楊淳婷，馮雨晴，李玉靜，趙園園，張夢(mèng)玥，周駿，頓松陽，王雪芬，史宏志

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院/煙草農(nóng)業(yè)減害研究中心/煙草行業(yè)煙草栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002； 2.上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司北京卷煙廠，北京 100024；3.河南省煙草公司許昌市公司襄城縣分公司，河南 許昌 461700)

生物堿是煙草屬(Nicotiana)植物一類重要化學(xué)成分，其中煙堿占總生物堿含量的90%以上[1]。煙堿具有較強(qiáng)的生物活性，是煙葉和煙氣中重要的生理活性成分，可通過血液進(jìn)入腦細(xì)胞，進(jìn)而產(chǎn)生生理反應(yīng)[2]，被普遍認(rèn)為是吸煙者產(chǎn)生吸煙沖動(dòng)和對(duì)煙草產(chǎn)生依賴性或致癮性的核心成分，因而國際社會(huì)試圖通過降低煙葉中的煙堿含量降低煙草消費(fèi)[3]，近年來國際煙草界關(guān)注的熱點(diǎn)是把煙堿含量降低致使人上癮的閾值以下[4]。煙葉的煙堿含量主要受遺傳、生態(tài)、農(nóng)藝等措施的影響，低煙堿及超低煙堿煙葉的生產(chǎn)途徑主要有農(nóng)藝措施調(diào)控、常規(guī)育種和遺傳工程等[5]。利用自然變異育成的低煙堿品系LAB21，其煙堿含量仍高于提出的限定標(biāo)準(zhǔn)，且煙株農(nóng)藝性狀和煙葉化學(xué)成分與常規(guī)的正常煙堿含量煙葉相比有一定的變化[6-8]，除此之外，通過敲除、沉默基因等分子手段調(diào)控?zé)焿A合成的關(guān)鍵基因，可以使煙葉煙堿含量降至極低水平，但鑒于轉(zhuǎn)基因煙草應(yīng)用的限制，還難以在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用[9-11]。

嫁接技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用在園藝作物，尤其是瓜果、蔬菜類作物上[12-15]。優(yōu)良砧木或接穗可以顯著促進(jìn)嫁接植物生長，提高其抗逆性及果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)，是一種綠色安全可持續(xù)的方法[16]。嫁接可提高嫁接苗青枯病的抗性，延緩煙草青枯病的發(fā)生[17-18]。DAWSON[19]通過嫁接手段證明了煙草煙堿的合成部位位于根部。史宏志教授課題組前期研究表明，烤煙與茄子嫁接可生產(chǎn)出煙堿含量極低的煙葉，且調(diào)制后煙葉特有亞硝胺(tobacco specthfic N-nitrosamines,TSNAs)含量顯著降低，但煙葉成熟變慢，勁頭明顯下降，消費(fèi)者愉悅感、滿足感、接受度顯著降低，烤煙與茄子嫁接后碳氮分配和碳氮代謝可能發(fā)生變化[20]。此外，通過白肋煙和烤煙嫁接可顯著提高白肋煙氮代謝能力[21]，現(xiàn)有研究證實(shí)了應(yīng)用嫁接技術(shù)調(diào)控?zé)熑~物質(zhì)含量的可行性。

白肋煙是世界第二大煙草類型，采用晾制方法調(diào)制而成，因其組織結(jié)構(gòu)疏松、彈性好、填充力強(qiáng)及香氣量足，而成為混合型卷煙的主要原料[22]，生產(chǎn)低/超低煙堿混合型卷煙不僅需要低煙堿烤煙，也需要低煙堿白肋煙煙葉。目前，已有研究通過煙茄嫁接的方法生產(chǎn)出超低煙堿烤煙，而通過煙茄嫁接技術(shù)生產(chǎn)超低煙堿白肋煙的研究未見報(bào)道。據(jù)此，本研究選取白肋煙品種鄂煙1號(hào)和紫皮茄子為材料進(jìn)行嫁接處理，研究白肋煙與茄子種間嫁接降低生物堿含量的可行性及效果，以期為通過農(nóng)業(yè)措施大幅度降低白肋煙煙堿含量和生產(chǎn)超低煙堿混合型卷煙提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)與材料

