王厚融劉志鳳于天源*張英琦焦 誼劉 迪徐亞靜官 乾

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院,北京 102488;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院,北京 100078)

神經(jīng)病理性疼痛是由軀體感覺系統(tǒng)損傷或疾病導(dǎo)致的疼痛[1],基于損傷或疾病位置可分為中樞型和周圍型(peripherally-induced neuropathic pain,pNP),其中pNP 臨床較常見[2]。 pNP 診斷困難、癥狀嚴(yán)重、機(jī)制復(fù)雜,現(xiàn)尚無有效的治療手段,臨床上pNP 完全緩解率低于20%[3-4]。 由于臨床研究獲取信息有限,pNP 的機(jī)制探索、藥物研發(fā)基本全部來自于嚙齒動(dòng)物實(shí)驗(yàn),其中慢性壓迫性神經(jīng)損傷模型(chronic constriction injury,CCI)是科學(xué)研究中最常應(yīng)用的動(dòng)物模型[5]。 但經(jīng)典CCI 模型程度重,不適合干預(yù)早期、短期干預(yù)等科學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),所以演變出聚乙烯軟管束縛代替結(jié)扎[6]、硅膠環(huán)擠壓代替結(jié)扎[7]、普通非吸收縫合絲線代替鉻制可吸收腸線[8]、分級(jí)CCI 模型(graded CCI model)[9-10]等不同的造模方式。 本實(shí)驗(yàn)對(duì)SD 大鼠常用的Minor CCI模型和經(jīng)典CCI 模型疼痛表現(xiàn)和成模特點(diǎn)進(jìn)行研究,以期為不同類型的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)模型選擇提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8 周齡SPF 級(jí)SD 雄性大鼠18 只,體重(200±10)g,購于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2019-0010],飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(京)2020-0033],3 只/籠,飼料由北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。 本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過北京中醫(yī)藥大學(xué)IACUC 的批準(zhǔn)(BUCM-4-2020111103-4087),并在操作過程中按照3R 原則給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物充分的人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

動(dòng)物用異氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司,規(guī)格R510-22-10);戊巴比妥鈉(西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司,CAS:57-33-0);電鏡固定液(武漢賽維爾生物科技有限公司,規(guī)格G1102)?？晌招酝饪瓶p線(山東博達(dá)醫(yī)療用品股份有限公司,規(guī)格鉻制4-0);電子天平(美國雙杰(兄弟)集團(tuán)有限公司,TCA 6 kg/1 g);電子機(jī)械測痛儀(深圳市瑞沃德生命科技有限公司,型號(hào)BIO-EVF5);熱刺痛儀(成都泰盟軟件有限公司,型號(hào)PL-200);超薄切片機(jī)(徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司,型號(hào)EM UC-7)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)

SD 大鼠購入后置于室溫(25±1)℃,相對(duì)濕度(50±5)%的飼養(yǎng)室內(nèi),適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后開始正式實(shí)驗(yàn),期間每日實(shí)驗(yàn)人員與大鼠進(jìn)行接觸(daily handling),使大鼠熟悉實(shí)驗(yàn)人員,減少行為學(xué)應(yīng)激反應(yīng),最大程度確保痛覺測試的真實(shí)性。

1.3.2 痛覺均一篩選

適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后,所有動(dòng)物進(jìn)行痛覺均一篩選,痛覺敏感或遲鈍的動(dòng)物從本實(shí)驗(yàn)排除。 痛覺均一篩選使用機(jī)械縮足反射閾值和熱縮足反射潛伏期兩種方法進(jìn)行。

機(jī)械縮足反射閾值(mechanical withdrawal treshold,MWT):評(píng)估大鼠機(jī)械痛敏變化。 使用電子機(jī)械測痛儀,設(shè)置單位為g。 將刺激探頭對(duì)準(zhǔn)后足底面測試部位,開始刺激。 逐漸、穩(wěn)定增加刺激量,待大鼠出現(xiàn)縮足、舔足時(shí),記錄數(shù)值。

熱縮足反射潛伏期(thermal withdrawal latency,TWL):評(píng)估大鼠溫度痛敏變化。 使用熱刺痛儀,設(shè)置參數(shù)為intensity 50%,cut off 30 s。 將紅外熱源對(duì)準(zhǔn)后足底面測試部位,開始刺激。 待動(dòng)物出現(xiàn)縮足、舔足時(shí),記錄數(shù)值。 如因大鼠走動(dòng)或梳理動(dòng)作使記錄停止,間隔10 min 再測量一次。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

