徐沛沛趙樹華王江波姚先麗白 金*

(1.鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科,鄭州 450001;2.河南中醫(yī)藥大學(xué)附屬鄭州人民醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科,鄭州 450014)

阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease,AD)多發(fā)于老年人群,是誘導(dǎo)老年人死亡的第五大疾病[1]。過往研究發(fā)現(xiàn),隨著年齡及衰老的發(fā)展,β-淀粉樣蛋白(amyloid β,Aβ)大量積累引起的神經(jīng)炎性反應(yīng)是導(dǎo)致AD 患者神經(jīng)系統(tǒng)損傷及記憶喪失、認(rèn)知障礙及行為改變的主要原因[2]。 近來有研究發(fā)現(xiàn),腦內(nèi)膽固醇失衡,是導(dǎo)致AD 患者Aβ 代謝異常及神經(jīng)炎癥發(fā)生的關(guān)鍵因素之一[3]。 文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn),具有監(jiān)管膽固醇穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子-前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)可在AD 患者的腦脊液中呈異常高表達(dá)[4],且PCSK9的高表達(dá)一方面可通過抑制神經(jīng)元攝取膽固醇而阻斷神經(jīng)元發(fā)育再生[5],另一方面可通過影響β 位點(diǎn)APP 剪切酶1(β-site APP cleaving enzyme 1,BACE1)表達(dá)來引起Aβ 加工及代謝異常,而導(dǎo)致Aβ 積聚及神經(jīng)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[6]。 但引起AD 患者PCSK9 異常變化的基因調(diào)控機(jī)制還不甚清楚。

miRNA 是參與AD 神經(jīng)系統(tǒng)病變的重要調(diào)控因子,大量研究發(fā)現(xiàn),AD 患者Aβ 積聚,與miRNA 的異常表達(dá)關(guān)系密切[7]。 已有文獻(xiàn)顯示,miR-202-5p可通過靶向抑制淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)的3’UTR 端,而降低AD 患者Aβ 沉積引起的神經(jīng)系統(tǒng)損傷[8]。 但AD 患者PCSK9 表達(dá)的升高是否與miR-202-5p 表達(dá)的異常有關(guān)還未見報(bào)導(dǎo)。 本研究建立AD 體內(nèi)外模型,干預(yù)miR-202-5p 及PCSK9 表達(dá)后,對(duì)此進(jìn)行驗(yàn)證探究,以期為AD 的基因靶向治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD 雄性大鼠50 只,體重260～280 g,由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供[SCXK(京)2021-0004]。 所有大鼠均飼養(yǎng)在鄭州大學(xué)(藥物研究院)[SYXK(豫)2018-0004],飼養(yǎng)溫度為22℃～25℃,濕度控制在55%左右。 無菌手術(shù)在鄭州大學(xué)(藥物研究院)進(jìn)行.本實(shí)驗(yàn)經(jīng)鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(20210617-0012),并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R 原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元(Sci-L-0956,上海圻明生物科技有限公司);PCSK9 抑制劑-Aliro(YSRIBIOC4745,上海研生實(shí)業(yè)有限公司);Aβ1-42(A4558,美國Sigma 公司,使用前,將Aβ1-42 肽以200 μmol/L 濃度溶解于無菌雙蒸水中,37℃靜置24 h,14000 r/min、4℃離心10 min 制成可溶性Aβ1-42 寡聚體備用);Aβ42、Aβ40 ELISA 試劑盒(JH-R30135、JHR30130,上海繼和生物科技有限公司);PCSK9 ELISA 試劑盒(EK-M28850,上海酶研生物科技有限公司);腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、磷酸化Tau 蛋白(P-tau)、總膽固醇(TC)ELISA 試 劑 盒 ( FN-AQ-M0183、 E-R-0067、1529384953、EK-R38996,武漢菲恩生物科技有限公司、深圳海思安生物技術(shù)有限公司、上海江萊生物科技有限公司、上海酶研生物科技有限公司);PCSK9、負(fù)責(zé)神經(jīng)元膽固醇攝取相關(guān)因子-LDL 受體相關(guān)蛋白1(LRP-1)、載脂蛋白E(ApoE)及APP、BACE1 等兔抗大鼠抗體均購自英國abcam 公司。FC 酶標(biāo)儀購自ThermoFisher;BX43 光學(xué)顯微鏡購自日本奧林巴斯;Dounce 組織勻漿器購自海德創(chuàng)業(yè)(北京)生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型建立及分組

