周 瑜賈 靜王 璐周 敏

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科,四川 瀘州 646000)

缺血再灌注(ischemia reperfusion,I/R)損傷是與高發(fā)病率和死亡率相關(guān)的常見病理過程,常繼發(fā)于多種嚴(yán)重疾病[1]。 I/R 損傷的發(fā)病機(jī)制是多因素的,包括過度的炎性細(xì)胞因子釋放、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡[2-3]。 腸道I/R 可能導(dǎo)致腸道屏障功能受損,腸道通透性增加和腸道菌群易位,導(dǎo)致嚴(yán)重的局部和全身炎癥和多器官功能障礙綜合征[4]。 右美托咪定(dexmedetomidine,DEX)是一種具有鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛特性的α2-腎上腺素受體激動(dòng)劑。 最近,DEX 已被鑒定為對(duì)多個(gè)器官的I/R 損傷具有保護(hù)潛力[5-6]。 研究發(fā)現(xiàn),DEX 可以保持腸道結(jié)構(gòu)完整性并賦予腸道保護(hù)免受I/R 損傷[7]。 然而,關(guān)于其潛在的機(jī)制仍然很大程度上未知。 microRNA(miRNA)作為一種小的非編碼RNA,通過抑制靶mRNA 的翻譯或穩(wěn)定來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后翻譯[8]。 最近,一項(xiàng)研究報(bào)道m(xù)iR-146a 通過與IRAK1 的3’UTR 結(jié)合,可以抑制炎癥細(xì)胞浸潤,從而保護(hù)腎組織免受I/R 損傷[9]。 在腸道I/R 損傷方面,miR-146a 可通過調(diào)節(jié)自噬抑制腸上皮細(xì)胞凋亡,減輕I/R 過程中的腸道損傷[10]。 值得注意的是,最近兩項(xiàng)研究報(bào)道了DEX 通過靶向miR-146a 參與肺部和心臟保護(hù)[11-12]。 因此我們假設(shè)在腸道中,miR-146a 也可能在DEX 對(duì)I/R 損傷的保護(hù)功能中發(fā)揮作用,并旨在通過體內(nèi)和體外研究評(píng)估它們之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

24 只SPF 級(jí)雄性SD 大鼠(體重200～220 g)購自北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2019-0004]。 大鼠喂養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(川)2018-0003],實(shí)驗(yàn)前2 周使大鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室條件((23±2)℃、12 h/12 h 光照/黑暗、(50±5)%濕度、隨意獲取食物和水)。 每籠飼養(yǎng)一只大鼠,實(shí)驗(yàn)前禁食12 h。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(XNYKLY-2021-016),并嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R 原則。

IEC-6 細(xì)胞(大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞)獲自上海生命科學(xué)研究院,接種在含有5%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和1%非必需氨基的Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM,美國Gibco 公司)中培養(yǎng)。 每2～3 d 更換1 次培養(yǎng)基,培養(yǎng)物保持在37℃含有5% CO2的飽和濕度環(huán)境中。

1.2 主要試劑與儀器

Hanks 平衡鹽溶液購自美國Gibco 公司;MTT試劑、Sirt6、HRP 偶聯(lián)的二抗購自美國Abcam 公司;TUNEL 染色檢測(cè)試劑盒購自德國Roche 公司;兔抗LC3 單克隆抗體購自武漢Proteintech 公司;TRIzol、lipofectamine 試劑購自美國 Invitrogen 公司;TransStart Top Green qPCR SuperMix 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;SYBRTMSelect Master Mix 購自美國Thermo 公司;PVDF 膜購自美國Millipore 公司;β-actin 購自美國CST 公司;miR-146a 抑制劑Opti-MEM 購自美國Ambion 公司。

DM4000B 光學(xué)顯微鏡購自德國Leica 公司,熒光顯微鏡購自日本Olympus 公司;RS232C 核酸測(cè)定儀購自德國Eppendorf 公司;7500 快速實(shí)時(shí)熒光定量PCR 系統(tǒng)購自美國Applied Biosystems 公司;ChemiDoc XRS 購自美國Bio-Rad 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞氧-葡萄糖剝奪/復(fù)氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)模型和藥物治療

