孫蕓蕓，廖申權(quán)，李躍龍，呂敏娜，吳彩艷，李 娟，林栩慧，胡俊菁，肖文婉，孫銘飛，張健騑，曹 正，袁偉康，戚南山，顧有方

（1.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室肇慶分中心、茂名分中心，廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部禽流感等家禽重大疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所，廣州 510640；2.安徽科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，鳳陽 233100；3.廣東省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，廣州 510013）

頂復(fù)門原蟲是一種專一性的胞內(nèi)寄生性原蟲，包括巴貝斯蟲（Babesia spp.）、剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）、艾美耳球蟲（Eimeria spp.）、隱孢子蟲（Cryptosporidium spp.）及瘧原蟲（Plasmodium spp.）等，是人和動(dòng)物的重要病原，可引起人類和動(dòng)物的多種疾病，不僅危害人類的生命健康，而且給畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。目前對(duì)原蟲病的主要控制措施仍依賴于化學(xué)藥物療法，然而抗寄生蟲藥物既不能預(yù)防人和動(dòng)物感染疾病，也不能清除感染宿主內(nèi)的蟲體，因此，篩選疫苗候選分子、研制新型有效疫苗迫在眉睫。近年來諸多研究發(fā)現(xiàn)，頂端復(fù)合器在頂復(fù)門原蟲入侵宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用，其中棒狀體是頂復(fù)合器的重要構(gòu)件，在蟲體入侵宿主細(xì)胞時(shí)棒狀體能夠分泌相關(guān)蛋白分子，促進(jìn)納蟲空泡（parsitophorous vacuole,PV）的形成[3]。在已鑒定的主要原蟲抗原中，棒狀體蛋白被認(rèn)為是一種最具潛力的候選疫苗[4]，對(duì)入侵過程以及宿主細(xì)胞的存活都至關(guān)重要。本文以棒狀體蛋白研究為基礎(chǔ)，綜述了近年來棒狀體蛋白在頂復(fù)門原蟲疫苗中的研究進(jìn)展。

1 棒狀體蛋白

棒狀體是所有頂復(fù)門原蟲共有的一種獨(dú)特分泌型細(xì)胞器，其外形似棒狀，由兩個(gè)不同的部分：前導(dǎo)管（頸部）和后球莖（基部）組成[5]，由電子致密的嗜鋨酸物質(zhì)（osmiophilic）構(gòu)成[6]。近年來研究人員利用蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)方法對(duì)弓形蟲和其他頂復(fù)門原蟲棒狀體的含量進(jìn)行了識(shí)別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)包含38個(gè)棒狀體蛋白[7]，其中20個(gè)蛋白定位于棒狀體細(xì)胞器：包括9個(gè)棒狀體頸部蛋白（rhoptry neck proteins,RONs）和11個(gè)棒狀體基部蛋白（rhoptry proteins,ROPs）。

目前對(duì)棒狀體蛋白功能的研究中發(fā)現(xiàn)，在頂復(fù)門原蟲入侵宿主細(xì)胞的過程中，棒狀體蛋白起著關(guān)鍵作用：如一些棒狀體頸部蛋白（如RON2、RON4、RON5和RON8等）可與微線分泌的頂膜抗原（apical membrane antigen,AMA）相互作用，在蟲體頂端和宿主細(xì)胞膜接觸部位形成“運(yùn)動(dòng)結(jié)合體（moving junction,MJ）”，隨后包圍著蟲體緩慢進(jìn)入宿主細(xì)胞，并向后滑動(dòng)形成納蟲空泡并完成入侵過程。此外，在對(duì)弓形蟲棒狀體蛋白的研究中，Molina等[8]發(fā)現(xiàn)，一些ROP蛋白（如ROP5、ROP16和ROP18等）被稱為ROP激酶，作為絲氨酸-蘇氨酸激酶發(fā)揮作用，在寄生蟲的毒力和致病性以及宿主細(xì)胞調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，棒狀體蛋白有望成為抗弓形蟲等頂復(fù)門原蟲病的疫苗候選分子，加強(qiáng)對(duì)其生物學(xué)特性及作用機(jī)制的研究將為寄生蟲病的防控提供新的思路。

