劉福童， 李茂森， 陳敏， 張賽， 張福建， 王生才， 趙培炎， 宋安東，方明， 任天寶， 劉國順

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)/河南省生物炭研究工程技術(shù)中心/生物炭技術(shù)河南省工程實驗室，河南 鄭州 450002；2.湖南省煙草郴州市公司，湖南 郴州 423000； 3. 安徽中煙工業(yè)有限責(zé)任公司， 安徽 合肥 230000)

湖南煙區(qū)是中國主要的烤煙產(chǎn)區(qū)之一，而郴州市是湖南省重要的煙葉生產(chǎn)區(qū)。煙葉種植過程中的連作和不合理的施用化肥等現(xiàn)象，都會導(dǎo)致植煙土壤肥力下降、酸化、板結(jié)、病害、蟲害和土壤微生物群落改變等諸多問題[1-4]，進(jìn)而影響烤煙經(jīng)濟(jì)效益。微生物是土壤的組成部分之一，而細(xì)菌是土壤微生物中數(shù)量最多的類群[5]，其群落結(jié)構(gòu)和功能具有重要的作用，它的代謝產(chǎn)物和殘留物可以影響土壤中物質(zhì)循環(huán)、能量循環(huán)和土壤結(jié)構(gòu)變化[6-8]。土壤酶是細(xì)菌代謝產(chǎn)物中重要的組成部分，其作用主要體現(xiàn)在土壤生物化學(xué)反應(yīng)和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)方面[9]。

高碳基土壤修復(fù)肥主要成分為生物炭、發(fā)酵餅肥和礦物質(zhì)復(fù)配制成的一種新型生物碳基肥料[10]。近年來，高碳基土壤修復(fù)肥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得到較大范圍的推廣，對土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響有著重要的作用[11]。研究高碳基土壤修復(fù)肥對烤煙根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及酶活性的影響，對其在煙草種植過程中的應(yīng)用具有重要的意義。

目前，高碳基土壤修復(fù)肥在改良植煙土壤理化性狀[12]，提高養(yǎng)分含量，促進(jìn)烤煙生長和改善烤煙品質(zhì)[13]等方面有較多研究，但有關(guān)高碳基土壤修復(fù)肥對烤煙根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及煙葉產(chǎn)值的影響尚不明確。為此，本研究以湖南郴州地區(qū)植煙土壤為研究對象，采用高通量測序技術(shù)研究高碳基土壤修復(fù)肥對烤煙根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及煙葉產(chǎn)值的影響，為烤煙根際土壤細(xì)菌調(diào)控、煙草栽培、提高煙葉品質(zhì)方面和提高煙農(nóng)經(jīng)濟(jì)效益，促進(jìn)當(dāng)?shù)責(zé)煵菘沙掷m(xù)高質(zhì)量發(fā)展等方面提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗于2021年1月—7月在湖南省郴州市桂陽煙區(qū)進(jìn)行，土壤類型為水稻土，基礎(chǔ)養(yǎng)分指標(biāo)如下：pH值為5.44，堿解氮含量為72.61 mg·kg-1，有機質(zhì)含量為33.40 g·kg-1，速效磷含量為14.75 mg·kg-1，速效鉀含量為95.14 mg·kg-1。煙草品種為湘煙7號。高碳基土壤修復(fù)肥由河南省生物炭工程技術(shù)中心研制，河南惠農(nóng)土質(zhì)保育研發(fā)有限公司加工，主要成分包含生物炭和植物油粕等，高碳基土壤修復(fù)肥組成：生物炭含量40.51%，發(fā)酵芝麻餅肥含量20.16%。高碳基土壤修復(fù)肥養(yǎng)分含量：有機質(zhì)含量為45.21%，N含量為1.02%，P2O5含量為1.12%，K2O含量為2.90%。