將IEC-6 細(xì)胞(每毫升5×103個(gè))接種在96 孔板中,當(dāng)80%匯合時(shí),細(xì)胞加入DEX(0.5、1、2 μmol/L)處理1 h。 之后,將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為不含葡萄糖的Hanks 平衡鹽溶液,并在37℃的加濕培養(yǎng)箱(1% O2、94% N2和5% CO2)中孵育4 h 模擬缺氧條件。 4 h 后,將培養(yǎng)基換回標(biāo)準(zhǔn)DMEM 培養(yǎng)基并在常氧環(huán)境下再維持2 h 來模擬復(fù)氧期[13]。 在沒有藥物處理的標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)的細(xì)胞用作對(duì)照。

為了考察miR-146a 抑制對(duì)DEX 保護(hù)作用的影響,將細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為:Con 組、OGD/R 組、OGD/R+DEX 組、OGD/R+miR-146a 抑制劑組和OGD/R+DEX+miR-146a 抑制劑組。 除Con 組外,其他組建立OGD/R 模型。 OGD/R+miR-146a 抑制劑組和OGD/R+DEX+miR-146a 抑制劑組在建立OGD/R模型前,加入miR-146a 抑制劑處理24 h。

1.3.2 細(xì)胞活力測(cè)定

建立健全科學(xué)的施工責(zé)任制度是保證工程建設(shè)順利性的重要基礎(chǔ)。在實(shí)際建設(shè)時(shí)要建立起來相應(yīng)的施工責(zé)任制度，這樣能夠有效提升施工安全管理水平。施工責(zé)任制度就是企業(yè)當(dāng)中各個(gè)崗位責(zé)任制度之中的重要內(nèi)容，它的有效落實(shí)能夠推動(dòng)建筑行業(yè)的有序發(fā)展。具體來說就是要求施工現(xiàn)場(chǎng)的每一個(gè)人員都要明確自身的責(zé)任，使彼此之間能夠相互配合、協(xié)調(diào)工作，確保安全管理工作能夠落實(shí)到位。圖1是施工現(xiàn)場(chǎng)安全管理組織流程圖。

使用3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑噻唑藍(lán)(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)測(cè)定法評(píng)估細(xì)胞活力。 在不同的時(shí)間點(diǎn)將MTT 試劑添加到每個(gè)孔中。 在37℃下用MTT 溶劑處理細(xì)胞3 h,并在OD 590 nm 處測(cè)量吸光度。

1.3.3 動(dòng)物分組治療

動(dòng)物被隨機(jī)分配到3 組,包括假手術(shù)組(Sham)、I/R 組和DEX 組,每組8 只大鼠。 I/R 組和DEX 組大鼠參照文獻(xiàn)方法[14]建立大鼠腸道I/R模型,具體操作為大鼠用異氟醚吸入麻醉。 中線剖腹探查后,夾住腸系膜上動(dòng)脈并在1 h 后再灌注。DEX 組大鼠在缺血前30 min 以腹腔注射25 μg/kg DEX 藥物治療[14],和I/R 組注射0.9%生理鹽水治療。 Sham 組接受相同的麻醉和中線剖腹手術(shù),但不夾住腸系膜上動(dòng)脈。 再灌注后6 h 處死所有動(dòng)物,取出腸組織進(jìn)行生化分析。

1.3.4 組織病理學(xué)檢查大鼠腸組織用4%多聚甲醛固定,石蠟切片用蘇木精-伊紅(HE)溶液染色。 最后,通過DM4000B光學(xué)顯微鏡獲得染色圖像。 根據(jù)Chiu’s 評(píng)分[14]評(píng)估不同組的相對(duì)腸損傷程度。