2 棒狀體基部蛋白及其在頂復(fù)門原蟲疫苗中的研究

2.1 棒狀體基部蛋白概述 棒狀體基部蛋白又稱為棒狀體蛋白激酶，其為適應(yīng)不同蟲體的不同發(fā)育方式而呈現(xiàn)出異質(zhì)性和保守性差等特點(diǎn)[9]。該類蛋白種類繁多，一般分為ROP1和ROP2蛋白家族，其中ROP1作為穿透增強(qiáng)因子（penetration enhancing factor,PEF）在1966年首次被發(fā)現(xiàn)，在蟲體入侵過程中起到聯(lián)系宿主胞膜的作用，是頂復(fù)門原蟲毒力關(guān)鍵因子[10-11]；ROP2蛋白家族，包括ROP2、ROP3、ROP4、ROP8以及ROP18等5種蛋白，該家族擁有絲氨酸-蘇氨酸的激酶活性結(jié)構(gòu)域，在蟲體侵入宿主細(xì)胞的過程中分泌ROPs，有助于PV的形成，且分泌后能迅速與納蟲空泡膜（parasitophorous vacuole membrane,PVM）結(jié)合并參與PVM功能的調(diào)節(jié)[12-13]。

2.2 棒狀體基部蛋白在弓形蟲疫苗中的研究 頂復(fù)門原蟲生活史非常復(fù)雜，存在多個(gè)抗原表位。目前研究較多的是基于TgROPs的疫苗在不同小鼠模型中的應(yīng)用。其中DNA疫苗是一種利用質(zhì)粒載體來轉(zhuǎn)移和表達(dá)靶基因的新方法[14]。大量研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DNA疫苗可以激發(fā)和誘發(fā)特定的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)[15]。多數(shù)學(xué)者通過構(gòu)建ROP1、ROP2、ROP4、ROP13、ROP17和ROP18等DNA疫苗對(duì)幼鼠進(jìn)行免疫，結(jié)果顯示幼鼠CD4+T和CD8+細(xì)胞比例可明顯升高[16]。這些DNA疫苗已成為頂復(fù)門原蟲疫苗研究的重要疫苗候選分子。

2.2.1 TgROP1 在弓形蟲核酸疫苗研制中，基因佐劑已成為增強(qiáng)DNA疫苗保護(hù)效能的有效工具。IL-12是控制、限制急性和慢性弓形蟲病的關(guān)鍵促炎細(xì)胞因子[17]。Quan等[18]將IL-12+pGRA7-ROP1聯(lián)合應(yīng)用于BALB/c小鼠可延長其生存時(shí)間，其中在接種致死劑量后28 d內(nèi)，50%小鼠存活，此外，腦組織囊腫的數(shù)量明顯減少。Parthasarathy等[19]通過對(duì)核酸及重組蛋白疫苗進(jìn)行了對(duì)比，將重組的pVAX1-ROP1和純化的rROP1分別注射到不同的小鼠體中，經(jīng)免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)，ROP1是一種免疫原性抗原，可誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，并在免疫小鼠血清中檢測(cè)到目的蛋白條帶。不僅如此，接種ROP1抗原后，小鼠對(duì)強(qiáng)毒株速殖子的感染具有部分保護(hù)作用。這些結(jié)果表明，ROP1抗原是開發(fā)弓形蟲病疫苗的潛在候選抗原。