取大鼠40 只,參照文獻(xiàn)[9]方法,將大鼠麻醉后,經(jīng)側(cè)腦室注射5 μL 濃度為80 μmoL/L 的Aβ1-42,2 d 1 次,連續(xù)8 d,建立大鼠AD 模型,用水迷宮試驗(yàn)檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力,若大鼠出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力下降現(xiàn)象,視為造模成功。 將造模成功大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分模型組、ago-miR-202-5p 組、ago-NC組、PCSK9 抑制劑組,每組10 只,另取10 只大鼠側(cè)腦室注射5 μL 無菌雙蒸水,相同時(shí)間后,作為正常對(duì)照組。 各組于造模成功后開始給藥,ago-miR-202-5p 組及ago-NC 組經(jīng)側(cè)腦室注射5 μL 濃度為25 μmoL/L 的miR-202-5p 激動(dòng)劑(ago-miR-202-5p)及陰性對(duì)照(ago-NC)進(jìn)行干預(yù)治療,3 d 1 次,連續(xù)15 d;PCSK9 抑制劑-Aliro 參照文獻(xiàn)[10]經(jīng)側(cè)腦室注射16 mg/kg 的PCSK9 抑制劑Aliro,3 d 1 次,連續(xù)15 d。 正常對(duì)照組及模型組經(jīng)側(cè)腦室注射等量雙蒸水。

1.3.2 大鼠空間記憶及學(xué)習(xí)能力檢測(cè)

制備水迷宮試驗(yàn)平臺(tái)(直徑為150 cm 的圓形水池,水深60 cm,水溫(23±2)℃,水池分為4 個(gè)象限,第一象限內(nèi)含距水面1～2 cm 的逃生平臺(tái),直徑14 cm,高29 cm)。 將大鼠面朝池壁從第4 象限放入水中,120 s 后未找到平臺(tái)的引導(dǎo)其找到平臺(tái),并讓其在平臺(tái)上停留10 s,進(jìn)行連續(xù)訓(xùn)練5 d,每天訓(xùn)練4次,第6 天用攝像頭記錄大鼠自主找到逃生平臺(tái)的時(shí)間,即逃避潛伏期,逃逸潛伏期越短,預(yù)示其空間記憶能力越強(qiáng)。 撤去水下逃生平臺(tái),將大鼠從第4象限面朝池壁投入池中,并讓其自由游泳120 s,攝像頭記錄統(tǒng)計(jì)大鼠120 s 內(nèi)穿越原平臺(tái)位置的次數(shù),穿越原平臺(tái)次數(shù)越高預(yù)示其空間學(xué)習(xí)能力越好。

1.3.3 ELISA 法檢測(cè)腦脊液及腦皮層組織相關(guān)因子

各組大鼠,斷頭取腦,解剖取腦脊液2 mL,按ELISA 試劑盒方法檢測(cè)PCSK9、Aβ42、Aβ40 及TC水平;剝?nèi)⊥暾X皮層組織,分成兩部分,一部分置于4%多聚甲醛中固定24 h 備用,另一部分剪取約1 g 粉碎研磨后取勻漿液,按ELISA 試劑盒方法檢測(cè)TNF-α、IL-1β、P-tau 水平,剩余腦皮層組織置于-80℃保存。

1.3.4 尼氏及神經(jīng)元核抗原(NeuN)免疫熒光染色法檢測(cè)腦皮層組織神經(jīng)元形態(tài)及數(shù)目變化

將4%多聚甲醛中固定的腦皮層組織,制成厚為5 μm 的石蠟切片,脫蠟、透化及抗原修復(fù)處理后,按尼氏染色液說明書方法染色后,于光鏡下觀察神經(jīng)元形態(tài)變化,滴加1 ∶500 的NeuN 一抗孵育過夜后,用0.5%的驢抗兔二抗IgG 避光孵育處理10 min 后,DAPI 核染10 min,晾干及封片后,光鏡下觀察,Image Pro-Plus 6.0 軟件計(jì)算每視野下單位面積下NeuN 陽性染色神經(jīng)元數(shù)目。