1.3.5 TdT 介導(dǎo)的dUTP 缺口末端標(biāo)記(TdTmediated dUTP Nick-End Labeling,TUNEL)分析

采用TUNEL 染色檢測(cè)試劑盒進(jìn)行TUNEL 分析。 收集對(duì)數(shù)期的IEC-6 細(xì)胞并以每毫升1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種在24 孔板中。 將濃度為2 μmol/L的DEX 加入細(xì)胞中預(yù)處理12 h。 OGD/R 損傷后,用PBS 清洗細(xì)胞,在12 孔板中加入10%甲醛固定20 min。 然后用PBS 沖洗3 次,用0.5% Triton-100滲透細(xì)胞10 min。 此外,為了檢測(cè)體內(nèi)細(xì)胞凋亡,石蠟組織切片用二甲苯和不同梯度的乙醇脫蠟至水合。 PBS 沖洗3 次后,將細(xì)胞或組織切片加入100 μL(10 μL TdT + 95 μL 熒光素標(biāo)記的dUTP 溶液)TUNEL 混合液中,在37℃濕暗箱中孵育1 h。陰性對(duì)照(Con)組加入100 μL 熒光素標(biāo)記的dUTP溶液。 最后,使用熒光顯微鏡以200 倍放大倍率捕獲圖像。

1.3.6 免疫熒光測(cè)定

將腸組織切片水合并在檸檬酸鹽緩沖液中孵育,用于脫蠟后的抗原修復(fù)。 然后將樣品在室溫下用3% BSA 非特異性封閉2 h,在4℃濕暗箱中用兔抗LC3 單克隆抗體(稀釋比1 ∶100)孵育過夜。 用PBS 清洗3 次后,將切片與Alexa 熒光素標(biāo)記的二抗孵育1 h,然后在37℃下用DAPI 溶液(5 μg/mL)染色10 min。 最后,通過熒光顯微鏡以200 倍放大率獲得免疫熒光圖像。 對(duì)于細(xì)胞分析,將IEC-6 細(xì)胞(每毫升1×105個(gè)細(xì)胞)接種在24 孔板中,然后用2 μmol/L 的DEX 預(yù)處理12 h。 接下來,細(xì)胞用4%多聚甲醛固定20 min,OGD/R 損傷后用0.5%Triton-100 沖洗10 min。 最后,將細(xì)胞與兔抗LC3 一起孵育,其余步驟與大鼠樣品相同。

1.3.7 定量實(shí)時(shí)PCR 檢測(cè)

使用TRIzol 試劑從IEC-6 細(xì)胞和大鼠腸組織中分離總RNA,并使用RS232C 核酸測(cè)定儀測(cè)定總RNA 的濃度。 然后使用TransStart Top Green qPCR SuperMix 將總共1000 ng RNA 被逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,并使用SYBRTMSelect Master Mix 在7500 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 系統(tǒng)上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析。 本研究中基因的引物序列如下:U6:5’-UGAGAACUGAAUUCC AUGGGUU-3’; miR-146a-5p: 5’-UGAGAACUGAA UUCCAUGGGUU-3’。

1.3.8 蛋白質(zhì)印跡法

使用適當(dāng)?shù)睦淞呀饩彌_液從IEC-6 細(xì)胞和腸組織中提取總蛋白,并使用BCA 蛋白試劑盒測(cè)定蛋白濃度。 然后將樣品加載到SDS-PAGE(8%～12%)上,并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜。 將膜在5%脫脂牛奶中封閉1 h,與靶向β-actin(1 ∶2000),Sirt6(1 ∶1200 稀釋)和LC3(1 ∶1000 稀釋)的一抗在4℃下孵育過夜,后與HRP 偶聯(lián)的二抗(1 ∶5000)在室溫下孵育1 h。通過增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法和ChemiDoc XRS 獲取蛋白質(zhì)條帶圖像。 使用Image J 軟件計(jì)算條帶強(qiáng)度,并將其歸一化為GAPDH 的條帶強(qiáng)度。