痛覺均一篩選合格的18 只SD 大鼠,采用隨機(jī)數(shù)組表法隨機(jī)分為3 組,假手術(shù)組、Minor CCI 組、經(jīng)典CCI 組,每組各6 只。

1.3.4 模型建立

模型制備方法同前人所述進(jìn)行[5,9],包含一些細(xì)節(jié)變化,如下所述:SD 大鼠通過氣體麻醉,待角膜反射消失;俯臥位固定在鼠板,右側(cè)髖股交界區(qū)剃毛,碘伏消毒;右側(cè)下肢墊一棉墊,沿右側(cè)坐骨神經(jīng)干體表投影切2 cm 切口,鈍性分離,暴露坐骨神經(jīng)干;用鉻制4-0 可吸收性外科縫線松散的在坐骨神經(jīng)干上結(jié)扎,每個(gè)線結(jié)間距1 mm;結(jié)扎力度以不影響神經(jīng)外膜血流、結(jié)扎線結(jié)可在神經(jīng)干上滑動(dòng)、不出現(xiàn)腿部肌肉顫動(dòng)為宜;其中假手術(shù)組僅暴露神經(jīng)不結(jié)扎,Minor CCI 組在坐骨神經(jīng)上結(jié)扎1 根線結(jié),經(jīng)典CCI 組在坐骨神經(jīng)上結(jié)扎4 根線結(jié);逐層縫合;待大鼠蘇醒后,轉(zhuǎn)移至飼養(yǎng)室。

1.3.5 行為學(xué)檢測

環(huán)境參數(shù)設(shè)置:行為學(xué)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室室溫及相對(duì)濕度與飼養(yǎng)室保持一致。

測試時(shí)間點(diǎn):造模前、造模后7、14、21、28 d。

全部測試均由同一實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行以保證測試結(jié)果的準(zhǔn)確、均一、可比。 在正式測試開始前20 min將動(dòng)物放入測試環(huán)境內(nèi)。 待探索行為和梳理毛發(fā)行為停止,大鼠的狀態(tài)靜止、放松時(shí)進(jìn)行測試。 每足測試3 次,固定相同位置(圖1)進(jìn)行測試,每次測試間隔10 min,取3 次測試的平均值。

圖1 行為學(xué)測定點(diǎn)Figure 1 Behavioral measurement site

MWT:操作見1.3.2。TWL:操作見1.3.2。

累積疼痛評(píng)分(accumulated pain score,APS):評(píng)估大鼠痛覺強(qiáng)度。 將大鼠放在測試籠內(nèi),底部為玻璃板,輕敲籠子邊緣使大鼠移動(dòng),觀察右后足的情況。 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為右后足不著地,計(jì)2 分;右后足著地不負(fù)重,計(jì)1 分;右后足著地且負(fù)重,計(jì)0 分。 后足部皮膚由粉變白判斷為負(fù)重。

1.3.6 透射電鏡觀察

最后一次行為學(xué)測試結(jié)束后,大鼠稱重,用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉處死;為避免血液污染樣本,先腹主動(dòng)脈取血5～7 mL;再取坐骨神經(jīng)干段,電鏡液中-4℃保存;經(jīng)過固定、脫水、滲透、包埋、聚合后,橫切60 nm 厚片,染色后透射電鏡觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。 所有數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較使用單因素方差分析,當(dāng)P<0.05 時(shí),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為表現(xiàn)變化

各組大鼠行為表現(xiàn)變化見表1。 假手術(shù)組大鼠精神正常;被毛順滑、有光澤;右后足形態(tài)正常;趾甲正常(圖2A);站立、行走、休息時(shí)姿勢正常;大便正常;手術(shù)切口恢復(fù)良好。

表1 各組大鼠行為表現(xiàn)變化Table 1 Behavioral performance changes in each group

Minor CCI 組大鼠精神正常;被毛較順滑、偶見脫毛;右后足外翻、微屈,形成隆起;偶見啃噬趾甲現(xiàn)象(圖2B);站立時(shí)可見右足跟骨部負(fù)重,能維持站立姿勢;行走時(shí)可見跛行;休息時(shí)右側(cè)足不負(fù)重,偶見左側(cè)臥位或右足尖著地;大便正常;手術(shù)切口恢復(fù)良好。

經(jīng)典CCI 組大鼠可見煩躁不安;被毛凌亂、無光澤,可見脫毛;右后足外翻、蜷縮,似“握拳”狀;可見自殘現(xiàn)象,啃噬趾甲、趾骨,局部出現(xiàn)紅、腫、熱、流血等(圖2C);不喜站立姿勢,站立時(shí)右足抬起、常見跌倒,難以維持站立姿勢;行走時(shí)跛行;休息時(shí)呈腰部以下左側(cè)臥位、右足抬起不著地;可見大便色黑質(zhì)干;手術(shù)切口恢復(fù)良好。