2.2.2 TgROP2 Leyva等[20]在真核表達(dá)載體pcDNA3中克隆ROP2基因，得到pcDNA3-ROP2重組質(zhì)粒，并將該質(zhì)粒免疫BLAB/c、C57BL/6和CBA/J小鼠，觀察誘發(fā)的小鼠免疫反應(yīng)。通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）和免疫印跡（Western blot,WB）分析顯示，pcDNA3-ROP2重組質(zhì)粒誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生了細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答。其中與空白對(duì)照組相比，BALB/c小鼠的死亡時(shí)間明顯延遲。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)該重組質(zhì)粒免疫的小鼠對(duì)剛地弓形蟲RH強(qiáng)毒株攻擊沒有抵抗，而用減毒活疫苗溫度敏感株ts-4免疫的小鼠產(chǎn)生保護(hù)作用。Vanesa等[21]研究結(jié)果表明，混合免疫rROP2+CpG-ODN可引起強(qiáng)烈的體液反應(yīng)和Th1-biased免疫反應(yīng)，免疫rROP2+CpG-ODN和rROP2+rGRA4+CpG-ODN的C3H/HeN（H-2k）小鼠在口服20個(gè)Me49（Ⅱ型）組織囊腫后， 其腦囊腫負(fù)擔(dān)分別減輕63%和66%。以上研究結(jié)果表明，ROP2可以作為預(yù)防弓形蟲感染的疫苗候選分子。

2.2.3 TgROP4 與ROP2一樣，在弓形蟲入侵宿主細(xì)胞過程中，ROP4參與PV功能的調(diào)節(jié)，在宿主細(xì)胞的黏附、入侵和細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制等方面有著密切的關(guān)系[22]。Dziadek等[23]利用rROP2和rROP4蛋白疫苗免疫C3H/HeJ小鼠，觀察其對(duì)小鼠免疫效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種抗原均產(chǎn)生了對(duì)IgG1特異性抗體的體液反應(yīng)和混合型Th1/Th2細(xì)胞免疫反應(yīng)，表明其有較好的免疫原性。不僅如此，接種rROP2和rROP4疫苗的弓形蟲弱毒株DX株包囊小鼠具有部分保護(hù)作用，腦寄生蟲負(fù)荷顯著降低。目前對(duì)ROP4疫苗的研究相對(duì)較少，但發(fā)現(xiàn)ROP4具有調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)磷酸化的功能，能產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)作用。

2.2.4 TgROP5 ROP5是弓形蟲的主要毒力因子，參與細(xì)胞內(nèi)增殖。該蛋白可顯著降低PVM中免疫相關(guān)GT-Pases的積累，從而維持PVM的完整性。為評(píng)價(jià)重組rROP5的保護(hù)作用機(jī)制，Zheng等[24]以rROP5蛋白對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行三次免疫，首次以100 μg rROP5混勻弗氏完全佐劑進(jìn)行免疫，二免和三免分別為100 μg rROP5混勻弗氏不完全佐劑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，rROP5可以誘導(dǎo)顯著的細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)（Th1/Th2）。此外，用rROP5免疫的小鼠對(duì)剛地弓形蟲RH株的致命挑戰(zhàn)表現(xiàn)出較長的生存時(shí)間?？梢?，rROP5可有效保護(hù)小鼠抵抗弓形蟲的入侵。

2.2.5 TgROP13 Wang等[25]通過構(gòu)建pVAX-ROP13和以IL-18為基因佐劑的pVAX-ROP13DNA疫苗，評(píng)價(jià)TgROP13的免疫原性和免疫保護(hù)作用機(jī)制。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pVAX-ROP13和pIL-18共免疫使小鼠存活率顯著提高。單獨(dú)使用pVAX-ROP13和抗強(qiáng)毒RH株（Ⅰ型）存活時(shí)間分別為32.3±2.7 d、24.9±2.3 d（P＜0.05）。用PRU蟲株（Ⅱ型）攻毒后，pVAXROP13和pVAX-ROP13+pVAX-IL-18免疫小鼠腦囊腫負(fù)荷降低率分別為39.82%和66.03%。這表明以IL-18為基因佐劑的ROP13 DNA疫苗可以引發(fā)對(duì)寄生蟲的強(qiáng)烈體液和細(xì)胞反應(yīng)，被認(rèn)為是一種潛在的有效候選疫苗。