1.3.9 體外抑制劑轉(zhuǎn)染miR-146a

IEC-6 細(xì)胞每毫升5×103個(gè)細(xì)胞接種在24 孔板中。 將50 μL 含miR-146a 抑制劑(25 nmol/L,終濃度)Opti-MEM 與含1 μL lipofectamine 的50 μL Opti-MEM 混合,并轉(zhuǎn)染IEC-6 細(xì)胞6 h。 然后用原始培養(yǎng)基再培養(yǎng)24 h,用DEX 預(yù)處理并建立OGD/R 模型。 等濃度的抑制劑陰性對(duì)照用作實(shí)驗(yàn)中非序列特異性效應(yīng)的對(duì)照。 最后,測(cè)定細(xì)胞凋亡、miR-146a 表達(dá)水平以及與信號(hào)相關(guān)的蛋白表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 DEX 在體內(nèi)外對(duì)I/R 和OGD/R 損傷的保護(hù)作用

HE 染色顯示,假手術(shù)組大鼠的腸粘膜上皮細(xì)胞完好無損,杯狀細(xì)胞清晰可見。 與假手術(shù)組相比,I/R 組大鼠腸黏膜上皮出現(xiàn)明顯的腸道形態(tài)改變、大量炎性細(xì)胞浸潤、固有層消化崩解、出血、潰瘍形成。 DEX 組的腸道形態(tài)學(xué)改變顯著改善,其特征是腸道組織學(xué)損傷評(píng)分(Chiu’s score)降低。 組織病理學(xué)分析表明DEX 處理對(duì)I/R 誘導(dǎo)的腸上皮損傷具有保護(hù)作用(圖1)。 為了模擬腸I/R,對(duì)IEC-6 細(xì)胞進(jìn)行4 h 的氧-葡萄糖剝奪,然后進(jìn)行復(fù)氧(OGD/R)。 與對(duì)照組相比,在OGD/R 暴露后觀察到細(xì)胞活力大大降低。 相反,DEX 治療以劑量依賴性方式恢復(fù)細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞存活。 此外,由于DEX 在2 μmol/L 時(shí)表現(xiàn)出最佳保護(hù)性能,存活率約為90%(圖2),因此選擇該濃度用于后續(xù)分析。

圖1 DEX 在體內(nèi)對(duì)I/R 損傷的保護(hù)作用(HE 染色,n=8)Note. A, HE staining results of the rat intestinal mucosa. B, Chui’s score. Compared with the Sham group,***P<0.001. Compared with the I/R group,##P<0.01.Figure 1 Protective effect of DEX against I/R injury in vivo (HE staining)

圖2 OGD/R 損傷和DEX 處理對(duì)腸細(xì)胞增殖的影響Note. Compared with Con group,***P<0.001. Compared with OGD/R group,##P<0.01,###P<0.001.Figure 2 Effects of OGD/R injury and DEX treatment on intestinal cell proliferation

2.2 DEX 在體內(nèi)和體外對(duì)I/R 和OGD/R 損傷后細(xì)胞凋亡的抑制作用

與Sham 組相比,I/R 組大鼠腸道細(xì)胞凋亡顯著增加(P<0.001)。 DEX 組細(xì)胞凋亡顯著低于I/R組(P<0.01)(圖3)。 與體內(nèi)結(jié)果一致,體外研究發(fā)現(xiàn)DEX 顯著減輕OGD/R 誘導(dǎo)的IEC-6 細(xì)胞凋亡(P<0.01)(圖4)。

圖3 DEX 在體內(nèi)對(duì)I/R 損傷后細(xì)胞凋亡的抑制作用(TUNEL 染色,n=8)Note. A, TUNEL staining results of rat intestinal mucosa. B, Quantitative analysis of TUNEL positive cells. Compared with the Sham group,***P<0.001. Compared with the I/R group, ##P<0.01.Figure 3 Inhibitory effect of DEX on apoptosis after I/R injury in vivo (TUNEL staining)

