張忠文陳國華黃露麒梅俊華邵 衛(wèi)梅 瑰

(武漢市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,武漢 430022)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一種常見于老年人的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,在全球人口中65歲以上人群發(fā)病率高達(dá)1.5%[1]。 PD 涉及黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性死亡,出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)遲緩、震顫和姿勢異常等運(yùn)動(dòng)障礙[2]。 到目前為止,PD 發(fā)病的確切機(jī)制仍不完全清楚。 目前,帕金森病的治療如康復(fù)、多巴胺前體、多巴胺激動(dòng)劑和抗膽堿能藥物可以緩解癥狀[3]。 此外,許多藥物會產(chǎn)生許多副作用,比如左旋多巴引起的運(yùn)動(dòng)障礙、斷斷續(xù)續(xù)的現(xiàn)象、疲憊、幻覺和妄想[4]。 因此迫切需要有效的治療方法來阻止或減緩多巴胺能細(xì)胞的死亡。

近年來,從天然產(chǎn)物中分離出的高效低毒化合物用于神經(jīng)退行性疾病治療的研究受到了人們的廣泛關(guān)注[5]。 黃連解毒湯由黃連、黃芩、黃柏、梔子4 味中藥組成,具有抗炎、抗氧化、抗腦缺血、保護(hù)神經(jīng)元等作用,可用于腦血管疾病、癡呆、炎癥等疾病的治療[6]。 有研究表明,黃連解毒湯對MPTP 所致的帕金森病小鼠有防治效果[7],但其主要成分對帕金森病的作用及其作用機(jī)理還有待研究。 研究發(fā)現(xiàn),黃連解毒湯的主要成分巴馬汀、漢黃芩素和京尼平苷均能抑制炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生,進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)來保護(hù)細(xì)胞免受損傷[8-10]。 但它們是否通過抑制炎癥反應(yīng)保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞鮮見報(bào)道。 1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+) 是一個(gè)帶正電荷的分子。MPP+通過干擾線粒體氧化磷酸化誘導(dǎo)大量氧化應(yīng)激,導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元損傷[11]。 SH-SY5Y 細(xì)胞系具有多種神經(jīng)元特性和多巴胺能神經(jīng)元的兒茶酚胺能表型,被廣泛用作帕金森病研究的多巴胺能神經(jīng)元的體外模型[12]。 因此,本研究擬使用MPP+處理SH-SY5Y 細(xì)胞構(gòu)建PD 模型,再用黃連解毒湯中3 種活性成分巴馬汀、漢黃芩素和京尼平苷處理模型細(xì)胞,模擬黃連解毒湯在PD 發(fā)生和發(fā)展中的作用,然后檢測細(xì)胞存活率、凋亡、炎癥因子和α-突觸核蛋白(α-Syn)、酪氨酸羥化酶(TH)的表達(dá),探討黃連解毒湯活性成分對帕金森癥腦神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y 細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM 購自Gibco 公司(貨號:C11330500BT);胎牛血清購自TBD(貨號:TBD11HT);MPP+碘化物購自sigma 公司(貨號:D048);CCK-8 購自BestBio(貨號:BB-4202);Hoechst 33258 購自碧云天公司(貨號:C1017);Triton X-100 購自absin 公司(貨號:abs9149);α-Syn、TH 抗體購自Bioswamp 公司(貨號:PAB31491、MAB46040);TNF-α、IFN-γ、IL-6 和IL-1β 試劑盒購自Bioswamp 公司(貨號:HM10001、HM10115、 HM10205 和 HM10206); TRIzol 購 自ambion 公司(貨號:15596026),反轉(zhuǎn)錄所用試劑購自TaKaRa 公司, SYBR Green 染料購自KAPA Biosystems 公司(貨號:KM4101);PCR 引物由武漢天一華煜基因科技有限公司合成。 CO2恒溫培養(yǎng)箱購自Thermo 公司(型號311);倒置熒光顯微鏡購自Leica 公司(型號DMIL LED)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 SH-SY5Y 細(xì)胞的培養(yǎng)及PD 細(xì)胞模型的構(gòu)建及鑒定

