方 靈, 史夢(mèng)竹, 司瑞茹, 韋 航, 梁?jiǎn)⒏? 傅建煒

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所/福建省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福州 350003)

乙烯利是一種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，具有調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)、促進(jìn)果實(shí)成熟等作用，廣泛應(yīng)用于果蔬催熟領(lǐng)域。研究表明，乙烯利具有神經(jīng)毒性，對(duì)免疫和生殖系統(tǒng)造成一定損害[1]。草甘膦 和草銨膦 作為非選擇性、內(nèi)吸性及水溶性除草劑，具有高效、價(jià)廉等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)等領(lǐng)域[2]。草甘膦主要代謝產(chǎn)物為氨甲基膦酸 ，草銨膦在環(huán)境中主要降解為3-(甲基磷酸亞基)丙酸及草銨膦-N-乙酰 ，草甘膦及草銨膦主要通過(guò)抑制膽堿酯酶活性，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)造成不良影響[3]。乙烯利、草甘膦、草銨膦及其代謝物等通過(guò)食物鏈、生物富集，對(duì)人類身體健康產(chǎn)生潛在的影響，同時(shí)對(duì)生態(tài)環(huán)境也產(chǎn)生一定的風(fēng)險(xiǎn)。乙烯利、草甘膦、草銨膦及其代謝物均為強(qiáng)極性化合物 (化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖式1)，含有膦酸基團(tuán)，這些化合物通常不溶于大部分有機(jī)溶劑，難揮發(fā)[4]，導(dǎo)致其殘留分析難度大大增加。

圖式1 6 種化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)Scheme 1 Chemical structures of six compounds

目前，針對(duì)乙烯利、草甘膦、草銨膦等強(qiáng)極性化合物的檢測(cè)方法有氣相色譜-質(zhì)譜法[5-6]、液相色譜-質(zhì)譜法[7-9]、氣相色譜法[10-11]、液相色譜法[12-13]和離子色譜法[14-15]等。雖然離子色譜法可以直接檢測(cè)極性化合物，但抗干擾能力較差，易產(chǎn)生“假陽(yáng)性”結(jié)果[16]。氣相色譜-質(zhì)譜法、氣相色譜法及液相色譜法通常需要衍生化反應(yīng)，前處理操作相對(duì)復(fù)雜、繁瑣，方法重現(xiàn)性較差，效率較低[17]。液相色譜-質(zhì)譜法具有靈敏度高、分析效率高、選擇性高等特點(diǎn)，成為當(dāng)前乙烯利、草甘膦、草銨膦等強(qiáng)極性化合物痕量分析的主要方法?，F(xiàn)有的大部分方法是通過(guò)芴甲氧羰酰氯 (FMOC-Cl) 試劑衍生[18-21]。草甘膦、草銨膦等在硼酸鹽緩沖溶液中與FMOC-Cl 試劑混勻后室溫下反應(yīng)2 h，形成的衍生產(chǎn)物FMOC-Gly、FMOC-Glu 等易溶于水，可采用常規(guī)C18柱對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分離分析[7]，但操作繁瑣，重現(xiàn)性較差。也可使用親水性色譜柱 (HILIC)進(jìn)行分離[22-23]，但親水色譜柱平衡時(shí)間較長(zhǎng)，草甘膦、草銨膦、氨甲基膦酸等物質(zhì)峰形易拖尾，從而影響準(zhǔn)確定量[1]。目前，關(guān)于環(huán)境水中乙烯利、草甘膦、草銨膦及其代謝物等6 種強(qiáng)極性化合物同時(shí)測(cè)定的方法尚未見(jiàn)報(bào)道。基于現(xiàn)有方法的局限性，有必要建立一種高效、便捷、靈敏的環(huán)境水中乙烯利、草甘膦、草銨膦等6 種極性化合物的檢測(cè)技術(shù)。

草甘膦、草銨膦等強(qiáng)極性農(nóng)藥具有較強(qiáng)的金屬絡(luò)合能力，而儀器管路系統(tǒng)中存在微量金屬，導(dǎo)致目標(biāo)物響應(yīng)強(qiáng)度降低，峰形異常。為了改善這些極性物質(zhì)的峰形及提高目標(biāo)物信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度，考察了一種新型流動(dòng)相添加劑——亞甲基二膦酸在不同濃度下對(duì)待測(cè)目標(biāo)物的影響，以及6 種化合物在進(jìn)樣系統(tǒng)中的殘留水平。本研究利用反相色譜柱，建立了一種非衍生化超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）直接測(cè)定環(huán)境水樣中乙烯利、草甘膦、草銨膦、氨甲基膦酸、3-(甲基磷酸亞基）丙酸及草銨膦-N-乙酰等6 種強(qiáng)極性化合物的分析方法，以期為相關(guān)監(jiān)管部門監(jiān)測(cè)環(huán)境水中上述化合物提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Shimadzu LCMS-8050 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 (日本島津公司)；Allegra X-30R 冷凍離心機(jī) (美國(guó)Beckman Coulter 公司)；渦旋振蕩器 (德國(guó)IKA 公司)；Milli-Q 超純水器 (美國(guó)Millipore公司)。