圖4 DEX 在體外對(duì)OGD/R 損傷后細(xì)胞凋亡的抑制作用(TUNEL 染色,n=3)Note. A, TUNEL staining results of IEC-6 cells. B, Quantitative analysis of TUNEL-positive cells. Compared with Con group,***P<0.001.Compared with OGD/R group,##P<0.01.Figure 4 TUNEL staining analysis of the effect of DEX on OGD/R injury-induced apoptosis of intestinal epithelial cells(TUNEL staining)

2.3 DEX 對(duì)體外和體內(nèi)miR-146a/Sirt6 信號(hào)和LC3 水平的影響

先前研究報(bào)道了DEX 通過靶向miR-146a/Sirt6信號(hào)參與肺部保護(hù)[11],為考察DEX 是否通過靶向miR-146a/Sirt6 信號(hào)在對(duì)I/R 損傷的保護(hù)功能中發(fā)揮作用,研究考察DEX 對(duì)體外和體內(nèi)miR-146a/Sirt6 信號(hào)的影響。 與Sham 組相比,I/R 組miR-146a、Sirt6 在大鼠腸道組織中表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.001)。 DEX 治療顯著增加了I/R 大鼠腸道組織中miR-146a、Sirt6 表達(dá)(P<0.01)(圖5、圖6)。 與體內(nèi)結(jié)果一致,體外研究發(fā)現(xiàn)DEX 顯著增加了OGD/R 誘導(dǎo)的IEC-6 細(xì)胞中miR-146a 表達(dá)下調(diào)(P<0.01)(圖5)。 此外,蛋白質(zhì)印跡和免疫熒光測(cè)定用于檢測(cè)體內(nèi)和體外LC3 的表達(dá)水平。 如圖6所示,與Sham 組或?qū)φ战M相比,I/R 組和OGD/R 組LC3 Ⅱ的表達(dá)水平降低,DEX 增加了LC3 Ⅱ水平。免疫熒光證實(shí)了蛋白質(zhì)印跡結(jié)果,DEX 顯著增加了I/R 大鼠腸組織和OGD/R 處理的IEC-6 細(xì)胞中LC3 水平(圖7)。

圖5 DEX對(duì)體外和體內(nèi)miR-146a水平的影響Note. A, Effect of DEX on the expression levelofmiR-146ainintestinaltissueofratswithI/Rinjury.B, Effect of miR-146a expression level in OGD/R injury-induced intestinal epithelial cells. Compared with Sham group or Con group,***P<0.001. Compared with I/R group or OGD/R group,##P<0.01.Figure 5 Effects of DEX on miR-146a levels in vitro and in vivo

圖6 DEX 對(duì)體外和體內(nèi)Sirt6 和LC3 水平的影響Note. A, Effect of DEX on the expression levels of Sirt6 and LC3 in the intestinal tissue of I/R injured rats. B, Effect of the expression levels of Sirt6 and LC3 in the intestinal epithelial cells induced by OGD/R injury.Figure 6 Effects of DEX on Sirt6 and LC3 levels in vitro and in vivo

圖7 DEX 對(duì)體外和體內(nèi)Sirt6、LC3 水平的影響(免疫熒光染色)Note. A, Effect of DEX on the expression level of LC3 in the intestinal tissue of I/R injured rats. B, Effect of the LC3 expression level in the intestinal epithelial cells induced by OGD/R injury.Figure 7 Effect of DEX on Sirt6 and LC3 levels in vitro and in vivo (Immunofluorescence staining)

2.4 在體外阻斷miR-146a 后DEX 對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

用miR-146a 抑制劑轉(zhuǎn)染IEC-6 細(xì)胞,然后在OGD/R 損傷前用DEX 預(yù)處理。 如圖8 所示,miR-146a 抑制劑降低了DEX 治療誘導(dǎo)的miR-146a 上調(diào)(P<0.01)。 與OGD/R 組相比,miR-146a 抑制劑顯著增加了凋亡細(xì)胞的數(shù)量,并減少了Sirt6、LC3 Ⅱ的表達(dá)水平。 此外,與OGD/R+DEX 組相比,OGD/R+DEX+miR-146a 抑制劑組凋亡細(xì)胞的數(shù)量顯著增加(P<0.05),和Sirt6、LC3 Ⅱ的表達(dá)水平顯著減少(P<0.01)(圖9～圖11)。