將SH-SY5Y 細(xì)胞以每毫升1×105個(gè)的密度接種于培養(yǎng)瓶內(nèi),用10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基37℃、5% CO2培養(yǎng)。 當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到80%匯合時(shí),以0.25%胰蛋白酶消化,按1 ∶3 比例傳代培養(yǎng)。 取SH-SY5Y 細(xì)胞接種于96 孔板分為對照組和MPP+組,對照組加入10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基,MPP+組中加入含500 μmol/L 的MPP+的10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基[13],于37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h 后,CCK-8 檢測細(xì)胞活力。

1.3.2 化合物濃度篩選

將構(gòu)建成功的PD 模型細(xì)胞按照不同成分分別進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)。 巴馬汀:在培養(yǎng)基中分別加入0、3.5、7、10、12.5 μmol/L 的巴馬汀培養(yǎng)24 h;漢黃芩素:在培養(yǎng)基中分別加入0、10、30、50、60 μmol/L 的漢黃芩素培養(yǎng)24 h;京尼平苷:在培養(yǎng)基中分別加入0、10、30、50、60 μmol/L 的京尼平苷培養(yǎng)24 h。 細(xì)胞處理完成后,使用ELISA 檢測篩選出巴馬汀、漢黃芩素、京尼平苷的最佳作用濃度。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理

多模態(tài)隱喻觀認(rèn)為隱喻不只存在于語言中，還存在于其他媒介中，如聲音、音樂、色彩、線條等?！岸嗄B(tài)隱喻”是指用兩種或兩種以上模態(tài)來體現(xiàn)源域和目標(biāo)域映射隱喻現(xiàn)象(Forceville＆Urios－Aparisi，2009)。多模態(tài)研究主要探討多種媒介下的圖像、音樂等非語言符號在表達(dá)意義時(shí)的互補(bǔ)性及規(guī)律性特征，探討模態(tài)和媒體的關(guān)系，以及第二外語課堂中多模態(tài)視覺和言語的協(xié)同性(Barthes 1977;Kress＆Van Leeuwen 2001;Royce 2002)。

將對數(shù)生長期的SH-SY5Y 細(xì)胞分為5 組:空白對照組、模型組、巴馬汀組、漢黃芩素組、京尼平苷組。 空白對照組的細(xì)胞培養(yǎng)基中不添加任何物質(zhì)培養(yǎng)24 h;其余各組加入500 μmol/L 的MPP+構(gòu)建PD 細(xì)胞模型。 巴馬汀組、漢黃芩素組、京尼平苷組3 組添加相應(yīng)濃度的藥物,培養(yǎng)24 h 后,CCK-8 檢測細(xì)胞活力,計(jì)算抑制率。

1.3.4 Hoechst 33258 染色

SH-SY5Y 細(xì)胞接種12 孔板處理24 h 后,加1 mL 4%多聚甲醛室溫固定20 min,PBS 清洗后加入1 mL Hoechst 33258 染色液,室溫染色5 min。PBS 清洗后于熒光顯微鏡下拍照。

1.3.5 免疫熒光

SH-SY5Y 細(xì)胞接種12 孔板處理24 h 后,PBS清洗后加入1 mL 4%多聚甲醛室溫固定30 min。PBS 清洗,加入1 mL 0.5% Triton X-100 室溫通透20 min。 1 mL 5% BSA,37℃封閉1 h,棄去封閉液。加入300 μL PBS 稀釋后的一抗,4℃孵育過夜。 次日,PBS 清洗后加入300 μL PBS 稀釋后的二抗,37℃孵育1 h。 加入300 μL 抗熒光淬滅封片液(含DAPI),于熒光顯微鏡觀察拍照。

1.3.6 ELISA 檢測細(xì)胞中炎癥因子TNF-α、IFN-γ、IL-6 和IL-1β 的水平

嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說明書檢測細(xì)胞中TNF-α、IFN-γ、IL-6 和IL-1β 的水平。