草甘膦 (glyphosate，純度99.9%)、草銨膦(glufosinate，純度98.9%)、氨甲基膦酸 (aminomethylphosphonic acid，純度99.5%)、3-(甲基磷酸亞基)丙酸(3-methylphosphinicopropionic acid，純度98.4%)、草銨膦-N-乙酰 (glufosinate-N-acetyl，純度98.3%)及乙烯利 (ethephon，純度99.0%) (100 μg/mL，天津阿爾塔科技有限公司)；亞甲基二膦酸 (純度97%，百靈威科技有限公司)。

甲醇 (色譜純，德國(guó)Merck 公司)；甲酸 (色譜純，上海麥克林公司)；乙酸銨 (色譜純，美國(guó)Fish Chemical 公司)；水相針式濾器 (0.22 μm，聚醚砜，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確量取各標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用超純水混勻并定容，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃下密閉保存于聚丙烯容器。準(zhǔn)確移取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用超純水稀釋，配制成質(zhì)量濃度為1、5、10、20、50、100、200 和500 μg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 樣品前處理

量取5 mL 環(huán)境水樣于15 mL 聚丙烯離心管中，于4 ℃、5 000 r/min 下離心5 min。取上清液，過(guò)0.22 μm 水相針式濾器，待UPLC-MS/MS分析。

1.4 色譜與質(zhì)譜檢測(cè)條件

1.4.1 液相色譜條件 Waters Acquity UPLC HSS T3 色譜柱 (100 mm × 2.1 mm，1.8 μm)；流速：0.20 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10.0 μL。流動(dòng)相A 為0.1% 甲酸-5 μmol/L 亞甲基二膦酸水溶液；B 為甲醇，梯度洗脫程序：0～4.0 min，95%A；＞ 4.0～4.1 min，95%～20%A；＞ 4.1～6.0 min，20%A；＞ 6.0～6.1 min，20%～95% A；＞ 6.1～9.0 min，95%A。峰面積外標(biāo)法定量。

1.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源 (ESI)；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式 (MRM)；霧化氣流量3 L/min；加熱氣流量10 L/min；干燥氣流量10 L/min；接口溫度300 ℃；脫溶劑管 (DL) 溫度250 ℃；加熱塊溫度400 ℃。其他質(zhì)譜參詳見(jiàn)表1。

表1 6 種化合物的質(zhì)譜信息參數(shù)Table 1 The MS parameters of the six compounds

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

2.1.1 色譜柱選擇 根據(jù)6 種化合物的性質(zhì)，考察了3 種色譜柱的分離效果。Waters Acquity UPLC HSS T3 色譜柱 (100 mm × 2.1 mm，1.8 μm)是C18柱，Agilent InfintyLab Poroshell 120 HILICZ 色譜柱 (100 mm × 2.1 mm，2.7 μm) 是兩性離子固定相HILIC 柱，Phenomenex Luna HILIC 色譜柱 (100 mm × 2 mm，3 μm) 是非兩性離子HILIC柱。6 種化合物在后兩種色譜柱中峰形較差，重現(xiàn)性較差，靈敏度較低，而第一種色譜柱可兼容高水相，適用于極性物質(zhì)的分離，對(duì)極性物質(zhì)具有較好的保留，峰形相對(duì)尖銳對(duì)稱，重現(xiàn)性較好，靈敏度較高，適用于目標(biāo)待測(cè)物的分離分析。因此，本研究選擇Waters Acquity UPLC HSS T3 色譜柱用于后續(xù)分析研究。