1.3.5 qRT-PCR 法檢測(cè)腦皮層組織miR-202-5p表達(dá)

粉碎腦皮層組織,提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,行PCR 反應(yīng)(反應(yīng)體系:cDNA 1 μL;SYBR GREEN 反 應(yīng) 液5 μL,PCR 引 物 各0.8 μL,H2O 3 μL,反應(yīng)條件:90℃預(yù)變性60 s、1 個(gè)循環(huán),94℃變性10 s、65℃退火60 s、45 個(gè)循環(huán))。 miR-202-5p( 5 ’-GTCACATGCTGGGTCCAACAAA-3 ’, 5 ’-GCGTCCTATGCACTC-3’)以U6 為內(nèi)參用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)水平,引物序列由大連寶生生物公司合成。

1.3.6 Western blot 法檢測(cè)腦皮層組織相關(guān)蛋白表達(dá)

粉碎腦皮層組織,組織勻漿器勻漿得勻漿液,提取蛋白,BCA 法測(cè)定蛋白總濃度,制備濃縮膠及分離膠,取60 μg 蛋白行電泳和轉(zhuǎn)膜反應(yīng),加入1 ∶900 的一抗PCSK9、LRP-1、ApoE、APP、BACE1 抗體,及1 ∶1 200 的內(nèi)參β-actin 抗體,4℃搖床孵育過夜,HRP 羊抗兔二抗室溫孵育40 min,化學(xué)發(fā)光法液顯色后,用以Image J 軟件分析條帶相對(duì)灰度值。

1.3.7 雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)驗(yàn)證miR-202-5p 與PCSK9 的靶向關(guān)系

starbase 網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-202-5p 和PCSK9 的結(jié)合位點(diǎn)。 建立含有miR-202-5p 結(jié)合位點(diǎn)的PCSK9-3’UTR 野生型(WT)和PCSK9-3’UTR 突變型(MUT)片段,克隆至熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒中,Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn) 染 試 劑 將PCSK9-3’ UTR-WT、PCSK9-3’UTR-MUT 熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒,分別與mimic NC 或miR-202-5p mimic 共轉(zhuǎn)染至293 T 細(xì)胞中,48 h 后檢測(cè)熒光素酶活性。

1.3.8 AD 細(xì)胞模型共轉(zhuǎn)染miR-202-5p mimic 及PCSK9 過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA-PCSK9)對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元損傷的影響

取小鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元凍存管,37℃水浴復(fù)蘇后,取適量加入DMEM 培養(yǎng)基(含5%胎牛血清)中進(jìn)行傳代培養(yǎng)及計(jì)數(shù)。 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)良好的神經(jīng)元,按1×108個(gè)/孔的密度接種于6 孔板內(nèi),設(shè)置為空白組、Aβ 誘導(dǎo)組(參照文獻(xiàn)[11]加入終濃度為1 μmol/L 凝聚態(tài)的Aβ1-42 培養(yǎng)1 h 作為AD 細(xì)胞模型)、miR-202-5p mimic 組(在Aβ 誘導(dǎo)組基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染miR-202-5p mimic)、mimic-NC 組(在Aβ 誘導(dǎo)組基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染miR-202-5p mimic 陰性對(duì)照載體-mimic-NC)、miR-202-5p mimic + pcDNA-PCSK9 組(在Aβ 誘導(dǎo)組基礎(chǔ)上共轉(zhuǎn)染miR-202-5p mimic 及pcDNA-PCSK9)、miR-202-5p mimic+pcDNA-NC 組(在Aβ 誘導(dǎo)組基礎(chǔ)上共轉(zhuǎn)染miR-202-5p mimic 及pcDNA-PCSK9 陰性對(duì)照載體-pcDNA-NC),每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔。 空白組加入培養(yǎng)基正常培養(yǎng);Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染,各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后,取細(xì)胞上清液,用ELISA 法檢測(cè)PCSK9、TC、 TNF-α、 IL-1β、 P-tau 水 平; 取 細(xì) 胞 按Honchest33258 染色液說明書方法,染色后于顯微鏡下觀察細(xì)胞核損傷狀況;按1.3.5 及1.3.6 方法測(cè)基因及相關(guān)蛋白表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以SPSS 22.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較進(jìn)行單因素方差分析,進(jìn)一步兩組間比較行snk-q檢驗(yàn),P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 過表達(dá)miR-202-5p 或抑制PCSK9 對(duì)大鼠腦皮層組織miR-202-5p 表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組(1.09±0.10)相比,模型組大鼠腦皮層組織中miR-202-5p 表達(dá)(0.14±0.10)降低(P<0.05)。 與模型組相比,ago-miR-202-5p 組大鼠腦皮層組織中miR-202-5p 表達(dá)(0.81±0.12)升高(P<0.05);PCSK9 抑制劑組(0.11±0.11)、mimic-NC 組(0.12±0.10)大鼠腦皮層組織miR-202-5p 表達(dá)與模型組相比差異不顯著(P>0.05)。

