汪漢成, 黃 宇, 楊金初, 李治模, 蔡劉體,韋克蘇, 孟建玉, 李 忠

(1. 貴州省煙草科學(xué)研究院，貴陽 550081；2. 貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，貴陽 550025；3. 河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，鄭州 450000；4. 貴州省煙草公司 遵義市公司，貴州 遵義 563099)

由葉斑病菌Didymella segeticola引起的煙草葉斑病是近期在貴州煙區(qū)發(fā)現(xiàn)的新病害，主要為害葉片，初始癥狀為葉片上出現(xiàn)褐色小病斑，周圍有淡黃色暈圈，褐色病斑會很快擴(kuò)展至整個(gè)葉片，嚴(yán)重時(shí)相鄰病斑會融合形成大面積褐色病斑，煙株感染后通常自底部葉片迅速向中上部葉片擴(kuò)展，具有暴發(fā)性和危害性強(qiáng)的特點(diǎn)，嚴(yán)重時(shí)局地?zé)熤臧l(fā)病率達(dá)80%以上，可導(dǎo)致煙葉成片腐爛[1]。該病害易于煙株旺長期開始發(fā)生，具有造成重大損失的風(fēng)險(xiǎn)，尚無有效抗病品種，亟待建立高效防控技術(shù)。

化學(xué)防治是煙草葉斑類病害防治最經(jīng)濟(jì)有效的方法，對于由D.segeticola引起的煙草葉斑病,目前尚未有登記藥劑，相關(guān)防控技術(shù)研究也鮮有報(bào)道?，F(xiàn)階段，煙草真菌性葉斑類病害常用的防控藥劑有菌核凈(dimethachlon)、咪鮮胺(prochloraz)、多菌靈 (carbendazim)、代森錳鋅(mancozeb) 等，少量使用的藥劑有啶酰菌胺(boscalid)、苯醚甲環(huán)唑 (difenoconazole)、丙環(huán)唑(propiconazole) 和氟硅唑 (flusilazole) 等。為了評價(jià)這些藥劑在防治煙草葉斑病方面的可行性，筆者就啶酰菌胺等8 種殺菌劑對D.segeticola的生物活性進(jìn)行了初步研究，結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 供試材料

菌株：煙草葉斑病菌D.segeticola菌株YBZ121、YBZ221 和YBZ111，由貴州省煙草科學(xué)研究院微生物實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定。

測試培養(yǎng)基與煙葉：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (PDA)[2]，用于病原菌的培養(yǎng)和敏感性測定。供試煙草品種為云煙87，烤煙主栽品種，按照常規(guī)育苗方法將其播種植于漂浮育苗池，煙苗8 葉期時(shí)，采集底部3-4 葉位煙葉，洗凈晾干后用于藥劑的保護(hù)和治療作用測定。

藥劑：93%的菌核凈原藥，購自廣州卡芬生物科技有限公司；99.10%的咪鮮胺原藥，江蘇輝豐農(nóng)化股份有限公司生產(chǎn)；95.30% 的氟硅唑原藥，南通柯林化學(xué)品有限公司生產(chǎn)；95%丙環(huán)唑原藥，江蘇豐登農(nóng)藥有限公司生產(chǎn)；96.80%苯醚甲環(huán)唑原藥，山東壽光雙星農(nóng)藥有限公司生產(chǎn)；85%代森錳鋅可濕性粉劑，杜邦中國集團(tuán)有限公司生產(chǎn)；96%多菌靈原藥，江蘇藍(lán)豐生物化工股份有限公司生產(chǎn)；99.90%啶酰菌胺原藥，Sigma-Aldrich 有限公司生產(chǎn)。

將菌核凈溶于丙酮，咪鮮胺、氟啶胺、氟硅唑、丙環(huán)唑和苯醚甲環(huán)唑均分別溶于甲醇，多菌靈溶于0.20 mol/L 的稀鹽酸，代森錳鋅溶于無菌水中，均分別配成1.00 × 104mg/L 的母液，4 ℃低溫保存，備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 殺菌劑對病原菌菌絲生長的抑制作用 配制含有系列濃度各藥劑的PDA 平板，其中：菌核凈、氟硅唑和丙環(huán)唑的最終測試質(zhì)量濃度為0、0.16、0.31、0.63、1.25 和2.50 mg/L；苯醚甲環(huán)唑的為0、0.08、0.16、0.31、0.63 和1.25 mg/L；多菌靈的為0、0.50、1.00、1.5、2.00 和2.50 mg/L；代森錳鋅的為0、3.10、6.30、12.50、25 和50 mg/L；咪鮮胺的為0、0.13、0.25、0.50、1 和2 mg/L；啶酰菌胺的為0、0.013 0、0.025 0、0.05、0.10 和0.20 mg/L。制備直徑為5 mm 的菌蝶，將其接種于不同質(zhì)量濃度梯度含藥平板中央，各處理3 次重復(fù)，接菌后將平板置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，5 d 后“十字交叉”法測量菌落直徑，計(jì)算各藥劑不同劑量下對病原菌菌絲生長的抑制率[3]。