1.2 試驗設(shè)計

采用隨機區(qū)組試驗設(shè)計，共設(shè)置2個處理，CK(常規(guī)施肥)，T(常規(guī)施肥+高碳基土壤修復(fù)肥600 kg·hm-2)，每個處理設(shè)置3個小區(qū)，小區(qū)面積為150 m2。常規(guī)施肥采用穴施(專用基肥750 kg·hm-2；提苗肥135 kg·hm-2；發(fā)酵餅肥450 kg·hm-2；專用追肥750 kg·hm-2；硫酸鉀225 kg·hm-2)。高碳基土壤修復(fù)肥采用穴施，施用量為600 kg·hm-2。

栽培管理：按照當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)生產(chǎn)栽培管理辦法進(jìn)行大田管理，2021年4月施入基肥和移栽煙草幼苗，煙株4月中下旬進(jìn)入旺長期，5月15日現(xiàn)蕾，5月16日—5月20日進(jìn)行打頂抹腋芽，6月20日開始采收下部葉，分3次采收，7月15日采收結(jié)束，試驗地與當(dāng)?shù)卦耘喙芾硪恢隆?/p>

1.3 土壤取樣

土壤樣品采集于2021年煙葉成熟期，按照五點取樣法取煙株根系周圍(深度0～25 cm)的土壤，將采集的土壤樣品按照四分法混合后分為2份，一部分去除在雜質(zhì)后，保存在10 mL無菌離心管中，對土壤進(jìn)行微生物群落檢測及酶活性的檢測；另一部分下自然風(fēng)干(避光)，進(jìn)行土壤理化性質(zhì)的測定。

1.4 土壤理化性質(zhì)及酶活性分析

土壤化學(xué)性質(zhì)測定方法參照文獻(xiàn)[14]，土壤酶活性測定方法：蔗糖酶采用DNS比色法，脲酶采用Berthelot法，中性磷酸酶采用磷酸苯二鈉法，過氧化氫酶采用紫外吸收法。土壤含水率采用土壤溫濕度測量儀(Moisture Meter HH2)測定。

1.5 土壤微生物測定分析方法

土壤細(xì)菌測定：采用E.Z.N.A.?soil試劑盒進(jìn)行土壤DNA提取和PCR擴增，利用超微量分光光度計檢測DNA純度，檢測合格后用341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和806R(5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)引物對V3～V4可變區(qū)[15]進(jìn)行PCR擴增，用2%瓊脂糖膠回收PCR產(chǎn)物，混合后送IlluminaMiSeq平臺進(jìn)行基因序列測定[16]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2020整理數(shù)據(jù)，用SPSS 25.0進(jìn)行t檢驗，用R語言軟件的vegan包繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高碳基土壤修復(fù)肥對土壤理化性質(zhì)的影響

由表1可以得出，植煙土壤施用高碳基土壤修復(fù)肥可以改變植煙土壤特性。從物理特性來看，與CK相比，T處理增加了土壤含水率(24.17%)。從化學(xué)性質(zhì)來看，高碳基土壤修復(fù)肥的施加能夠增加土壤pH值和養(yǎng)分含量，其中提高了土壤pH值(1.07個單位)、有機質(zhì)(23.59%)和堿解氮(17.41%)，且到達(dá)顯著水平。

表1 高碳基土壤修復(fù)肥對土壤理化性質(zhì)的影響Table 1 The effect of high carbon-based soil remediation fertilizer on the physical and chemical properties of soil

2.2 高碳基土壤修復(fù)肥對土壤酶活性的影響

由圖1可以得出，T處理提高了土壤蔗糖酶活性(97.65%)、中性磷酸酶活性(363.64%)、脲酶活性(356.60%)和過氧化氫酶活性(19.02%)，且達(dá)到顯著水平。

注：柱上不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。

2.3 高碳基土壤修復(fù)肥對土壤細(xì)菌群落α多樣性的影響

從表2可以得出，T處理提高了細(xì)菌的Chao指數(shù)、Observed_OTUS指數(shù)和Shannon指數(shù)，降低了Simpson指數(shù)，且均達(dá)到顯著水平，說明添加高碳基土壤修復(fù)肥可以顯著增加土壤細(xì)菌多樣性和豐富度。