圖8 轉(zhuǎn)染miR-146a 抑制劑影響DEX 對(duì)IEC-6細(xì)胞中miR-146a 表達(dá)Figure 8 Transfection of miR-146a inhibitor affects the expression of miR-146a in IEC-6 cells by DEX

圖9 轉(zhuǎn)染miR-146a 抑制劑影響DEX 對(duì)IEC-6 細(xì)胞凋亡的保護(hù)(TUNEL 染色,n=3)Note. Compared with Con group,*P<0.05,***P<0.001. Compared with OGD/R group,##P<0.01. Compared with OGD/R+DEX group,&&P<0.01.Figure 9 Transfection of miR-146a inhibitor affects the protection of DEX against apoptosis of IEC-6 cells (TUNEL staining)

圖10 轉(zhuǎn)染miR-146a 抑制劑影響DEX 對(duì)IEC-6 細(xì)胞中Sirt6、LC3 Ⅱ蛋白表達(dá)影響Note. Compared with Con group,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001. Compared with OGD/R group,###P<0.001. Compared with OGD/R+DEX group,&&&P<0.01.Figure 10 Transfection of miR-146a inhibitor affects the effect of DEX on the expression of Sirt6 and LC3Ⅱ proteins in IEC-6 cells

圖11 轉(zhuǎn)染miR-146a 抑制劑影響DEX 對(duì)IEC-6 細(xì)胞中LC3 蛋白表達(dá)(免疫熒光染色,n=3)Note. Compared with Con group,*P<0.05,***P<0.001. Compared with OGD/R group,##P<0.01. Compared with OGD/R+DEX group,&&P<0.01.Figure 11 Transfection of miR-146a inhibitor affected the expression of LC3 protein in IEC-6 cells by DEX(Immunofluorescence staining)

3 討論

腸道I/R 損傷作為臨床常見的嚴(yán)重疾病,威脅患者生命。 腸道黏膜是腸道菌群與其內(nèi)毒素之間的屏障[6]。 I/R 損傷引起的粘膜破壞可出現(xiàn)腸道細(xì)菌轉(zhuǎn)移到體循環(huán)系統(tǒng),并導(dǎo)致組織壞死、嚴(yán)重代謝紊亂和全身炎癥反應(yīng)綜合征的快速進(jìn)展[6]。 DEX是一種成熟的治療藥物,先前研究發(fā)現(xiàn)DEX 通過抑制炎癥和細(xì)胞凋亡對(duì)肝、腎、腦和胃I/R 損傷具有保護(hù)作用[15-16]。 然而,DEX 影響腸道I/R 損傷的分子機(jī)制仍不清楚。 本研究的結(jié)果表明,DEX 預(yù)處理顯著改善了OGD/R 誘導(dǎo)的IEC-6 細(xì)胞活力下降,并且DEX 可改善腸道I/R 誘導(dǎo)的組織病理學(xué)損傷并降低Chiu 評(píng)分,這是腸黏膜損傷的重要指標(biāo)[6]。 此外,DEX 顯著降低了凋亡細(xì)胞的數(shù)量,提示DEX 對(duì)I/R 損傷的保護(hù)作用可能與抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。