2.2.6 TgROP17 許多研究結(jié)果表明，特異性分泌免疫球蛋白A（secretory immunoglobulin A,SIgA）在粘膜表面起著關(guān)鍵作用，是防御弓形蟲等多種粘膜組織感染的第一道防線[26]。Wang等[27]將RH株弓形蟲ROP17在細(xì)菌中與谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶（Glutathione-S-transferase,GST）融合表達(dá)，采用rTgROP17對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行滴鼻免疫，研究其對(duì)慢性和急性弓形蟲感染的免疫應(yīng)答和保護(hù)作用。結(jié)果表明，經(jīng)過rTgROP17免疫的小鼠產(chǎn)生了高水平的特異性抗rTgROP17 IgGs，增加系統(tǒng)性免疫反應(yīng)有關(guān)Th1（IFN-c、IL-2）和Th2（IL-4）的含量，且增強(qiáng)rTgROP17免疫小鼠淋巴細(xì)胞增殖（刺激指數(shù)SI）。在這些小鼠的鼻腔和腸道沖洗液中也觀察到鼻粘膜免疫反應(yīng)增強(qiáng)，TgROP17促使特異性分泌型IgA（SIgA）分泌增加。與對(duì)照組相比，接種疫苗的小鼠肝臟和大腦寄生蟲負(fù)擔(dān)較低，分別為59.17%和49.08%，對(duì)慢性RH感染表現(xiàn)出明顯的保護(hù)作用。接種疫苗的小鼠對(duì)致命的RH毒株感染也表現(xiàn)出明顯的保護(hù)作用，其存活率增加了50%。

2.2.7 TgROP18 ROP18作為弓形蟲的主要毒力因子，參與控制寄生蟲的細(xì)胞內(nèi)增殖[28]。Yuan等[29]研究結(jié)果表明該蛋白是一種具有前景的候選疫苗，用質(zhì)粒構(gòu)建的pVAX-ROP18在昆明小鼠肌肉內(nèi)免疫可引起特異性體液反應(yīng)，促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，并增加了CD4+和CD8+T細(xì)胞的活化。與對(duì)照組相比，接種1×103株RH株速殖子后，pVAX-ROP18的存活時(shí)間（27.9±15.1 d，P＜0.05）明顯延長。Rashid等[30]采用rTgROP18對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行滴鼻免疫，結(jié)果顯示，有抗ROP18 IgG1抗體產(chǎn)生并發(fā)生混合的系統(tǒng)性Th1/Th2型細(xì)胞免疫應(yīng)答，其特征在于產(chǎn)生了IFN-γ、IL-2、IL-10和IL-5，但是鼻粘膜免疫反應(yīng)較弱。因此，鼻內(nèi)免疫rROP18可以強(qiáng)烈地激發(fā)全身免疫應(yīng)答和粘膜免疫應(yīng)答，對(duì)攻蟲小鼠起到免疫保護(hù)作用。

2.2.8 TgROP19 隨著生物信息學(xué)被廣泛應(yīng)用，表位預(yù)測(cè)成為免疫原性設(shè)計(jì)和逆轉(zhuǎn)疫苗學(xué)中不可或缺的工具[31]。對(duì)ROP候選疫苗進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索，利用生物信息學(xué)分析潛在的B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位，從而引入新的弓形蟲候選疫苗。Zhou等[32]通過對(duì)ROP19和SAG1的抗原特性進(jìn)行分析比較，發(fā)現(xiàn)ROP19在抗原指數(shù)和表面概率上均優(yōu)于SAG1，與SAG1相比，ROP19具有良好的線性B細(xì)胞表位。此外，還預(yù)測(cè)了與ROP19的MHCⅡ類分子結(jié)合的多肽的50%抑制濃度（IC50）值，并估算了ROP19的較低的IC50值，表明ROP19具有活的T細(xì)胞表位，將來可能成為防控弓形蟲病的潛在DNA疫苗候選分子。

2.3 棒狀體蛋白在其他頂復(fù)門原蟲疫苗中的研究 在隱孢子蟲棒狀體蛋白的研究中，Huang等[33]通過蛋白質(zhì)組技術(shù)分離獲得22種潛在的棒狀體蛋白，并鑒定出與剛地弓形蟲和犬新孢子蟲棒狀體蛋白同源的蛋白，以及一些結(jié)構(gòu)域類似于剛地弓形蟲棒狀體蛋白的蛋白，同時(shí)證實(shí)了這22種候選的棒狀體蛋白可作為研究寄生蟲入侵途徑和致病機(jī)制的靶點(diǎn)，在抵抗隱孢子蟲病的感染中發(fā)揮重要作用。