表2 高碳基土壤修復(fù)肥對土壤細(xì)菌群落α多樣性的影響Table 2 Effects of high carbon-based soil remediation fertilizers on soil bacterial community α diversity

2.4 高碳基土壤修復(fù)肥對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

由圖2可以看出，相對豐度前10種的菌門中，T處理相比于CK處理，分別增加了綠灣菌門2.74%的相對豐度、變形菌門1.84%的相對豐度、厚壁菌門2.04%的相對豐度、擬桿菌門5.27%的相對豐度、放線菌門5.43%的相對豐度和奇古菌門2.85%的相對豐度；降低了芽單胞菌門12.37%的相對豐度、酸桿菌門2.43%的相對豐度、硝化螺旋菌門3.35%的相對豐度和GAL15菌門2.83%的相對豐度。

通過計算細(xì)菌門水平上相對豐度的變化倍數(shù)(fold chang，F(xiàn)C)來衡量變化的大小，結(jié)合P值，篩選出土壤中變化幅度較大菌門。從圖3可以得出，T處理相比于CK處理，GAL15菌門、芽單胞菌門和硝化螺旋菌門相對豐度顯著降低，且變化倍數(shù)高于2，而奇古菌門相對豐度顯著性增加，且變化倍數(shù)高于2。

圖2 高碳基土壤修復(fù)肥對土壤細(xì)菌門水平上相對豐度的影響Fig.2 Effects of high carbon-based soil remediation

每個點代表一個門水平上細(xì)菌類型。橫坐標(biāo)為變化倍數(shù)FC，縱坐標(biāo)為t檢驗P值。

2.5 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)相關(guān)性分析

由圖4可以看出，奇古菌門與含水率(P=0.019)和堿解氮(P=0.049)呈顯著正相關(guān)關(guān)系；GAL15菌門與含水率(P=-0.042)和堿解氮(P=-0.036)呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與速效鉀(P=-0.007)和pH值(P=-0.005)呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；芽單胞菌門與速效磷(P=-0.024)和有機質(zhì)(P=-0.018)呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；硝化螺旋菌門與速效磷(P=-0.007)和有機質(zhì)(P=-0.004)呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與堿解氮(P=-0.049)和pH值(P=-0.041)呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。

2.6 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤酶活性相關(guān)性分析

由圖5可以看出，GAL15菌門與蔗糖酶活性(P=-0.004)呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；芽單胞菌門與中性磷酸酶活性(P=-0.039)呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；硝化螺旋菌門與中性磷酸酶活性(P=-0.039)和蔗糖酶活性(P=-0.041)呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；奇古菌門與中性磷酸酶活性(P=0.039)呈顯著正相關(guān)關(guān)系。

AP:速效磷；OM：有機質(zhì)；SWC：含水率；AN：堿解氮；AK：速效鉀；pH：pH值；*表示P<0.05，**表示P<0.01。

NPH：中性磷酸酶；INV：蔗糖酶；CAT：過氧化氫酶；URE：脲酶；*表示P<0.05，**表示P<0.01。

2.7 高碳基土壤修復(fù)肥對煙葉經(jīng)濟(jì)性狀的影響

由表3可以得出，施用高碳基土壤修復(fù)肥與對照相比經(jīng)濟(jì)性狀差異顯著，主要指標(biāo)都高于普通對照。從煙葉的均價來看，T處理均價達(dá)到25.92元·kg-1，與對照相比提高了7.51%。與對照相比，上等煙比例提高到63.37%，提高12.74%；在產(chǎn)量產(chǎn)值方面，與對照相比分別提高4.32%和12.15%。綜合分析可以看出，施用高碳基土壤修復(fù)肥能夠顯著提升煙葉經(jīng)濟(jì)性狀，有利于提高煙農(nóng)經(jīng)濟(jì)效益。

表3 高碳基土壤修復(fù)肥對煙葉經(jīng)濟(jì)性狀的影響 Table 3 Effects of high carbon-based soil remediation fertilizers on economic traits of tobacco leaves