2.2 過表達(dá)miR-202-5p 或抑制PCSK9 對(duì)AD 大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響

與正常對(duì)照組相比,模型組大鼠逃避潛伏期延長(zhǎng),穿越平臺(tái)次數(shù)減少(P<0.05),預(yù)示其空間記憶及學(xué)習(xí)能力降低。 與模型組相比,ago-miR-202-5p 組及PCSK9 抑制劑組大鼠逃避潛伏期縮短,穿越平臺(tái)次數(shù)升高(P<0.05),且ago-miR-202-5p 組對(duì)上述指標(biāo)的改善效果,好于PCSK9 抑制劑組(P<0.05)。 ago-NC組與模型組相比,差異不顯著(P>0.05),見表1。

表1 大鼠平均逃避潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)(±s,n=10)Table1Averageescapelatencyandtimesof crossing the platform in rats

表1 大鼠平均逃避潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)(±s,n=10)Table1Averageescapelatencyandtimesof crossing the platform in rats

注:與正常對(duì)照組相比,*P<0.05;與模型組相比,#P<0.05;與agomiR-202-5p 組相比,△P<0.05。Note. Compared with the normal control group,*P<0.05. Compared with the model group,#P<0.05. Compared with the ago-miR-202-5p group,△P<0.05.

G組ro別ups平均Av逃er l避aagt e e潛n ec伏syc a期pe(s)穿Npu越l a m tf平boer臺(tái)mr s o次f(c數(shù)trioms(es次si n)g)Norm正al常 co對(duì)nt照rol組 group 18.00±1.00 4.86±0.49 Mo模de型l g組roup 36.21±3.64* 1.21±0.31*aga og-omm iRiR-2-0220-25-p5 pg r組oup 26.05±2.57# 3.87±0.46#PCPSCK S9K i9n h抑i b制ito劑r g組roup 29.07±2.26#△ 2.85±0.37#△aga og-oNNCC g r組oup 36.08±3.68△ 1.68±0.48△

2.3 過表達(dá)miR-202-5p 或抑制PCSK9 對(duì)AD 大鼠腦皮層神經(jīng)元形態(tài)變化的影響

正常對(duì)照組大鼠腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常,層次清晰,其數(shù)目為每平方毫米(55.50±5.00)個(gè)。模型組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞體積變小,排列紊亂、核固縮且染色較深、胞體拉長(zhǎng)收縮呈多角形,NeuN 陽性染色的神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目為每平方毫米(30.05±3.00)個(gè),與正常對(duì)照組相比減少(P<0.05)。 agomiR-202-5p 組及PCSK9 抑制劑組大鼠腦皮層神經(jīng)元核固縮、胞體拉長(zhǎng)收縮現(xiàn)象緩解,NeuN 陽性染色的神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目為每平方毫米(49.02±4.10)個(gè)、(40.00±4.00)個(gè),與模型組相比增多,且ago-miR-202-5p 組對(duì)神經(jīng)元損傷的改善作用優(yōu)于PCSK9 組(P<0.05)。 ago-NC 組神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目為每平方毫米(30.20±3.02)個(gè),與模型組相比,神經(jīng)元形態(tài)相近,數(shù)目差異不顯著(P>0.05),見圖1。

圖1 大鼠腦皮層組織尼氏染色及NeuN 免疫熒光染色圖Figure 1 Nissl staining and NeuN immunofluorescence staining of rat cerebral cortex