在綿羊巴貝斯蟲的研究中，Niu等[34]通過構(gòu)建RAP-1a重組抗原，經(jīng)ELISA和Western blot結(jié)果顯示，該抗原與被其他病原體感染的動(dòng)物血清間沒有交叉反應(yīng)，對(duì)RAP-1a的高水平抗體滴度一直持續(xù)到感染后10周，可見羊巴貝斯蟲RAP-1a的重組抗原在寄生蟲入侵過程中發(fā)揮重要的作用，是抵抗巴貝斯蟲病感染的重要候 選疫苗和診斷抗原。Collins等[35]通過亞馬遜松鼠猴對(duì)惡性瘧原蟲棒狀體蛋白R(shí)AP1和RAP2進(jìn)行疫苗試驗(yàn)，比較寄生蟲源（PfRAP 1和2）和重組蛋白（rRAP1和2）誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)的效果。結(jié)果表明，含有瘧原蟲棒狀體相關(guān)蛋白R(shí)AP1和RAP2的疫苗對(duì)亞馬遜松鼠猴的療效有著明顯效果，并證實(shí)了ROP1和ROP2是惡性瘧原蟲的潛在候選疫苗。這些研究結(jié)果將為下一步抗瘧疾疫苗的研制提供數(shù)據(jù)，打下理論基礎(chǔ)。

3 棒狀體頸部蛋白及其在頂復(fù)門原蟲疫苗中的研究

3.1 棒狀體頸部蛋白 研究人員在1980年首次發(fā)現(xiàn)并鑒定了瘧原蟲棒狀體頸部蛋白，該蛋白由此被廣泛關(guān)注[36]。目前，對(duì)棒狀體頸部蛋白的研究仍然較少，普遍認(rèn)為其是一類比棒狀體基部蛋白更保守的蛋白[37]。在對(duì)艾美耳球蟲棒狀體細(xì)胞器的研究中，研究人員利用蛋白質(zhì)組技術(shù)分離獲得一組新的棒狀體蛋白，由于這些蛋白位于棒狀體的頸部被命名為棒狀體頸部蛋白，主要包括RON1-8等8種棒狀體頸部蛋白，這些蛋白通常被注釋為藥物治療或免疫預(yù)防的靶標(biāo)分子[38]。在頂復(fù)門原蟲棒狀體頸部蛋白的功能研究中發(fā)現(xiàn)，RON2被認(rèn)為在蟲體入侵宿主細(xì)胞過程中起著最關(guān)鍵的作用：當(dāng)蟲體子孢子或速殖子黏附至宿主細(xì)胞時(shí)，蟲體會(huì)迅速分泌RON2，插入宿主細(xì)胞膜表面，與宿主細(xì)胞相應(yīng)受體作用，同時(shí)與RON4、RON5和RON8蛋白，以及微線分泌的頂膜抗原AMA1發(fā)生特異性結(jié)合，在宿主表面形成環(huán)狀的MJ，蟲體通過“MJ”在數(shù)秒或數(shù)十秒內(nèi)入侵至宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)育繁殖[39]。因此，棒狀體頸部蛋白在細(xì)胞中可驅(qū)動(dòng)寄生蟲的移動(dòng)連接，在結(jié)構(gòu)功能上將蟲體與宿主細(xì)胞串聯(lián)起來，對(duì)于蟲體入侵至關(guān)重要。

3.2 棒狀體頸部蛋白在頂復(fù)門原蟲疫苗中的研究 近年來，人們對(duì)頂復(fù)門原蟲入侵宿主細(xì)胞機(jī)制有了大量的研究，發(fā)現(xiàn)RONs是關(guān)鍵毒力因子，對(duì)蟲體入侵宿主細(xì)胞起著關(guān)鍵作用，可作為潛在的疫苗候選分子。

