)表達，從而抑制NF-κB信號通路的激活，繼而干擾肝纖維化的進程[24]。Hyun等[15]發(fā)現(xiàn)，在CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型中，在NF-κB信號通路的調(diào)控下，miR-378a-3p可以干擾HSCs的活化，進而參與肝纖維化。還有研究發(fā)現(xiàn)，在CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型中，miR-29b通過調(diào)控caspase-9誘導(dǎo)HSCs凋亡[25]。

4.3 磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt通路 PI3K作為酪氨酸激酶和G蛋白偶聯(lián)受體的主要下游分子，催化產(chǎn)生3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇繼而激活轉(zhuǎn)錄因子FOXO1、mTOR、Akt、糖原合酶激酶-3(GSK-3)等下游分子，介導(dǎo)多種生長因子和細胞因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，對細胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運等多種生理過程進行調(diào)節(jié)。PI3K/Akt通路通過調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的降解，從而干擾HSCs的增殖和凋亡，參與肝纖維化的進程[26]。miR-29b可與PI3KR1、Akt3的3′UTR區(qū)域結(jié)合，進而抑制PI3K/Akt的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而發(fā)揮抗肝臟纖維化的作用[25]。

4.4 Wnt信號通路 Wnt信號通路由Wnt蛋白家族、β-catenin、Frizzled跨膜受體蛋白、低密度脂蛋白受體(LRP)、GSK-3β、細胞質(zhì)Dishevelled蛋白(Dsh)等組成，調(diào)控胚胎發(fā)育、細胞生長、組織分化和凋亡等各個過程[27]。β-catenin是Wnt通路中的關(guān)鍵調(diào)控因子，在肝臟的生長發(fā)育、細胞再生和物質(zhì)代謝等方面起著重要作用。有報道稱miR-17-5p通過Wnt/β-catenin促進HSCs的活化[28]。

5 一些重要的miRNAs在肝纖維化中的作用

通過芯片測序方法發(fā)現(xiàn)，與靜止狀態(tài)的HSCs相比，活化狀態(tài)的HSCs中的一系列miRNAs被解除調(diào)控。下面我們挑選一些重要的miRNAs進行深入的闡述。

5.1 miR-29 Wang等[25]發(fā)現(xiàn)miR-29過表達抑制了Smad 3和TGF-β1的表達，提示miR-29b與TGF-β1/Smad 3通路在促進肝纖維化中存在相互交流。miR-29b通過與下游效應(yīng)器pI3Kr1和Akt3的結(jié)合，調(diào)節(jié)HSCs的增殖和凋亡，從而阻止肝纖維化的發(fā)生。此外，在丙型肝炎病毒(HCV)誘導(dǎo)的肝纖維化中miR-29的表達下調(diào)，TaqMan miRNAs譜顯示miR-29在HSCs激活過程中被下調(diào)，細胞外基質(zhì)合成受到抑制[29]。除了促纖維化TGF-β信號傳導(dǎo)外，miR-29還受促炎癥途徑的調(diào)節(jié)[30]。因此，miR-29在整合HSCs促纖維化和炎癥之間信號相互交流方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，使其成為有希望的抗纖維化候選物。

5.2 miR-21 一項研究發(fā)現(xiàn)，顯性負效應(yīng)的TGF-β受體Ⅱ(dominant-negative TGF-βreceptorⅡ, dnTGF-βRⅡ)模型小鼠可以產(chǎn)生與人類原發(fā)性膽汁性肝硬化相似的自身免疫性膽管炎[31]。有趣的是，dnTGF-βRⅡ主要是由CD4+和CD8+T細胞表達的，它可以大大減少TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致T細胞固有細胞介導(dǎo)的自身免疫。而缺乏TGF-β信號的T細胞可以導(dǎo)致T細胞miRNAs的表達下調(diào)，但是關(guān)鍵的炎癥因子miR-21的表達上調(diào)。此外，在肝細胞效應(yīng)器CD8+T細胞中表達的miR-21水平要顯著高于dnTGF-βRⅡ小鼠脾臟和腸系膜淋巴結(jié)分離的相同亞群中的CD8+T細胞[31]。該研究的數(shù)據(jù)表明用miR-21轉(zhuǎn)染的w.t. B6 T細胞亞群會上調(diào)炎癥因子TNF-α和 IFN-γ的表達，從而部分復(fù)制dnTGF-βRⅡ-T細胞表型[31]。綜上所述，miR-21對dnTGF-βRⅡ小鼠中促炎細胞因子的產(chǎn)生起關(guān)鍵作用。