2.4 過表達(dá)miR-202-5p 或抑制PCSK9 對(duì)AD 大鼠腦脊液中PCSK9、Aβ42、Aβ40、TC 水平的影響

與正常對(duì)照組相比,模型組大鼠腦脊液中PCSK9、Aβ42、Aβ40、TC 水平升高(P<0.05)。 與模型組相比,ago-miR-202-5p 組及PCSK9 抑制劑組大鼠腦脊液中PCSK9、Aβ42、Aβ40、TC 水平降低(P<0.05),且ago-miR-202-5p 組對(duì)上述指標(biāo)的改善效果好于PCSK9 抑制劑組(P< 0.05)。ago-NC 組與模型組相比,上述指標(biāo)差異不顯著(P>0.05),見圖2。

圖2 大鼠腦脊液中PCSK9、Aβ42、Aβ40、TC 水平比較Note. Compared with the normal control group,*P<0.05. Compared with the model group,#P<0.05. Compared with the ago-miR-202-5p group,△P<0.05.Figure 2 Comparison of PCSK9, Aβ42, Aβ40 and TC levels in rat cerebrospinal fluid

2.5 過表達(dá)miR-202-5p 或抑制PCSK9 對(duì)AD 大鼠腦皮層組織中TNF-α、IL-1β、P-tau 水平的影響

與正常對(duì)照組相比,模型組大鼠腦皮層組織中TNF-α、IL-1β、P-tau 水平升高(P<0.05)。 與模型組相比,ago-miR-202-5p 組及PCSK9 抑制劑組大鼠上述指標(biāo)水平降低(P<0.05),且ago-miR-202-5p 組對(duì)上述指標(biāo)的改善效果好于PCSK9 抑制劑組(P<0.05)。 ago-NC 組與模型組相比,上述指標(biāo)差異不顯著(P>0.05),見圖3。

圖3 大鼠腦皮層組織中TNF-α、IL-1β、P-tau 水平比較Note. Compared with the normal control group,*P<0.05. Compared with the model group,#P<0.05. Compared with the ago-miR-202-5p group,△P<0.05.Figure 3 Comparison of TNF-α, IL-1β and P-tau levels in rat cerebral cortex

2.6 過表達(dá)miR-202-5p 或抑制PCSK9 對(duì)AD 大鼠腦皮層組織PCSK9 及下游LRP-1、ApoE、APP、BACE1 蛋白表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組相比,模型組大鼠腦皮層組織中LRP-1、ApoE 表達(dá)降低,PCSK9、APP、BACE1 蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。 與模型組相比,ago-miR-202-5p 組及PCSK9 抑制劑組大鼠腦皮層組織中LRP-1、ApoE 表達(dá)升高,PCSK9、APP、BACE1 蛋白表達(dá)降低(P<0.05),且ago-miR-202-5p 組對(duì)上述指標(biāo)的改善效果好于PCSK9 抑制劑組(P<0.05)。 ago-NC 組與模型組相比,上述指標(biāo)差異不顯著(P>0.05),見圖4。

圖4 大鼠腦皮層組織蛋白表達(dá)水平比較Note. A, Normal control group. B, Model group. C, ago-miR-202-5p group. D, PCSK9 inhibitor group. E, ago-NC group. Compared with the normal control group,*P<0.05. Compared with the model group,#P<0.05. Compared with the ago-miR-202-5p group,△P<0.05.Figure 4 Comparison of protein expression levels in rat cerebral cortex

2.7 miR-202-5p 對(duì)PCSK9 靶向調(diào)控的影響

starbase 網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-202-5p 與PCSK9 存在結(jié)合位點(diǎn)。 雙熒光素酶試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),共轉(zhuǎn)染miR-202-5p mimic 和無突變的PCSK9-WT 載體,可使293 T 細(xì)胞中熒光素酶活性顯著下降(0.98±0.07 vs 0.34±0.04,P<0.01),而共轉(zhuǎn)染miR-202-5p mimic 和發(fā)生突變的PCSK9-MUT 載體對(duì)熒光素酶活性無顯著作用(0.97±0.07 vs 0.93±0.08,P>0.05),見圖5。