采用TRIzol 試劑分別提取各組細(xì)胞的總RNA,測定提取的RNA 純度和濃度。 將提取的RNA 按照TaKaRa 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明方法逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。Real-time PCR 擴(kuò)增體系如下:SYBR FAST qPCR Master Mix 10 μL,上游引物(10 μmol/L)0.5 μL,下游引物(10 μmol/L) 0.5 μL,cDNA 模 板1 μL,ddH2O 8 μL,總體積為20 μL。 反應(yīng)條件如下:95℃預(yù)變性3 min,擴(kuò)增95℃ 5 s,56℃ 10 s,72℃ 25 s 共計(jì)40 個(gè)循環(huán),最后65℃～95℃制備溶解曲線,以GAPDH 為內(nèi)參基因。 計(jì)算相對表達(dá)量。 待測基因引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graph pad 8.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,每兩組間比較應(yīng)用t檢驗(yàn),P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MPP+對SH-SY5Y 細(xì)胞活力的影響

如圖1 所示,與空白對照組比較,模型組SHSY5Y 細(xì)胞增殖活力顯著降低(P<0.01),結(jié)果表明PD 細(xì)胞模型構(gòu)建成功。

圖1 CCK-8 法檢測細(xì)胞活力Note. Compared with control group, ##P<0.01.Figure 1 Cell viability was detected by CCK-8 method

2.2 巴馬汀、漢黃芩素、京尼平苷濃度的篩選

如圖2 所示,巴馬汀組細(xì)胞中IFN-γ、IL-6 和IL-1β 的濃度在0～12.5 μmol/L 的范圍內(nèi)呈下降趨勢,而TNF-α 的濃度在0～10 μmol/L 的范圍內(nèi)呈下降趨勢,在12.5 μmol/L 的時(shí)候濃度增加,顯示巴馬汀的最佳作用濃度為10 μmol/L。 漢黃芩素組細(xì)胞中TNF-α、IFN-γ、IL-6 和IL-1β 的濃度在0～60 μmol/L的范圍內(nèi)呈下降趨勢,但在濃度為50 μmol/L 和60 μmol/L 時(shí)無明顯差異,表明漢黃芩素的最佳作用濃度為50 μmol/L。 京尼平苷組細(xì)胞TNF-α、IFN-γ 和IL-1β 的濃度在0～50 μmol/L 的范圍內(nèi)呈下降趨勢,而IL-6 的濃度在0～50 μmol/L 的范圍內(nèi)呈下降趨勢,在60 μmol/L 的時(shí)候濃度增加,顯示京尼平苷的最佳作用濃度為50 μmol/L。

圖2 巴馬汀、漢黃芩素和京尼平苷濃度的篩選Figure 2 Screening of palmatine, wogonin and geniposide

2.3 藥物對SH-SY5Y 細(xì)胞活力的影響

與空白對照組比較,模型組SH-SY5Y 細(xì)胞增殖活力顯著降低(P<0.01)。 與模型組比較,巴馬汀組、漢黃芩素組、京尼平苷組中SH-SY5Y 細(xì)胞增殖活力顯著升高(P<0.01)。 見圖3。

圖3 藥物對SH-SY5Y 細(xì)胞活力的影響Note. Compared with control group, ##P<0.01. Compared with model group, **P<0.01.Figure 3 Effect of drugs on SH-SY5Y cell viability

2.4 Hoechst 33258 染色結(jié)果

如圖4 所示,Hocchst 33258 染色后空白對照組的細(xì)胞出現(xiàn)較弱的均勻的藍(lán)色熒光。 而MPP+處理SH-SY5Y 細(xì)胞后,細(xì)胞核大量呈濃染致密的固縮形態(tài)伴著較強(qiáng)的熒光。 巴馬汀組、漢黃芩素組、京尼