圖2 右后足自殘現(xiàn)象Note. A, Sham group. B, Minor CCI group. C, Classic CCI group.Figure 2 Self-mutilation phenomenon of the right hind paw

2.2 大鼠痛覺變化

2.2.1 MWT 結(jié)果

如圖3 所示,造模前,3 組大鼠結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),可以進(jìn)行后續(xù)比較。 造模后7 d,與假手術(shù)組相比,Minor CCI 組和經(jīng)典CCI 組MWT 顯著下降(P<0.05),說明模型制備成功,Minor CCI 組與經(jīng)典CCI 組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 造模后14、21、28 d,與假手術(shù)組相比,Minor CCI 組和經(jīng)典CCI 組MWT 均顯著下降(P<0.05),Minor CCI 組與經(jīng)典CCI 組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),說明模型制備時(shí),Minor CCI 與經(jīng)典CCI 造模方法所形成的機(jī)械痛覺敏化趨勢、程度基本一致,無差別。

圖3 機(jī)械縮足反射閾值結(jié)果Note. Compared with the sham group,#P<0.05.Figure 3 Results of mechanical withdrawal threshold

2.2.2 TWL 結(jié)果

如圖4 所示,造模前,3 組大鼠結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),可以進(jìn)行后續(xù)比較。 造模后7 d,與假手術(shù)組相比,Minor CCI 組和經(jīng)典CCI 組TWL 顯著下降(P<0.05),說明模型制備成功,Minor CCI 組與經(jīng)典CCI 組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 造模后14、21 d,與假手術(shù)組相比,Minor CCI 組和經(jīng)典CCI組TWL 均顯著下降(P<0.05),Minor CCI 組與經(jīng)典CCI 組比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 造模后28 d,與假手術(shù)組相比,Minor CCI 組和經(jīng)典CCI 組TWL顯著下降(P<0.05),Minor CCI 組與經(jīng)典CCI 組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),說明模型制備時(shí),Minor CCI 與經(jīng)典CCI 造模方法所形成的溫度痛覺敏化程度基本一致,無差別,但在造模后28 d 時(shí),Minor CCI組呈現(xiàn)恢復(fù)趨勢。

圖4 熱縮足反射潛伏期結(jié)果Note. Compared with the sham group,#P<0.05. Compared with the Minor CCI group,*P<0.05.Figure 4 Results of thermal withdrawal latency

2.2.3 APS 結(jié)果

如圖5 所示,造模前,3 組大鼠結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),可以進(jìn)行后續(xù)比較。 造模后7 d,與假手術(shù)組相比,Minor CCI 組和經(jīng)典CCI 組APS 顯著下降(P<0.05),說明模型制備成功,Minor CCI 組與經(jīng)典CCI 組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。 造模后14 d,與假手術(shù)組相比,Minor CCI 組和經(jīng)典CCI 組APS 顯著下降(P<0.05),Minor CCI 組與經(jīng)典CCI組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 造模后21、28 d,與假手術(shù)組相比,Minor CCI 組和經(jīng)典CCI 組APS均顯著下降(P<0.05),Minor CCI 組與經(jīng)典CCI 組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),說明模型制備時(shí),Minor CCI 與經(jīng)典CCI 造模方法所形成的疼痛強(qiáng)度趨勢基本一致,但Minor CCI 組較經(jīng)典CCI 組輕。

2.3 坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)變化

Minor CCI 組(圖6A、圖6B):可見坐骨神經(jīng)干大部分髓鞘結(jié)構(gòu)已經(jīng)破壞,出現(xiàn)中度、重度崩脫,扭曲形成漩渦狀或髓鞘球。 板層間隙疏松,軸索萎縮,線粒體呈空泡樣變,可見少量自噬體形成。

經(jīng)典CCI 組(圖6C、圖6D):可見坐骨神經(jīng)干大部分髓鞘結(jié)構(gòu)已經(jīng)破壞,出現(xiàn)重度崩脫,扭曲形成漩渦狀或髓鞘球,甚至空泡樣變性。 板層間隙疏松,偶見絮狀細(xì)胞骨架,軸索萎縮,線粒體呈空泡樣變,可見自噬體形成。