圖5 miR-202-5p 和PCSK9 的靶向關(guān)系Figure 5 Targeting relationship between miR-202-5p and PCSK9

2.8 共轉(zhuǎn)染miR-202-5p 及pcDNA-PCSK9 對(duì)AD模型皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞損傷及相應(yīng)水平的影響

Honchest 33258 染色可見,空白組神經(jīng)元細(xì)胞核形態(tài)正常;Aβ 誘導(dǎo)組神經(jīng)元細(xì)胞核不規(guī)則、核膜破裂、核質(zhì)固縮、核仁碎裂呈顆粒狀;miR-202-5p mimic 組及miR-202-5p mimic+pcDNA-NC 組神經(jīng)元細(xì)胞胞膜較完整,細(xì)胞核固縮及損傷較Aβ 誘導(dǎo)組減輕;miR-202-5p mimic+pcDNA-PCSK9 組神經(jīng)元細(xì)胞損傷較miR-202-5p mimic 組加重;mimic-NC 組細(xì)胞損傷與模型組相近,見圖6。

圖6 腦皮質(zhì)神經(jīng)元Honchest33258 染色圖Figure 6 Honchest33258 staining of cerebral cortical neurons

與空白組相比,Aβ 誘導(dǎo)組細(xì)胞上清液中PCSK9、TC、TNF-α、P-tau 水平升高(P<0.05)。 Aβ誘導(dǎo)組相比, miR-202-5p mimic 組、 miR-202-5p mimic+pcDNA-NC 組、miR-202-5p mimic+pcDNAPCSK9 組細(xì)胞上清液中上述水平降低(P<0.05)。與miR-202-5p mimic 組相比,miR-202-5p mimic+pcDNA-PCSK9 組細(xì)胞上清液中各指標(biāo)升高(P<0.05)。 mimic-NC 組與模型組相比,miR-202-5p mimic 組與miR-202-5p mimic+pcDNA-NC 組相比,上述指標(biāo)差異不顯著(P>0.05),見圖7。

圖7 細(xì)胞上清液中PCSK9、TC、TNF-α、P-tau 水平比較Note. Compared with blank group,*P<0.05. Compared with Aβ induction group,#P<0.05. Compared with miR-202-5p mimic group,△P<0.05.Figure 7 Comparison of PCSK9, TC, TNF-α, P-tau levels in cell supernatant

2.9 共轉(zhuǎn)染miR-202-5p 及pcDNA-PCSK9 對(duì)AD模型皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞miR-202-5p/PCSK9 軸及下游蛋白表達(dá)影響

與空白組相比,Aβ 誘導(dǎo)組細(xì)胞上清液中miR-202-5p、LRP-1、ApoE 表達(dá)降低,PCSK9、BACE1 蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。 與Aβ 誘導(dǎo)組相比,miR-202-5p mimic 組、miR-202-5p mimic+pcDNA-NC 組、miR-202-5p mimic+pcDNA-PCSK9 組細(xì)胞miR-202-5p、LRP-1、ApoE 表達(dá)升高,PCSK9、BACE1 蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。 與miR-202-5p mimic 組相比,miR-202-5p mimic+pcDNA-PCSK9 組LRP-1、ApoE 表達(dá)降低,PCSK9、BACE1 蛋白表達(dá)升高(P<0.05),miR-202-5p 表達(dá)差異不顯著(P>0.05)。 mimic-NC 組與模型組相比,miR-202-5p mimic 組與miR-202-5p mimic+pcDNA-NC 組相比,上述指標(biāo)差異不顯著(P>0.05),見圖8。

圖8 腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞蛋白表達(dá)比較Note. A, Blank group. B, Aβ induced group. C, miR-202-5p mimic group. D, miR-202-5p mimic+pcDNA-NC group. E, miR-202-5p mimic+pcDNA-PCSK9 group. F, mimic-NC group. Compared with blank group,*P<0.05. Compared with Aβ induction group,#P<0.05. Compared with miR-202-5p mimic group,△P<0.05.Figure 8 Comparison of protein expression in cerebral cortex neurons