試驗(yàn)于2021年在河南省許昌市襄城縣紫云鎮(zhèn)塑料大棚(長40 m，寬8 m，高2 m)進(jìn)行，以白肋煙品種鄂煙1號(hào)(由湖北煙草公司提供)和紫皮茄子(茄苗購于襄城縣農(nóng)貿(mào)市場(chǎng))為材料，鄂煙一號(hào)采用漂浮育苗的方式育苗。試驗(yàn)地有機(jī)質(zhì)為15.65 g·kg-1，速效鉀為146.43 mg·kg-1，速效磷為25.82 mg·kg-1，堿解氮為78.76 mg·kg-1，pH值為7.53。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

煙株長至5～6片真葉時(shí)，挑選長勢(shì)均勻一致且莖部沒有木質(zhì)化的茄子苗和煙苗，采用斜切接法進(jìn)行嫁接。用刀片在距茄子苗或者煙苗根部5～6 cm處斜切，斜面長為1～1.5 cm，角度約為30°，斜切面以下部分作為砧木。用刀片斜切取煙苗頂端2～3片真葉作為接穗，將接穗與砧木貼合在一起，用圓口嫁接夾(塑料材質(zhì))固定好。嫁接苗前3 d避光處理，7 d后正常管理。2021-04-30嫁接，2021-05-14移栽，2021-07-20打頂，行株距為1.20 m×0.50 m，施氮量為150 kg·hm-2，肥料為煙草專用復(fù)合肥(m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=15∶15∶15)、硫酸鉀、硝酸鉀、過磷酸鈣。在煙株整個(gè)生長過程中，嫁接口不能被土壤覆蓋，且要及時(shí)去除茄子生長出的腋芽，其他栽培管理措施及病蟲害防治均按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙生產(chǎn)技術(shù)方案。

試驗(yàn)共設(shè)3個(gè)處理，T1：正常生長的白肋煙鄂煙一號(hào)；T2：白肋煙自嫁接(接穗和砧木都是鄂煙1號(hào))；T3：白肋煙與茄子嫁接(以鄂煙1號(hào)為接穗，紫皮茄子為砧木)。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)小區(qū)15株，重復(fù)3次，共135株煙。

鮮煙樣：在嫁接后60、90 d，取各處理中、上部葉，用液氮速凍后，將樣品放在真空冷凍干燥機(jī)(LGJ-10，北京松源華興科技發(fā)展有限公司)中冷凍干燥，然后經(jīng)研磨后過25.4 mm篩用于硝酸鹽、生物堿和化學(xué)成分測(cè)定。

調(diào)制后樣：煙葉正常成熟采收，各處理選取中部葉、上部葉，編竿后掛牌標(biāo)記，統(tǒng)一晾制。晾制結(jié)束后的樣品一部分經(jīng)冷凍干燥后，研磨過25.4 mm篩，用于硝酸鹽、生物堿、化學(xué)成分、TSNAs、氨基酸含量測(cè)定；另一部分樣品切絲卷制成試驗(yàn)卷煙，用于感官質(zhì)量評(píng)價(jià)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目和方法

1.3.1 農(nóng)藝性狀的測(cè)定 在嫁接后45和80 d，各處理分別選擇5株有代表性的煙株，用軟尺測(cè)量其株高、莖圍、有效葉數(shù)及最大葉長和葉寬。