3.2.1 RON2 RON2蛋白是一類重要的入侵相關(guān)蛋白，Delgadillo等[40]研究表明，在頂復(fù)門不同屬種的原蟲基因組數(shù)據(jù)庫中均存在RON2的同源編碼基因，蛋白結(jié)構(gòu)保守，由1段信號(hào)肽、3段跨膜結(jié)構(gòu)及4段功能結(jié)構(gòu)域組成。戚南山等[41]利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)E.tenella中存在TgRON2的同源蛋白棒狀體頸部蛋白2（E.tenella rhoptry neck protein 2,EtRON2）的基因序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示EtRON2與其他原蟲棒狀體蛋白的氨基酸序列具有一定的相似性，與TgRON2的進(jìn)化關(guān)系最為接近，說明EtRON2在入侵宿主細(xì)胞過程中起著關(guān)鍵作用。王曄等[42]構(gòu)建EtRON2基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGs-EtRON2鑒定EtRON2基因的表達(dá)情況。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IFA顯示轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中檢測(cè)到特異性紅色熒光，Western blot結(jié)果分析具有良好的抗原性。在間日瘧原蟲的研究中，Arevalo-Pinzon等[43]首次鑒定了PvRON2，PvRON2是由單個(gè)6615 bp外顯子編碼的2204個(gè)殘基長蛋白，該外顯子包含對(duì)氨基末端的疏水信號(hào)序列、對(duì)羧基末端的跨膜結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)螺旋卷曲的α-螺旋基序，與其他幾種瘧疾候選疫苗的特征類似。在弓形蟲的研究中發(fā)現(xiàn)，蟲體接觸宿主細(xì)胞后會(huì)分泌RON2蛋白，其氨基端兩段結(jié)構(gòu)域與RON4、5、8形成復(fù)合物插入宿主細(xì)胞膜內(nèi)，與宿主受體互作[44]，羧基端兩段結(jié)構(gòu)域暴露在宿主細(xì)胞膜外，與微線分泌的頂膜抗原AMA結(jié)合，從而形成由RON2、4、5、8及AMA共同組成的蛋白復(fù)合物“運(yùn)動(dòng)結(jié)合體”，介導(dǎo)蟲體對(duì)宿主細(xì)胞的入侵[45]。綜上所述，RON2參與了蟲體對(duì)宿主細(xì)胞的入侵，為最具潛力的棒狀體頸部蛋白候選疫苗分子。

3.2.2 RON4 Alexander等[46]在瘧原蟲的研究中發(fā)現(xiàn)TgRON4的瘧原蟲同源物可與頂膜抗原1（plasmodium falciparum apical membrane antigen 1,PfAMA1）免疫共沉淀，最后鑒定為PfRON4。其功能是在蟲體入侵宿主細(xì)胞過程中與PfAMA1發(fā)生特異性結(jié)合，并形成復(fù)合體在移動(dòng)連接體處遷移，該發(fā)現(xiàn)表明PfRON4蛋白對(duì)于蟲體入侵宿主細(xì)胞過程中起著重要的作用。Rashid等[47]通過對(duì)小鼠接種RON4的DNA疫苗和RON4重組蛋白，進(jìn)行動(dòng)物免疫保護(hù)性實(shí)驗(yàn)，觀察其抗弓形蟲感染的保護(hù)效果，結(jié)果顯示兩者均產(chǎn)生了IgG1特異性抗體以及混合型的Th1/Th2的細(xì)胞免疫應(yīng)答，同時(shí)，IFN-γ、IL-2、IL-5和IL-10等細(xì)胞因子均顯著增加，但是小鼠抵抗慢性弓形蟲病的能力較弱。