2.1.2 流動(dòng)相條件優(yōu)化 由于6 種化合物為強(qiáng)極性物質(zhì)，故比較了0.1%甲酸水溶液、0.1%甲酸-乙酸銨水溶液和0.1%甲酸-亞甲基二膦酸水溶液3 種流動(dòng)相對(duì)6 種化合物信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度的影響。結(jié)果 (圖1) 表明：水相中加入乙酸銨后，大部分待測(cè)物信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度大大降低，草甘膦、草銨膦等出現(xiàn)色譜峰拖尾。加入一定量亞甲基二膦酸后，與其他兩種流動(dòng)相水相相比，6 種化合物響應(yīng)強(qiáng)度增強(qiáng)，且峰形較尖銳，這可能是由于草甘膦、草銨膦等具有較強(qiáng)的金屬絡(luò)合能力，能夠與儀器管路系統(tǒng)中微量金屬絡(luò)合，導(dǎo)致響應(yīng)強(qiáng)度降低，峰形異常，而亞甲基二膦酸的雙膦酸基團(tuán)結(jié)構(gòu)具有更強(qiáng)的絡(luò)合能力，能夠競(jìng)爭(zhēng)性地爭(zhēng)奪金屬離子，因此能夠提高目標(biāo)物響應(yīng)強(qiáng)度。綜上考慮，本研究選擇0.1%甲酸-亞甲基二膦酸水溶液作為流動(dòng)相水相。

圖1 采用不同流動(dòng)相水相時(shí)6 種化合物響應(yīng)強(qiáng)度 (n=3)Fig.1 Response of six compounds using different water phase of mobile phase (n=3)

2.1.3 亞甲基二膦酸在不同濃度下對(duì)目標(biāo)待測(cè)物響應(yīng)強(qiáng)度的影響 進(jìn)一步考察流動(dòng)相中不同濃度(0、2.5、5、10 和15 μmol/L) 亞甲基二膦酸對(duì)6 種化合物信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度的影響。結(jié)果 (圖2) 表明：當(dāng)亞甲基二膦酸濃度在0～5 μmol/L 時(shí)，草甘膦、草銨膦、草銨膦-N-乙酰、3-(甲基膦酸亞基)丙酸及乙烯利響應(yīng)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)；當(dāng)亞甲基二膦酸濃度為5 μmol/L 時(shí)，6 種化合物響應(yīng)強(qiáng)度達(dá)到最大，隨著亞甲基二膦酸濃度繼續(xù)升高，目標(biāo)物信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度降低。表明一定量亞甲基二膦酸能夠增強(qiáng)6 種強(qiáng)極性化合物的響應(yīng)強(qiáng)度，但濃度過(guò)高，則會(huì)產(chǎn)生離子抑制影響。

圖2 不同濃度(0, 2.5, 5, 10, 15 μmol/L)亞甲基二膦酸對(duì)6 種化合物信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度的影響 (n=3)Fig.2 Effect of different concentrations of medronic acid(0, 2.5, 5, 10, 15 μmol/L) on peak area of six compounds (n=3)

綜合考慮，本研究選用0.1%甲酸-5 μmol/L亞甲基二膦酸水溶液和甲醇為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，在此條件下，草甘膦、草銨膦、氨甲基膦酸、3-(甲基磷酸亞基) 丙酸、草銨膦-N-乙酰及乙烯利6 種化合物的保留時(shí)間分別為：1.338、1.355、1.306、1.530、2.194 和2.055 min，其提取離子流色譜圖如圖3 所示。

圖3 6 種化合物的提取離子流色譜圖(500 μg/L)Fig.3 Extracted ion chromatogram of six compounds(500 μg/L)

2.2 洗針液對(duì)進(jìn)樣系統(tǒng)中6 種化合物殘留水平的影響

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)前一次進(jìn)樣含有高濃度樣品時(shí)，進(jìn)樣系統(tǒng)會(huì)有一定量目標(biāo)物殘留，并對(duì)下一次進(jìn)樣產(chǎn)生影響。為降低影響，分別考察了純水、50%甲醇水溶液及0.1%甲酸水溶液作為洗針液對(duì)進(jìn)樣系統(tǒng)的影響。結(jié)果表明：以0.1%甲酸水溶液作為洗針液時(shí)，6 種化合物在進(jìn)樣系統(tǒng)中殘留量最少，但仍有少量3-(甲基磷酸亞基) 丙酸殘留。因此后續(xù)進(jìn)行了進(jìn)樣系統(tǒng)中6 種化合物殘留水平試驗(yàn)，采用0.1%甲酸水溶液作為洗針液，選擇高濃度樣品 (500 μg/L) 進(jìn)樣一次后，連續(xù)5 次進(jìn)樣空白純水樣品，重復(fù)3 次。殘留水平=純水空白樣品中目標(biāo)物的峰面積/標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)物峰面積 × 100%。由圖4 可知，隨著空白樣品進(jìn)樣次數(shù)增多，3-(甲基磷酸亞基)丙酸殘留水平逐漸降低，第2 次空白樣品進(jìn)樣后，其殘留水平小于1%，影響基本可以忽略。因此，在高濃度樣品進(jìn)樣后，選擇進(jìn)樣一次空白純水溶液，以降低3-(甲基磷酸亞基)丙酸殘留水平，從而提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖4 進(jìn)樣系統(tǒng)中3-(甲基磷酸亞基)丙酸殘留水平 (n=3)Fig.4 Residual level of MPPA in injection system (n=3)