圖4 Hoechst 33258 染色Figure 4 Hoechst 33258 staining

2.5 免疫熒光檢測α-Syn、TH 的表達(dá)情況

如圖5 所示,免疫熒光檢測觀察到模型組α-Syn 熒光強(qiáng)度強(qiáng)于空白對照組。 而巴馬汀組、漢黃芩素組、京尼平苷組分別干預(yù)細(xì)胞后,熒光強(qiáng)度減弱。 鏡下可見空白對照組中綠色熒光的TH 陽性細(xì)胞較多,模型組TH 陽性細(xì)胞顯著減少。 巴馬汀組、漢黃芩素組、京尼平苷組TH 陽性細(xì)胞均有不同程度的增加。 結(jié)果表明,巴馬汀組、漢黃芩素組、京尼平苷組能抑制α-Syn 的表達(dá)水平,對SH-SY5Y 細(xì)胞具有保護(hù)作用。

圖5 免疫熒光檢測α-Syn、TH 的表達(dá)情況Figure 5 Expression of α-Syn and TH was detected by immunofluorescence

2.6 ELISA 檢測細(xì)胞中炎癥因子TNF-α、IFN-γ、IL-6 和IL-1β 的水平

如圖6 所示,與空白對照組比較,模型組細(xì)胞中TNF-α、IFN-γ、IL-6 和IL-1β 水 平 顯 著 升 高(P<0.01);與模型組比較,巴馬汀組、漢黃芩素組、京尼平苷分別干預(yù)細(xì)胞后,熒光均有不同程度減弱。

圖6 炎癥因子的水平Note. Compared with control group, ##P<0.01. Compared with model group, **P<0.01.Figure 6 Levels of inflammatory factors

平苷組細(xì)胞TNF-α、IFN-γ、IL-6 和IL-1β 的表達(dá)水平顯著降低(P<0.01),表明巴馬汀組、漢黃芩素組、京尼平苷組能抑制炎癥因子的釋放,對SHSY5Y 細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。

2.7 Real-time PCR 檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA 的表達(dá)水平

如圖7 所示,與空白對照組比較,模型組細(xì)胞中Bax、Caspase-3 mRNA 的表達(dá)水平增加,而Bcl-2 mRNA的表達(dá)減少(P<0.01);與模型組比較,巴馬汀組、漢黃芩素組、京尼平苷組細(xì)胞Bax、Caspase-3 mRNA 的表達(dá)水平降低,而Bcl-2 mRNA 的表達(dá)增加(P<0.01)。 結(jié)果表明,黃連解毒湯活性成分對帕金森癥腦神經(jīng)細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用,其作用機(jī)制可能與抑制Bax、Caspase-3 的表達(dá),提高Bcl-2 的表達(dá)有關(guān)。

圖7 Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA 的表達(dá)水平Note. Compared with control group, ##P<0.01. Compared with model group, **P<0.01.Figure 7 Expression levels of Bcl-2, Bax and Caspase-3 mRNA

3 討論

PD 是第二常見的與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病,其特征是多巴胺能(DA)神經(jīng)元的進(jìn)行性丟失和中腦黑質(zhì)致密區(qū)胞質(zhì)中路易小體的出現(xiàn)。 慢性神經(jīng)炎癥也是帕金森病的病理生理學(xué)標(biāo)志之一。研究表明,神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活和促炎細(xì)胞因子水平升高是PD 腦的共同特征[14]。 由于促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的釋放而引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活,加重了DA 神經(jīng)元的變性[15],因此炎癥過程被認(rèn)為是PD 和其他神經(jīng)退行性疾病的一個(gè)有希望的干預(yù)靶點(diǎn)。