1.3.3 TSNAs的測(cè)定 樣品送至上海煙草集團(tuán)北京卷煙廠進(jìn)行TSNAs測(cè)定，測(cè)定方法為在線SPE-液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(SPE-LC-MS/MS)法(SPE-LC：Spark Holland，Symbiosis(Pico)；MS/MS：AB Sciex triple quad 5500)。稱取1.0 g樣品放入50 mL錐形瓶中，加入4種氘代TSNAs(內(nèi)標(biāo))溶液(5 000 ng·mL-1)40 μL和100 mmol·L-1乙酸銨溶液30 mL，室溫下振蕩(200 r·min-1)萃取60 min，萃取液過0.45 μm水相濾膜，LC-MS/MS檢測(cè)煙草特有亞硝胺(tobacco-specific nitrosamines，TSNAs)。N-亞硝基降煙堿(NNN)、4-(甲基亞硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亞硝基假木賊堿(NAB)和N-亞硝基新煙堿(NAT)的含量總和為總TSNAs[25-26]。

1.3.4 氨基酸含量的測(cè)定 取調(diào)制后中部葉烘干、研磨、過篩后，采用高效液相色譜法，在蘇州科銘生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 感官質(zhì)量評(píng)價(jià) 由國家煙草栽培生理生化研究基地和河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司等單位評(píng)吸專家按照河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司感官評(píng)價(jià)方法分別進(jìn)行感官品質(zhì)評(píng)價(jià)。按照香氣質(zhì)、香氣量、雜氣、濃度、勁頭、刺激性、余味、燃燒性共8個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)打分。

2 結(jié)果與分析

2.1 白肋煙與茄子嫁接對(duì)白肋煙煙株農(nóng)藝性狀的影響

對(duì)不同處理間煙株農(nóng)藝性狀結(jié)果分析可知，各處理的葉長、葉寬、株高、莖圍、有效葉數(shù)差異均不顯著，白肋煙與茄子嫁接后煙株長勢(shì)沒有顯著變化(表1)。嫁接后45 d，葉長、葉寬、莖圍以T1處理較大，株高以T3處理較大。嫁接后80 d，葉長、葉寬、株高、莖圍以T1處理較大，且T1與T2處理的最大葉長、葉寬均大于T3處理。表明嫁接處理對(duì)白肋煙煙株生長以及形態(tài)建成影響較小。

2.2 白肋煙與茄子嫁接對(duì)白肋煙生物堿含量的影響

2.2.1 白肋煙與茄子嫁接對(duì)鮮煙葉生物堿含量的影響 對(duì)鮮煙葉生物堿含量分析可知，煙茄嫁接后白肋煙鮮煙葉生物堿含量顯著降低，成熟期煙堿含量降低至0.079 8%，且未檢測(cè)出降煙堿和新煙草堿(表2)。嫁接后60 d，各處理煙堿、降煙堿、假木賊堿、新煙草堿以及總生物堿含量存在顯著差異；與T1處理相比，T2處理煙堿、總生物堿含量分別升高65.69%%、65.89%，T3處理的煙堿、總生物堿含量分別降低94.81%、95.10%。嫁接后90 d，與T1相比，T2處理煙堿、降煙堿、假木賊堿、新煙草堿及總生物堿含量無顯著差異，T3處理煙堿、假木賊堿及總生物堿含量降低，其中T3處理煙堿、總生物堿含量較T1處理分別降低97.35%、97.33%。上述結(jié)果表明，以茄子為砧木、白肋煙為接穗能有效降低鮮煙葉生物堿含量。

表1 白肋煙與茄子嫁接對(duì)白肋煙煙株農(nóng)藝性狀的影響 Table 1 Effect of burley tobacco and eggplant grafting on agronomic characters of burley tobacco

表2 白肋煙與茄子嫁接對(duì)鮮煙生物堿含量的影響 Table 2 Effect of burley tobacco and eggplant grafting on content of alkaloids in fresh burley tobacco leaves %