1.2.2 殺菌劑對煙草葉斑病的保護(hù)和治療作用測定 選擇強(qiáng)致病力菌株YBZ121 為測試菌株。用質(zhì)量濃度為0.01%的吐溫-80 配制各供試藥液。苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑、氟硅唑、啶酰菌胺、多菌靈及菌核凈的最終測試質(zhì)量濃度均為100、25 和0 mg/L；代森錳鋅的為400、100 和0 mg/L；咪鮮胺的為200、50 和0 mg/L。1.2.2.1 保護(hù)作用測定 采用手動(dòng)噴霧器向離體葉片正反兩面均勻噴施各濃度藥液，直至流淌。以噴施同體積無菌水處理為對照。于施藥24 h 后，用無菌接種針在葉片主脈兩側(cè)對稱部位制造相同傷口，分別接菌直徑為5 mm 的病原菌菌餅。每處理3 片煙葉，共6 次重復(fù)。接菌后將葉片置于25 ℃、相對濕度 90%及12 h/12 h 光暗交替的人工氣候箱中培養(yǎng)，6 d 后測量葉片病斑面積，計(jì)算各藥劑處理對煙草葉斑病的防控效果[4-5]。

1.2.2.2 治療作用測定 方法與保護(hù)作用測定相同，不同之處是接菌1 d 后再噴藥[4-5]。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 利用Excel 和SPSS 23.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，以藥劑質(zhì)量濃度對數(shù)值為橫坐標(biāo)、菌絲生長抑制率幾率值為縱坐標(biāo)，建立各藥劑對病原菌菌絲生長的毒力回歸方程，計(jì)算EC50值和相關(guān)系數(shù) (r)[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 殺菌劑對病原菌菌絲生長的抑制作用

結(jié)果 (表1) 表明：8 種供試殺菌劑對3 株D.segeticola菌株的菌絲生長表現(xiàn)出不同的抑菌活性，其中，抑菌活性最強(qiáng)的是啶酰菌胺，其EC50值范圍為0.033 0～0.055 0 mg/L，平均值為(0.047 0 ± 0.012 0) mg/L；其次依次為苯醚甲環(huán)唑、咪鮮胺和丙環(huán)唑，其EC50值范圍分別為0.075 0～0.085 0 mg/L、0.22～0.38 mg/L 和0.56～0.79 mg/L；代森錳鋅的抑菌活性最差，其EC50值范圍為12.88～33.82 mg/L。D.segeticola不同菌株菌絲生長對同種藥劑的敏感性存在差異，其中對代森錳鋅的差異最大，最不敏感菌株 (YBZ111) 的EC50值是最敏感菌株 (YBZ121) 的2.63 倍，各菌株對其余7 種供試藥劑的敏感性差異均較小。

表1 8 種殺菌劑對Didymella segeticola 菌絲生長的抑制作用Table 1 Inhibitory effects of eight fungicides on the mycelial growth of Didymella segeticola

續(xù)表1Table 1 (Continued)

2.2 殺菌劑對煙草葉斑病的保護(hù)和治療作用

供試8 種殺菌劑對煙草葉斑病表現(xiàn)出不同的保護(hù)和治療作用。各藥劑的防治效果均隨藥劑質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，而在相同劑量下，大部分藥劑保護(hù)處理時(shí)的防效高于其治療處理時(shí)的防效(表2)。其中，氟硅唑、苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑、啶酰菌胺和菌核凈對煙草葉斑病保護(hù)作用較強(qiáng)，其在25 mg/L 藥劑質(zhì)量濃度處理下的防效均 ＞85%；其次為多菌靈，25 mg/L 時(shí)的防效為82.74%；最弱的為代森錳鋅，100 mg/L 時(shí)的防效為70.51%。相比而言，治療作用效果較好的有啶酰菌胺和氟硅唑，其在25 和100 mg/L 下的防效均 ＞80%，且不存在顯著性差異；咪鮮胺在50 和200 mg/L 下的防效分別為85.24%和87.62%；苯醚甲環(huán)唑和多菌靈在25 和100 mg/L 下的防效均分別為76.00%和89.20%、及77.52%和82.43%；菌核凈和代森錳鋅的相對防效較弱，100 mg/L 處理時(shí)防效分別為78.93%和63.31%。