5.3 miR-34 miR-34家族的三個成員包括miR-34a、miR-34b和miR-34c，在小鼠和人體中呈現(xiàn)差異化表達。有研究表明，上調(diào)的miR-34家族在二甲基亞硝胺誘導(dǎo)大鼠肝纖維化過程中起一定的作用[32]。此外，活化的HSCs通過上調(diào)miR-34a調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)蛋白(如膠原蛋白)的沉積和α-SMA的表達[33]。

5.4 miR-155 在miR-155基因敲除鼠中，酒精誘導(dǎo)脂肪蓄積的減少與過氧化物酶體增殖物激活受體反應(yīng)元件(peroxisome proliferator-activated receptor response element, PPRE)和PPARα(miR-155靶點)結(jié)合的增加，以及單核細胞趨化蛋白1(MCP1)的產(chǎn)生減少有關(guān)[34]。該研究結(jié)果表明,miR-155的缺乏可以減輕慢性酒精刺激引起的脂肪變性、肝損傷和肝臟氧化應(yīng)激；miR-155的缺乏不僅可以阻止酒精引起的脂肪性肝炎，還可以阻止小鼠模型的纖維化。

5.5 miR-122 miR-122是肝臟中表達量最高的miRNAs之一，占全部miRNAs的70%，可發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞周期、分化和凋亡等多種功能。一項研究發(fā)現(xiàn),84例慢性丙型肝炎肝纖維化病人血清miR-122水平隨肝纖維化程度的加重而顯著降低[35]。 miR-122抑制了TGF-β誘導(dǎo)的肝纖維化相關(guān)基因的表達，包括α-SMA、α1型I膠原(Col1a1)、纖連蛋白(fn1)的表達[36]。這些研究提示miR-122有望成為抗纖維化治療的靶點。

5.6 miR-19b Lakne等[37]研究了靜止和活化的HSCs中miRNAs的表達差異，發(fā)現(xiàn)活化的HSCs中miR-19b表達顯著下調(diào)。miR-19b負調(diào)控TGF-β信號通路，表現(xiàn)為TGF-β受體Ⅱ (TGF-βRⅡ)和Smad3表達的降低。miR-19b通過阻斷TGF-β誘導(dǎo)的前膠原mRNAs的表達減少Ⅰ型膠原的表達，同時形態(tài)學(xué)顯示miR-19b可以鈍化HSCs的表型。此外，miR-19b在纖維化大鼠肝臟及纖維組織中的表達較正常肝組織明顯下調(diào)。

5.7 miR-571 miR-571在人肝細胞和HSCs中對TGF-β進行調(diào)節(jié)使其表達下調(diào)。Roderburg 等[38]通過隊列分析中進行的定量PCR(qPCR)發(fā)現(xiàn)，在酒精性和丙型肝炎肝硬化病人中miR-571的血清水平發(fā)生了顯著變化，且血清水平與疾病分期密切相關(guān)，具有作為肝硬化新生物標志物的潛力。進一步分析顯示，miR-571在人肝細胞和HSCs中表達上調(diào)，以調(diào)節(jié)TGF-β。

5.8 miR-221和miR-222 Abdel-al等[39]研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-221和miR-222的表達在肝纖維化的早期和晚期均明顯上調(diào)。miR-222對早期和晚期纖維化的敏感性和特異性最高。miR-221對晚期纖維化的敏感性和特異性次之[39]。miR-221和miR-222在人體肝臟纖維化過程中以及小鼠纖維化模型中表達都是上調(diào)的，TNF-α可以通過與CDKN1B (p27) 基因的3′-UTR區(qū)相結(jié)合誘導(dǎo)miR-222調(diào)節(jié)下游蛋白的表達，可能成為新的肝纖維化進展的標志物[40]。

綜上所述， miRNAs在肝纖維化的發(fā)展中至關(guān)重要，miRNAs參與多條肝纖維化信號通路的調(diào)節(jié)，涉及肝臟炎癥、氧化應(yīng)激、自噬等過程。目前，老年病人肝纖維化的發(fā)病率逐年升高，但發(fā)病機制仍不明確，也缺乏有效的治療策略。隨著轉(zhuǎn)錄組學(xué)的發(fā)展，越來越多miRNAs的作用正在逐步揭開，miRNAs將在治療肝纖維化以及肝硬化方面具有更為廣闊的應(yīng)用前景。