2.2.2 白肋煙與茄子嫁接對(duì)調(diào)制后煙葉生物堿含量的影響 由表3可知，白肋煙與茄子嫁接可有效降低調(diào)制后煙葉煙堿含量，其中煙茄嫁接后上部葉煙堿含量降低至0.120 1%，中部葉煙堿含量降低至0.088 0%。T3處理中、上部煙葉的煙堿、降煙堿、假木賊堿及總生物堿含量均顯著低于T1和T2處理，其中T3上部葉煙堿、總生物堿含量較T1處理降低97.04%、96.74%，中部葉煙堿、總生物堿含量較T1處理降低97.59%、97.18%。表明煙茄嫁接能夠大幅降低白肋煙葉片煙堿及總生物堿含量。

表3 白肋煙與茄子嫁接對(duì)調(diào)制后生物堿含量的影響 Table 3 Effect of burley tobacco and eggplant grafting on content of alkaloids in cured burley tobacco leaves %

2.3 白肋煙與茄子嫁接對(duì)白肋煙常規(guī)化學(xué)成分的影響

2.3.1 白肋煙與茄子嫁接對(duì)鮮煙葉常規(guī)化學(xué)成分的影響 對(duì)白肋煙鮮煙葉常規(guī)化學(xué)成分分析可知，白肋煙與茄子嫁接后葉片化學(xué)成分有顯著變化(表4)，其中嫁接后60和90 d，T3處理的硝酸鹽含量較T1分別降低30.00%和32.28%。嫁接后60 d，T2處理常規(guī)化學(xué)成分含量較T1無顯著差異；T3處理還原糖、總氮含量均顯著低于T1和T2處理，糖堿比值、氮堿比值大于T1和T2處理。嫁接后90 d，T2處理常規(guī)化學(xué)成分含量及糖堿比值、氮堿比值較T1均無顯著差異；T3處理總氮含量顯著低于T1以及T2處理，總糖、還原糖含量及糖堿比值、氮堿比值大于T1和T2處理。

表4 白肋煙與茄子嫁接對(duì)鮮煙葉常規(guī)化學(xué)成分的影響 Table 4 Effect of burley tobacco and eggplant grafting on chemical composition in fresh burley tobacco leaves

2.3.2 白肋煙與茄子嫁接對(duì)調(diào)制后煙葉常規(guī)化學(xué)成分的影響 對(duì)調(diào)制后煙葉常規(guī)化學(xué)成分分析可知，白肋煙煙葉常規(guī)化學(xué)成分受根系影響較大，白肋煙與茄子嫁接后葉片總糖、還原糖、淀粉含量升高，硝酸鹽、總氮、蛋白質(zhì)含量顯著降低(表5)，其中T3處理上、中部葉硝酸鹽含量較T1分別降低13.47%、13.39%。對(duì)上部葉，不同處理間總糖、還原糖含量無顯著差異，T2處理硝酸鹽、總氮、蛋白質(zhì)和淀粉含量及糖堿比值、氮堿比值較T1差異不顯著，T3處理淀粉含量及糖堿比值、氮堿比值顯著高于T1和T2處理，硝酸鹽、總氮、蛋白質(zhì)含量顯著低于T1和T2處理。對(duì)中部葉，T2處理常規(guī)化學(xué)成分含量及糖堿比值、氮堿比值較T1無顯著差異，T3處理總糖、還原糖、淀粉含量及糖堿比值、氮堿比值均高于T1、T2處理，硝酸鹽、總氮和蛋白質(zhì)含量較T1、T2處理顯著降低。

表5 白肋煙與茄子嫁接對(duì)調(diào)制后煙葉常規(guī)化學(xué)成分的影響 Table 5 Effect of burley tobacco and eggplant grafting on chemical composition in cured burley tobacco leaves