圖6 坐骨神經(jīng)線結(jié)結(jié)扎與超微結(jié)構(gòu)變化Note. A/B, Minor CCI group. C/D, Classic CCI group. Green arrows, Autophagosome. Red arrows, Myelin sphere.Figure 6 Sciatic nerve chromic gut ligation and ultrastructural changes

3 討論

不同干預(yù)手段、不同實(shí)驗(yàn)周期應(yīng)選擇相應(yīng)的pNP 動(dòng)物模型。 近年來,國內(nèi)外對(duì)于pNP 動(dòng)物模型的研究有諸多報(bào)道,研究發(fā)現(xiàn)不同部位、方法、力度等因素對(duì)成模程度、癥狀持續(xù)時(shí)間、行為指標(biāo)等有較大影響[11]。 因此,對(duì)于科研人員而言,針對(duì)不同干預(yù)手段、不同實(shí)驗(yàn)周期選擇適合的pNP 動(dòng)物模型,了解不同模型的成模特點(diǎn)、癥狀表現(xiàn)規(guī)律對(duì)于減少實(shí)驗(yàn)偏倚、得出真實(shí)結(jié)論有重要的輔助意義。

本研究比較了Minor CCI 模型和經(jīng)典CCI 模型的成模特點(diǎn)及疼痛表現(xiàn)情況,除坐骨神經(jīng)結(jié)扎鉻制可吸收外科縫線數(shù)量不同外,其余研究因素均相同。 經(jīng)典CCI 模型是1988 年,由Bennett 等[5]創(chuàng)立發(fā)明的一種神經(jīng)病理性痛和炎性痛的復(fù)合疼痛模型,此造模方法能在不損傷神經(jīng)完整性的情況下較好的模擬臨床pNP,得到科研人員的認(rèn)可,廣泛用于pNP 的科學(xué)研究中。 經(jīng)典CCI 模型制備原理是使用4 根規(guī)格4-0 鉻制可吸收性外科縫線在坐骨神經(jīng)干進(jìn)行結(jié)扎,每根線結(jié)間隔1 mm。 結(jié)扎對(duì)神經(jīng)干產(chǎn)生持續(xù)性、慢性的壓迫和束縛,同時(shí)線結(jié)逐漸膨脹,導(dǎo)致坐骨神經(jīng)內(nèi)水腫,水腫的神經(jīng)進(jìn)一步與線結(jié)產(chǎn)生對(duì)抗,逐漸形成神經(jīng)自我縮窄,結(jié)扎遠(yuǎn)端神經(jīng)纖維出現(xiàn)脫髓鞘改變,部分變性、壞死,形成神經(jīng)病理性疼痛。

不同材質(zhì)線材誘導(dǎo)的疼痛特點(diǎn)不同。 由于鉻制可吸收外科縫線線材硬度高、產(chǎn)量減小[12]等因素出現(xiàn)造模時(shí)結(jié)扎力度不均等不良影響,在科研實(shí)踐中逐漸演變出多種線材替代方案。 部分研究人員使用普通醫(yī)用絲線代替鉻制線,但普通絲線無膨脹系數(shù),不能對(duì)神經(jīng)干產(chǎn)生持續(xù)、過度壓迫,雖能誘發(fā)與鉻制線相同的機(jī)械痛敏癥狀,但溫度痛敏程度較鉻制可吸收外科縫線低[8,13]。 聚乙烯軟管在造模過程中使用方便,造模耗時(shí)最短,最初為誘導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)化pNP 而發(fā)明[6]。 但聚乙烯軟管在實(shí)際應(yīng)用過程中容易脫落或半脫落導(dǎo)致造模失敗,同時(shí)聚乙烯軟管對(duì)神經(jīng)的壓迫力度不如普通絲線和鉻制線,痛敏程度較低。 鉻制可吸收外科縫線制作過程使用鉻溶液,提高了線材的強(qiáng)度、韌性和抗機(jī)體吸收能力[14]。同時(shí),鉻溶液含有多種外源性致炎因子,分解時(shí)需要蛋白水解酶參與,可在局部形成類似“敏化-炎癥雞尾酒”微環(huán)境[15],形成炎癥病理性疼痛。 與坐骨神經(jīng)縮窄出現(xiàn)的神經(jīng)病理性疼痛結(jié)合,誘導(dǎo)機(jī)械痛敏、溫度痛敏等與臨床pNP 相似的自發(fā)性疼痛、痛敏、超敏、觸誘發(fā)痛等癥狀。 因此,經(jīng)典CCI 模型的這類造模方法結(jié)合鉻制可吸收線材是最佳模擬臨床pNP 的動(dòng)物模型制備方法。