自噬作為細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑,在自噬性細(xì)胞死亡中起重要作用,并作為信號(hào)平臺(tái)促進(jìn)不同細(xì)胞死亡途徑的激活和整合,選擇性降解自噬相關(guān)因子[17]。 例如,增加的自噬活性有助于緩解腸道I/R誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[2]。 此外,自噬通過降解哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的抗凋亡因子或受損分子和細(xì)胞器先于細(xì)胞凋亡[18]。 目前認(rèn)為,自噬在缺血性疾病中發(fā)揮有益還是有害作用取決于環(huán)境壓力因素,包括氧氣可用性的變化、I/R 損傷的嚴(yán)重程度,以及不同器官對(duì)缺血的耐受性,可能導(dǎo)致受影響器官中自噬通量的變化[19]。 本研究表明,DEX 預(yù)處理上調(diào)了腸道I/R損傷中的自噬活性,其特征是在體內(nèi)和體外均增加了LC3Ⅱ水平。 由于自噬是一個(gè)高度動(dòng)態(tài)和多步驟的過程,自噬標(biāo)記蛋白LC3 水平的增加可能是自噬活性增加或自噬體-溶酶體融合受阻的結(jié)果[20]。 因此,我們的研究結(jié)果表明,DEX 通過增強(qiáng)自噬活性來減輕腸道I/R 損傷。

越來越多的證據(jù)表明miRNA 分子可以作為各種疾病的靶向治療劑。 先前的研究發(fā)現(xiàn),miR-146a可以緩解I/R 損傷,例如腎I/R 和心肌I/R 損傷[9,21]。 至于腸道I/R 損傷,之前的研究表明miR-146a 在I/R 和OGD/R 期間的表達(dá)降低,并且在OGD/R 期間抑制miR-146a 表達(dá)進(jìn)一步抑制自噬并加重細(xì)胞死亡,而miR-146a 過表達(dá)通過上調(diào)Sirt6增加體外自噬激活來減輕OGD/R 損傷。 提示miR-146a/Sirt6 信號(hào)通過調(diào)節(jié)自噬作用于OGD/R[10,22]。此外,先前研究已經(jīng)證實(shí)了miR-146a 可以通過靶向Sirt6 來調(diào)節(jié)炎癥、氧化應(yīng)激、纖維化等病理過程[23]。本研究發(fā)現(xiàn),DEX 在體內(nèi)和體外均增加了miR-146a/Sirt6 信號(hào)水平。 Sirt6 介導(dǎo)的自噬在控制凋亡信號(hào)傳導(dǎo)中起關(guān)鍵作用。 為了進(jìn)一步研究DEX 對(duì)miR-146a/Sirt6 信號(hào)的影響,我們?cè)隗w外進(jìn)行了miR-146a 抑制劑測(cè)試,并發(fā)現(xiàn)miR-146a 抑制劑削弱DEX 誘導(dǎo)的改善作用,還通過下調(diào)Sirt6 表達(dá)抑制自噬激活。 這些發(fā)現(xiàn)表明,DEX 通過激活OGD/R 受損的自噬通量來減輕OGD/R 損傷。

此外,DEX 對(duì)I/R 損傷的保護(hù)作用很可能還涉及除miR-146a/Sirt6 級(jí)聯(lián)之外的許多細(xì)胞功能。 據(jù)報(bào)道,DEX 上調(diào)HIF-1α 以抑制I/R 誘導(dǎo)的神經(jīng)元自噬[24]。 ERK 和Akt 信號(hào)通路參與DEX 介導(dǎo)的腎I/R 損傷中氧化應(yīng)激和炎癥的減弱[15]。 此外,也有報(bào)道稱DEX 通過PPARγ/STAT3 信號(hào)通路調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞M2 的活化來減輕肝的I/R 損傷[6]。 這與我們模型中觀察到的細(xì)胞凋亡減少一致,表明在I/R損傷和DEX 治療期間存在復(fù)雜的細(xì)胞間通訊。 總體而言,所有這些發(fā)現(xiàn)都確定了DEX 賦予保護(hù)功能的復(fù)雜性,而對(duì)潛在機(jī)制的更嚴(yán)格探索不僅需要擴(kuò)大我們對(duì)I/R 的了解,而且還需要提供針對(duì)I/R 損傷的新預(yù)防策略。