MPTP 在星形膠質(zhì)細(xì)胞中被單胺氧化酶代謝,轉(zhuǎn)化為電離的MPP+,通過多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)移到DA神經(jīng)元[16]。 研究發(fā)現(xiàn),MPP+對SH-SY5Y 細(xì)胞神經(jīng)元產(chǎn)生明顯的損傷,因此在療效評價(jià)方面比其他PD模型有很大優(yōu)勢。 本實(shí)驗(yàn)采用MPP+干預(yù)SH-SY5Y細(xì)胞24 h 制備體外PD 模型,通過CCK-8 檢測,觀察MPP+組活力下降,對SH-SY5Y 細(xì)胞有明顯的抑制作用。 在PD 發(fā)病過程中,黑質(zhì)致密部中α-Syn的逐漸聚集導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元的丟失,進(jìn)一步通過大腦中的神經(jīng)元回路傳播,從而促進(jìn)疾病的進(jìn)展[17]。 TH 存在于所有多巴胺能細(xì)胞中,是DA 生物合成中的關(guān)鍵限速酶。 TH 陽性神經(jīng)元的減少會抑制TH 的活性,導(dǎo)致DA 合成的減少,可作為PD的直接指示因子[18]。 Ser129 磷酸化α-Syn 比例的增加會對TH 調(diào)節(jié)產(chǎn)生干擾,進(jìn)一步對神經(jīng)元存活產(chǎn)生負(fù)面影響[19]。 本實(shí)驗(yàn)用MPP+干預(yù)SH-SY5Y細(xì)胞后,α-Syn 熒光強(qiáng)度增強(qiáng),TH 陽性細(xì)胞顯著減少,表明成功建立PD 體外模型。 巴馬汀、漢黃芩素、京尼平苷分別干預(yù)后,細(xì)胞增殖活力顯著升高,α-Syn 熒光強(qiáng)度減弱,TH 陽性細(xì)胞增加,表明黃連解毒湯的活性成分對帕金森癥腦神經(jīng)細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用。

巴馬汀是黃連和黃柏中的主要成分,能夠阻斷ADAM17/EGFR 信號傳導(dǎo)減弱胃上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。 漢黃芩素是黃芩中的主要活性成分,能夠直接作用免疫細(xì)胞抑制炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生,抑制炎癥相關(guān)通路,如MAPK、Akt、NF-κB 和JAK-STAT 等。京尼平苷是梔子中的主要活性成分,通過上調(diào)miR-145-5p 抑制NF-κB 和JNK 通路保護(hù)大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤(PC12)細(xì)胞免于炎性損傷[8-10]。 本研究通過ELISA 檢測發(fā)現(xiàn),在一定濃度范圍內(nèi),巴馬汀、漢黃芩素、京尼平苷能抑制細(xì)胞中炎癥因子TNF-α、IFN-γ、IL-6 和IL-1β 的水平。 小膠質(zhì)細(xì)胞是大腦中的一種免疫細(xì)胞,活化后產(chǎn)生和釋放促炎細(xì)胞因子,對DA 神經(jīng)元造成損傷。 大量研究報(bào)道炎癥反應(yīng)作用會激活細(xì)胞凋亡信號,進(jìn)一步損害并導(dǎo)致器官衰竭。 炎癥介質(zhì)會引起線粒體產(chǎn)生活性氧并釋放細(xì)胞色素,形成凋亡小體以激活Caspase-3。 活化的Caspase-3 切割DNA 修復(fù)酶和細(xì)胞穩(wěn)定蛋白,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[20-21]。 研究發(fā)現(xiàn)PD 患者的紋狀體和腦脊液中均有炎癥因子如IFN-γ、IL-1β、TNF-α 和IL-6 的存在,同時(shí)TNF-α 受體R1、Bcl-2、Fas 和Caspase-3 的表達(dá)水平增加[22]。 本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示,MPP+干預(yù)SH-SY5Y 細(xì)胞 后,Bax、Caspase-3 mRNA 的表達(dá)水平增加,而Bcl-2 mRNA 的表達(dá)減少,而巴馬汀、漢黃芩素、京尼平苷干預(yù)后,細(xì)胞Bax、Caspase-3 mRNA 的表達(dá)水平降低,而Bcl-2 mRNA 的表達(dá)增加。 結(jié)果表明,黃連解毒湯的活性成分能抑制炎癥因子的釋放,減少細(xì)胞凋亡情況。綜上所述,黃連解毒湯的活性成分巴馬汀、漢黃芩素、京尼平苷能有效制炎癥因子的釋放和細(xì)胞凋亡,對帕金森癥腦神經(jīng)細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用,為臨床應(yīng)用提供新的依據(jù)。