Minor CCI 模型和經(jīng)典CCI 模型是最常用的分級(jí)CCI 模型。 分級(jí)CCI 模型是從經(jīng)典CCI 模型發(fā)展而來[9],保留了經(jīng)典CCI 模型的優(yōu)點(diǎn),將結(jié)扎數(shù)量分為1 根、2 根、3 根等,其中Minor CCI 模型結(jié)扎1 根、經(jīng)典CCI 模型結(jié)扎4 根。 經(jīng)典CCI 模型造模方法對(duì)于結(jié)扎力度的描述包括“松散地綁”“神經(jīng)直徑幾乎沒有收縮”“不阻礙神經(jīng)外膜血管系統(tǒng)循環(huán)”“有時(shí)在周圍肌肉中產(chǎn)生一個(gè)小而短暫的抽搐”等。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道和前期實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn),結(jié)扎緊、力度中會(huì)引起周圍肌肉的顫動(dòng)和抽搐,進(jìn)而導(dǎo)致成模后期動(dòng)物自殘行為增加,造模側(cè)肢體麻木,影響行為學(xué)指標(biāo)的準(zhǔn)確性[13]。 因此,本研究要求在結(jié)扎過程中不出現(xiàn)任何周圍肌肉顫動(dòng)。

本研究中雖已經(jīng)保證結(jié)扎操作過程中未出現(xiàn)結(jié)扎過度、周圍肌肉顫動(dòng)情況,但經(jīng)典CCI 組動(dòng)物仍表現(xiàn)出部分肢體自殘現(xiàn)象,包括啃噬足趾,輕者啃噬趾甲,重者部分足趾或半足缺失,導(dǎo)致造模側(cè)后足皮膚色紅、局部腫脹、皮溫升高、活動(dòng)后出血。MWT 用于評(píng)估大鼠的機(jī)械觸覺痛敏變化情況,TWL用于評(píng)估大鼠溫度覺痛敏變化情況,APS 用于評(píng)估大鼠的痛覺強(qiáng)度、站立姿勢、休息姿勢等變化情況。劉永達(dá)等[16]按照經(jīng)典CCI 造模方法建立模型,通過MWT 測試發(fā)現(xiàn)造模后出現(xiàn)痛敏表現(xiàn),造模后3 d 模型建立成功,至造模后7 d 痛敏程度持續(xù)增加。 本研究中造模后經(jīng)典CCI 組出現(xiàn)痛覺過敏表現(xiàn),測試過程極難進(jìn)入安靜、放松狀態(tài),測試穩(wěn)定性較差。MWT、TWL 均降低,APS 評(píng)分升高。 造模后7 d 成模,造模后14 d 進(jìn)入痛敏癥狀平臺(tái)期,穩(wěn)定至造模后28 d,其中TWL 和APS 表現(xiàn)出敏化程度加重趨勢。 坐骨神經(jīng)超電鏡觀察到髓鞘結(jié)構(gòu)破壞,髓鞘球形成,軸索萎縮、線粒體空泡樣變,自噬體形成等。均與文獻(xiàn)報(bào)道一致[16-18]。 Minor CCI 組僅少數(shù)動(dòng)物出現(xiàn)啃噬指甲現(xiàn)象,但無一例流血,造模側(cè)足皮膚顏色正常。 行為學(xué)測試方面,Minor CCI 組造模后出現(xiàn)痛覺過敏表現(xiàn),動(dòng)物能較快進(jìn)入靜止、放松的狀態(tài)。 MWT、TWL 均降低,與經(jīng)典CCI 組痛敏癥狀程度相當(dāng),Minor CCI 組APS 評(píng)分升高,但程度較經(jīng)典CCI 組低。 造模后7 d 成模,造模后14 d 進(jìn)入平臺(tái)期,約10 d 后,各項(xiàng)痛敏癥狀開始逐漸恢復(fù)。 Minor CCI 組與經(jīng)典CCI 組的坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)無差異,觀察到相似改變。

綜上所述,Minor CCI 造模方法能更好的模擬臨床pNP 癥狀表現(xiàn),同時(shí)成模更穩(wěn)定,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物受到的痛苦更少,適合短期的科研實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。 經(jīng)典CCI造模方法成模程度較重,行為學(xué)結(jié)果穩(wěn)定性偏低,適合中長期的科研實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。 本研究為pNP 等慢性疼痛疾病科學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中,選擇符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利規(guī)范的、穩(wěn)定且可重復(fù)的、與臨床相似且可調(diào)整的動(dòng)物模型提供參考依據(jù)。