2.3 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

基質(zhì)效應(yīng) (Me) 一般是目標(biāo)物以外的其他雜質(zhì)成分對(duì)目標(biāo)物的影響，由于目標(biāo)物成分與其他雜質(zhì)成分在離子化過(guò)程中存在一定的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，影響目標(biāo)物的離子化效率，對(duì)目標(biāo)物的響應(yīng)信號(hào)產(chǎn)生增強(qiáng)或抑制作用，可能影響目標(biāo)物定量準(zhǔn)確度、靈敏度等。Me= 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，當(dāng)0.8 ≤Me≤ 1.2 時(shí)基質(zhì)效應(yīng)不明顯，當(dāng)Me＜ 0.8 時(shí)為基質(zhì)抑制效應(yīng)，當(dāng)Me＞ 1.2 時(shí)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)[24]。本研究分別以過(guò)濾后的空白水樣和超純水建立相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，6 種化合物的基質(zhì)效應(yīng)在0.95～1.15 之間，基質(zhì)效應(yīng)不明顯。因此本研究采用外標(biāo)法定量，以超純水為溶劑配制系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

2.4 線性范圍

量取1～500 μg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照優(yōu)化后的色譜及質(zhì)譜條件，從低濃度到高濃度分別進(jìn)樣。結(jié)果表明：草甘膦在5～500 μg/L 線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，草銨膦和草銨膦-N-乙酰在1～500 μg/L 線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，氨甲基膦酸、3-(甲基磷酸亞基)丙酸及乙烯利在10～500 μg/L線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。6 種化合物的決定系數(shù)均大于0.99。

2.5 方法的準(zhǔn)確度、精密度、檢出限及定量限

在空白水樣中分別添加10、50、200 μg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照1.4 節(jié)的條件測(cè)定。一天內(nèi)平行測(cè)定6 次，求得日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (Intraday RSD)；平行測(cè)定6 d，計(jì)算日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(Inter-day RSD) 及平均添加回收率。結(jié)果 (表2) 顯示：在10～200 μg/L 添加水平下，6 種化合物在水樣中的平均回收率在75%～100%，日內(nèi)及日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.6%～7.0%和4.3%～7.5%。

表2 6 種化合物在空白水樣中的添加回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差、LOD 及LOQ (n=6)Table 2 Recoveries, RSD, LOD, and LOQ for six compounds in blank water samples (n=6)

本研究采用低濃度水平添加方式，并結(jié)合信噪比) 確定方法檢出限及定量限，以3 倍信噪比得到方法的檢出限 (LOD)，10 倍信噪比得到方法的定量限 (LOQ)，則LOD 在0.1～3.0 μg/L 之間，LOQ 在0.5～10 μg/L 之間，低于HJ 1071—2019[25]中草甘膦檢出限 (8 μg/L)。本研究方法滿足NY/T 3151—2017[26]的要求，可應(yīng)用于環(huán)境水樣中乙烯利、草甘膦、草銨膦及其代謝物等6 種強(qiáng)極性化合物的檢測(cè)。

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

共采集地表水10 份，其中采自福州市2 份、莆田市3 份、龍巖市5 份，按照本研究建立的方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，乙烯利、草甘膦、草銨膦及其代謝物等6 種化合物均未檢出。

3 結(jié)論

本研究建立了環(huán)境水樣中乙烯利、草甘膦、草銨膦、氨甲基膦酸、3-(甲基磷酸亞基)丙酸及草銨膦-N-乙酰等6 種化合物的非衍生化超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速檢測(cè)方法。該方法利用常規(guī)反相色譜柱分離，與衍生化方法相比，具有前處理簡(jiǎn)便、靈敏度高、穩(wěn)定性好、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于環(huán)境水中乙烯利、草甘膦、草銨膦及其代謝物等6 種化合物的檢測(cè)，為環(huán)境水中強(qiáng)極性化合物的非衍生化檢測(cè)提供了一種新方法。