3 討論

隨著社會(huì)老齡化的加重,AD 已成為急需解決的世界難題。 據(jù)美國聯(lián)邦調(diào)查局統(tǒng)計(jì),美國10 年間由于AD 導(dǎo)致的死亡人數(shù)已增加了146.2%;到本世紀(jì)中葉,美國65 歲以上的AD 病人可能增加至1380萬,而中國AD 病人將突破2800 萬,成為世界上AD病人最多的國家[12]。 AD 帶來的不僅是巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),還有死亡的威脅[13]。 故探尋有效的措施防止AD 發(fā)生、減緩AD 發(fā)展進(jìn)程顯得尤為重要。

國際工作組已將腦脊液中Aβ 水平納入AD 診斷指標(biāo)中[14]。 探究Aβ 生成及清除機(jī)制,可能對(duì)逆轉(zhuǎn)AD 患者Aβ 積聚引起的神經(jīng)纖維纏結(jié)、神經(jīng)元炎性損傷及丟失等神經(jīng)系統(tǒng)損傷有重大研究?jī)r(jià)值[15]。大量文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn),AD 發(fā)生時(shí),大量生成的BACE1可裂解并切割A(yù)PP 的671 至672 間肽鍵,并在γ 分泌酶水解條件下生成Aβ40、Aβ42 而發(fā)揮神經(jīng)毒性作用[16]。 本研究經(jīng)腦內(nèi)注射Aβ1-42 發(fā)現(xiàn)大鼠腦脊液中Aβ42、Aβ40 水平、腦皮層組織P-tau、炎癥因子TNF-α、IL-1β 水平均升高的同時(shí),促Aβ42、Aβ40 生成的BACE1 表達(dá)也顯著升高,大鼠表現(xiàn)出神經(jīng)元損傷、丟失及空間記憶及學(xué)習(xí)能力降低,提示造模成功。 Aβ1-42 體外誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡過程中,也檢測(cè)到BACE1 水平的升高,證實(shí)BACE1 切割A(yù)PP 生成的Aβ,可能是AD 發(fā)生的關(guān)鍵因素。

近來研究發(fā)現(xiàn),腦內(nèi)膽固醇變化會(huì)影響Aβ 代謝并導(dǎo)致AD 神經(jīng)變性[17]。 文獻(xiàn)研究報(bào)道發(fā)現(xiàn),膽固醇是腦內(nèi)髓鞘的重要組成部分,可參與神經(jīng)元及突觸發(fā)育、神經(jīng)炎性產(chǎn)生、受損細(xì)胞膜的維持和修復(fù)過程[18]。 但膽固醇不能透過血腦屏障而只能在大腦原位的局部神經(jīng)系統(tǒng)合成[19],而隨著年齡的增長(zhǎng),成年神經(jīng)元會(huì)逐漸失去合成膽固醇的能力,而不得不依賴星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生膽固醇、并將膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至神經(jīng)元[20]。 星形膠質(zhì)細(xì)胞將膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至神經(jīng)元的過程中,必須經(jīng)過ApoE、LRP1 的顆粒轉(zhuǎn)運(yùn)[21-22]。 但AD 患者腦脊液中大量產(chǎn)生的PCSK9可降解ApoE、LRP1,使神經(jīng)元對(duì)膽固醇的攝取吸收減少,而神經(jīng)元膽固醇的消耗增加、攝取吸收減少,勢(shì)必會(huì)導(dǎo)致Aβ 肽代謝及tau 蛋白磷酸化異常而引起神經(jīng)元凋亡[23-24]。 Zhang 等[25]研究發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的膽固醇,不能被神經(jīng)元攝取后,可在臨近脂筏、膜微域中積累,而為不溶性Aβ 片段提供穩(wěn)定的沉積環(huán)境,并進(jìn)一步誘導(dǎo)Aβ 的產(chǎn)生,認(rèn)為膽固醇穩(wěn)態(tài)變化,是影響Aβ 產(chǎn)生的關(guān)鍵因素,這與楊宏艷等[26]膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑加重星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞促BACE1-APP-Aβ 生成及AD 發(fā)展,觀點(diǎn)相一致。PCSK9 是參與膽固醇調(diào)節(jié)的重要因子[27],近來研究發(fā)現(xiàn)AD 患者PCSK9 的大量產(chǎn)生,可能與BACE1 切割A(yù)PP 介導(dǎo)Aβ 生成活性升高有關(guān),認(rèn)為BACE1 大量升高可能刺激PCSK9 的大量產(chǎn)生,來抑制BACE1切割A(yù)PP 并阻斷Aβ 生成來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[28]。但也有研究發(fā)現(xiàn),PCSK9 的產(chǎn)生不僅可誘導(dǎo)Bcl/Bax-Caspase9 凋亡活性的升高來促進(jìn)神經(jīng)凋亡,還可降解并抑制ApoE、LRP1(具有促Aβ 清除、促神經(jīng)元膽固醇攝取)表達(dá),來加速Aβ 生成并阻礙其清除,而參與AD 發(fā)生發(fā)展過程[29-30]。 Xue 等[31]及Abuelezz 等[6]等發(fā)現(xiàn),AD 患者PCSK9 的高度表達(dá),在降低LRP-1 引起神經(jīng)元膽固醇攝取減少及Aβ 清除受損的同時(shí),還誘導(dǎo)TOLL 樣受體4 通路活化而導(dǎo)致炎癥因子TNF-α、IL-1β 分泌,進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元炎性損傷。 本研究也在AD 大鼠腦脊液及體外AD模型細(xì)胞上清液中,檢測(cè)到PCSK9 表達(dá)的升高,皮層組織及神經(jīng)細(xì)胞中ApoE、LRP1 表達(dá)的降低,用PCSK9 抑制劑-Aliro 可明顯抑制PCSK9 升高、ApoE及LRP1 降低,而降低Aβ 生成、發(fā)揮抗AD 神經(jīng)元炎性損傷癥狀,提示干預(yù)PCSK9 表達(dá),可緩解AD過程中Aβ 沉積及神經(jīng)損傷。