3 結(jié)論與討論

3.1 高碳基土壤修復(fù)肥對土壤理化性質(zhì)及酶活性的影響

植煙土壤施加高碳基土壤修復(fù)肥后，提高了土壤有機質(zhì)、堿解氮、速效磷、速效鉀、pH值和含水率，其中有機質(zhì)含量、堿解氮含量、pH值和含水率達(dá)到顯著水平。有研究表明，高碳基土壤修復(fù)肥能夠有效地提高土壤肥力，生物炭特殊的孔狀結(jié)構(gòu)能夠有效地降低土壤水分流失，增加土壤含水率[17]。高碳基土壤修復(fù)肥本身具有一定的灰分，施用后能夠有效提高土壤酸性鹽基飽和度，進(jìn)而降低交換性陽離子含量，提高土壤pH值[18]。常棟等[19]和李文淵[12]等研究結(jié)果表明了施加高碳基土壤修復(fù)肥可以顯著提高土壤有機質(zhì)含量，這與高碳基土壤修復(fù)肥本身是一種富含高碳的有機肥料有關(guān)，與前人的研究結(jié)果相印證。

植煙土壤施加高碳基土壤修復(fù)肥后，顯著提高了土壤酶活性。有研究表明，土壤中酶含量主要來自于微生物和動植物[20-21]。在微生物中，細(xì)菌在數(shù)量和作用中均占有重要的作用。因此，土壤酶活性與細(xì)菌必然存在著緊密聯(lián)系，在細(xì)菌與酶活性相關(guān)性分析中得以印證。

3.2 土壤細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)對高碳基土壤修復(fù)肥施用后的響應(yīng)

植煙土壤施加高碳基土壤修復(fù)肥后，提高了細(xì)菌Chao指數(shù)、Observed_OTUS、Shannon指數(shù)，降低了Simpson指數(shù)，且達(dá)到顯著水平；顯著降低了GAL15菌門、芽單胞菌門和硝化螺旋菌門的相對豐度，顯著增加了奇古菌門的相對豐度。GAL15菌門與蔗糖酶活性呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；芽單胞菌門與中性磷酸酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與馮慧琳等[22]的研究結(jié)果一致；硝化螺旋菌門與中性磷酸酶活性和蔗糖酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；奇古菌門與中性磷酸酶活性呈顯著正相關(guān)關(guān)系。

硝化螺旋菌門與堿解氮和pH呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與前人的研究結(jié)果一致[23-26]。這可能是由于它參與亞硝酸鹽氧化和氮碳循環(huán)所造成的[27]。奇古菌門與含水率和堿解氮呈顯著正相關(guān)關(guān)系，與馬曉英等[28]研究結(jié)果一致。奇古菌門作為一個豐富的古生菌門，在土壤碳氮循環(huán)中具有重要的作用，其中最具特征的成員是化能自養(yǎng)型氨氧化古菌(AOA)。高碳基土壤修復(fù)肥可以改變土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)并影響其功能，促進(jìn)土壤養(yǎng)分的利用。

3.3 高碳基土壤修復(fù)肥對煙葉經(jīng)濟(jì)性狀的影響

植煙土壤施用高碳基土壤修復(fù)肥后，均價提高了7.51%。與對照相比，上等煙比例提高了12.74%；產(chǎn)量、產(chǎn)值分別提高了4.32%和12.15%。

綜上所述，施加高碳基土壤修復(fù)肥可以改善土壤保水及酸化問題，驅(qū)動植煙土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)而影響到土壤酶活性，促進(jìn)煙葉產(chǎn)量、產(chǎn)值的增加。也可為烤煙根際土壤細(xì)菌調(diào)控、煙草栽培、提高煙葉品質(zhì)方面和提高煙農(nóng)經(jīng)濟(jì)效益，促進(jìn)當(dāng)?shù)責(zé)煵菘沙掷m(xù)高質(zhì)量發(fā)展等方面提供理論參考。