3.2.3 RON5 在弓形蟲和瘧原蟲的研究中都表明RON5是MJ的成員蛋白之一[48]，在宿主細(xì)胞和蟲體之間起著連接作用，是寄生蟲入侵必需的關(guān)鍵蛋白。Zhao等[49]構(gòu)建了RON5蛋白真核表達(dá)的重組質(zhì)粒pVAX5-RON5p，并免疫BALB/c小鼠，觀察其對(duì)弓形蟲急慢性感染的保護(hù)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)pVAX5-RON5p免疫可引起小鼠體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，并且免疫組小鼠急性弓形蟲感染后生存時(shí)間比對(duì)照組略有延長。對(duì)于慢性弓形蟲感染，pVAX5-RON5p免疫小鼠的腦組織囊腫數(shù)比空白對(duì)照組減少25.8%?？梢姡琑ON5 DNA疫苗可以針對(duì)急性和慢性弓形蟲感染誘導(dǎo)部分免疫保護(hù)性。

3.2.4 RON8 Besteiro等[50]利用生物化學(xué)方法，確定RON8是MJ復(fù)合物的一個(gè)新成員，與TgAMA-1和RON2、4、5共同形成MJ，所有的MJ蛋白在被轉(zhuǎn)運(yùn)到各自的細(xì)胞器的過程中都經(jīng)歷了蛋白水解的成熟過程，并且在體外以不成熟的形式結(jié)合。通過質(zhì)譜技術(shù)（mass spectrum,MS）分析發(fā)現(xiàn)RON8有2979個(gè)氨基酸，理論分子量為329 kDa。此外，在弓形蟲、新孢子蟲和艾美耳球蟲中都可以發(fā)現(xiàn)RON8，但在瘧原蟲中暫未發(fā)現(xiàn)其同源序列[51]。Straub等[52]通過缺失弓形蟲RON8蛋白編碼基因，首次對(duì)MJ/RON蛋白進(jìn)行功能分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺失RON8的蟲體在對(duì)宿主細(xì)胞的附著和入侵方面都受到嚴(yán)重?fù)p害，這表明RON8能夠使寄生蟲在宿主細(xì)胞上建立牢固的結(jié)合，并進(jìn)行入侵。另外，缺陷Δron8蟲體在入侵宿主細(xì)胞時(shí)，MJ復(fù)合物會(huì)出現(xiàn)紊亂的現(xiàn)象。因此，推測(cè)RON8在弓形蟲入侵宿主細(xì)胞以及MJ復(fù)合物形成的過程中發(fā)揮著重要作用。

3.2.5 RON9和RON10 目前有研究表明，剛地弓形蟲的兩個(gè)新棒狀體頸部蛋白：RON9和RON10，它們之間可形成一個(gè)高分子量復(fù)合物。與其他RON蛋白相比，這種復(fù)合物在入侵宿主細(xì)胞期間沒有在MJ中檢測(cè)到，可見，RON9和RON10與MJ復(fù)合物的形成無關(guān)。學(xué)者通過敲除RON9實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)RON10在棒狀體內(nèi)發(fā)生錯(cuò)位定位；若敲除RON10，則會(huì)影響RON9蛋白分泌到棒狀體，這表明RON9/RON10復(fù)合物的形成是相互作用的結(jié)果[53]。此外，還發(fā)現(xiàn)RON9/RON10復(fù)合物的缺失對(duì)棒狀體的形態(tài)、蟲體對(duì)宿主細(xì)胞的入侵和生長以及蟲體自身毒力都無顯著影響。但在球蟲和隱孢子蟲中，該復(fù)合物的缺失與蟲體在腸上皮細(xì)胞內(nèi)的發(fā)育有一定的關(guān)系。

4 展望

目前，頂復(fù)門原蟲侵入宿主細(xì)胞的詳細(xì)機(jī)制尚不明晰。隨著分子生物學(xué)、生物信息學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，在分子水平上對(duì)棒狀體蛋白入侵過程的作用機(jī)制和功能的研究將逐漸深入。下一步可重點(diǎn)研究在蟲體入侵宿主細(xì)胞過程中，棒狀體蛋白的分泌及其與宿主細(xì)胞受體相互作用等的詳細(xì)機(jī)制及信號(hào)通路等。相信隨著棒狀體蛋白特性和功能的深入研究，頂復(fù)門原蟲入侵、致病機(jī)制將逐漸明了，這也為防控該類原蟲病疫苗及藥物的研發(fā)提供有效的信息，為更好防控原蟲病提供新的思路。