miRNA 也是參與AD 患者Aβ 生成、清除及神經(jīng)元損傷的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。 大量文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn),多種miRNA 可通過抑制BACE1 或APP 的產(chǎn)生,而抑制Aβ 沉積及AD 神經(jīng)損傷[32]。 miRNA 中的miR-202-5p 可作為抑癌基因而參與乳腺癌、前列腺癌、口腔癌等腫瘤細(xì)胞異常增殖過程,近來研究發(fā)現(xiàn),在腦缺血及神經(jīng)元應(yīng)激性凋亡過程中,miR-202-5p表達(dá)也異常降低,并認(rèn)為miR-202-5p 異常表達(dá)也參與神經(jīng)系統(tǒng)損傷過程[33]。 Dong 等[8]發(fā)現(xiàn)miR-202-5p 在AD 患者血清中表達(dá)降低,且miR-202-5p 與APP 的3’UTR 端有靶向結(jié)合位點(diǎn),并認(rèn)為miR-202-5p 發(fā)揮抗AD 作用,可能與靶向抑制APP 表達(dá)而阻斷Aβ 生成有關(guān)。 但miRNA 可通過調(diào)節(jié)多個(gè)靶蛋白發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng),miR-202-5p 的抗AD 作用,除APP 外還可能通過其他靶蛋白發(fā)揮作用。 本研究發(fā)現(xiàn),miR-202-5p 也與PCSK9 之間存在靶向結(jié)合位點(diǎn),過表達(dá)miR-202-5p 可通過抑制PCSK9 表達(dá)來上調(diào)ApoE、LRP1 表達(dá),發(fā)揮抗胞外膽固醇分泌、抗Aβ 生成及AD 神經(jīng)炎性損傷作用。 上調(diào)PCSK9 表達(dá)后,可部分減弱miR-202-5p 的抗Aβ 生成及神經(jīng)炎性因子分泌作用。

綜上所述,過表達(dá)miR-202-5p 可通過抑制PCSK9 活化抑制Aβ 生成并促進(jìn)LRP-1/ApoE 介導(dǎo)的促膽固醇攝取及Aβ 清除,進(jìn)而發(fā)揮抗AD 神經(jīng)損傷作用。 這為AD 的基因靶向治療提供一定參考。但PCSK9 與BACE1-Aβ 生成途徑的調(diào)控關(guān)系還存在爭(zhēng)議較多,ApoE-LRP1 促膽固醇攝取及Aβ 清除作用盲點(diǎn)也較多,這需進(jìn)一步深入研究。