表2 8 種殺劑對煙草Didymella segeticola 葉斑病的保護(hù)和治療作用Table 2 Protective and curative effects of eight fungicides against D. segeticola leaf spot

3 小結(jié)與討論

D.segeticola是近年被診斷的重要植物病原菌，在貴州煙草和茶葉上均有危害[1,7-8]，然而對其防控技術(shù)卻缺乏研究，尚無任何防控藥劑登記。病原菌菌絲生長階段和孢子萌發(fā)階段均是其侵染危害的重要階段，抑制病原菌菌絲生長是病害防治藥劑篩選的重要依據(jù)之一。由于D.segeticola的孢子較難培養(yǎng)，故本研究測定并比較了8 種殺菌劑對D.segeticola菌絲生長的敏感性，發(fā)現(xiàn)琥珀酸脫氫酶抑制劑啶酰菌胺，三唑類殺菌劑苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑和氟硅唑，咪唑類殺菌劑多菌靈和咪鮮胺對D.segeticola菌絲生長均有較強(qiáng)的抑制活性。目前，鮮見有殺菌劑對D.segeticola生物活性的報(bào)道，劉順濤等報(bào)道了苯醚甲環(huán)唑和多菌靈對與D.segeticola同屬的西瓜蔓枯病病原菌Didymellabryoniae的毒力分別為0.056 0 和0.69 mg/L[9-10]，本研究測定結(jié)果與其基本一致。啶酰菌胺及三唑類殺菌劑戊唑醇和苯醚甲環(huán)唑?qū).bryoniae的敏感性基線分別為0.032 0、0.12 和0.031 0 mg/L，本研究所測定的啶酰菌胺及3 種三唑類殺菌劑結(jié)果與其類似[11]。另外，代森錳鋅對D.segeticola的抑菌作用弱于已報(bào)道的該藥劑對Didymella applanata毒力作用 (EC50在1.33～2.88 mg/L)[12]，這可能與Didymella屬真菌不同菌株對相同藥劑的敏感性間存在著差異有關(guān)。

除室內(nèi)敏感性測定外，活體植物組織上評價(jià)藥劑的防控效果也是病害防治藥劑篩選的重要依據(jù)。本研究在活體煙葉上評價(jià)了8 種殺菌劑對由真菌D.segeticola導(dǎo)致的葉斑病的保護(hù)和治療效果，發(fā)現(xiàn)其保護(hù)防效均高于治療防效，該結(jié)果與這些藥劑對煙草灰霉病和煙草立枯病的防治效果[4,13]類似；同時(shí)發(fā)現(xiàn)保護(hù)作用和治療作用均較好的藥劑有啶酰菌胺、苯醚甲環(huán)唑、氟硅唑和咪鮮胺等。已有研發(fā)表明，咪鮮胺的內(nèi)吸傳導(dǎo)活性較弱[14]，而本研究發(fā)現(xiàn)其在離體葉片上仍具有較好的治療活性，推測其原因可能與本研究通過離體葉片噴霧時(shí)藥劑通過葉片氣孔等孔口進(jìn)入葉組織有關(guān)，隨后需要進(jìn)一步研究和驗(yàn)證。煙葉生產(chǎn)上常使用的菌核凈、多菌靈等也具有較好的防治作用，但病原菌對這些藥劑產(chǎn)生抗性的風(fēng)險(xiǎn)較高。為此，D.segeticola葉斑病發(fā)生時(shí)可優(yōu)先選用啶酰菌胺、苯醚甲環(huán)唑、氟硅唑等藥劑進(jìn)行防治。此外，本文僅測定了藥劑對D.segeticola的菌絲生長階段的抑菌活性，其對病原菌孢子形成與萌發(fā)等其他生活史階段的生物活性、以及其田間防效均有待進(jìn)一步深入研究。此外，煙草是一種小面積種植的經(jīng)濟(jì)作物，2022 年全國年種植面積約86 萬公頃，登記防控?zé)煵莶∠x害的藥劑種類較少，下一步有待通過政策引導(dǎo)等措施加強(qiáng)防控藥劑的登記，促進(jìn)煙草病蟲害防控水平的提升。