2.4 白肋煙與茄子嫁接對(duì)調(diào)制后煙葉TSNAS含量的影響

白肋煙與茄子嫁接后，調(diào)制后煙葉NNN、NAT、NAB、NNK及TSNAs含量均顯著降低(表6)。對(duì)上部葉，T2處理的NNN、NAT、NAB、NNK以及TSNAs含量較T1無顯著差異，T3處理的NNN、NAT、NAB、NNK以及TSNAs含量均顯著低于T1和T2處理，其中T3處理NNN、NNK和TSNAs含量較T1分別降低76.02%、77.11%、75.68%。對(duì)中部葉，各處理NNN、NAT、NAB、NNK、TSNAs含量變化規(guī)律與上部葉一致，其中T3處理NNN、NNK和TSNAs含量較T1分別降低78.66%、83.92%、84.01%。結(jié)果表明，煙茄嫁接對(duì)白肋煙NNN、NAT、NAB、NNK以及TSNAs含量有顯著影響。

表6 白肋煙與茄子嫁接對(duì)調(diào)制后煙葉TSNAs含量的影響 Table 6 Effect of burley tobacco and eggplant grafting on content of TSNAs in cured burley tobacco leaves μg·g-1

續(xù)表 Continuing table μg·g-1

2.5 白肋煙與茄子嫁接對(duì)調(diào)制后中部葉氨基酸含量的影響

不同處理17種氨基酸含量以及氨基酸總量測(cè)定結(jié)果見表7。與T1相比，T2處理氨基酸總量無顯著差異，T3處理氨基酸總量增加；不同處理間谷氨酸、絲氨酸、丙氨酸含量存在顯著差異，均表現(xiàn)為T3>T2>T1；不同處理的甘氨酸、精氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸變化規(guī)律一致，T2處理與T1相比差異不顯著，但均與T3處理存在顯著性差異，且均以T3處理含量最高；各處理組氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸含量變化規(guī)律一致，表現(xiàn)為T3>T1>T2，其中T2處理較T1差異不顯著，但均與T3處理存在顯著差異，均以T3處理含量最高；T2處理半胱氨酸含量較T1無顯著差異但顯著高于T3處理；不同處理天冬氨酸、脯氨酸含量差異不顯著。這表明嫁接處理能夠改變白肋煙調(diào)制后煙葉氨基酸積累量。

2.6 白肋煙與茄子嫁接對(duì)煙葉感官質(zhì)量的影響

由表8可知，煙茄嫁接對(duì)白肋煙對(duì)中、上部葉感官質(zhì)量影響效果基本一致。與T1處理相比，T2處理煙葉感官質(zhì)量無顯著差異，但T3處理煙葉香氣量、勁頭、刺激性減小。結(jié)果表明，煙茄嫁接能夠影響白肋煙煙葉感官品質(zhì)，對(duì)勁頭和刺激性有顯著影響。

表7 白肋煙與茄子嫁接對(duì)調(diào)制后煙葉氨基酸含量的影響 Table 7 Effect of burley tobacco and eggplant grafting on content of amino acid in cured burley tobacco leaves g·kg-1

表8 白肋煙與茄子嫁接對(duì)調(diào)制后煙葉感官質(zhì)量評(píng)價(jià)的影響 Table 8 Effect of burley tobacco and eggplant grafting on sensory quality in cured burley tobacco leaves

3 結(jié)論與討論

煙堿主要在根部合成，然后通過木質(zhì)部運(yùn)輸?shù)降厣喜?。通過煙茄嫁接的方法對(duì)白肋煙換根，能夠顯著降低葉片中的煙堿含量，且不會(huì)對(duì)煙株生長及形態(tài)建設(shè)產(chǎn)生較大影響。而接穗和砧木都為鄂煙1號(hào)時(shí)，旺長前期鮮煙葉煙堿含量較T1有所增加，猜測(cè)是由于嫁接時(shí)剪葉處理以及嫁接切口作為一種外源傷害能夠誘導(dǎo)煙堿合成關(guān)鍵基因表達(dá)[26-27]，并且嫁接成活后煙苗根部能夠繼續(xù)合成煙堿并運(yùn)輸至地上部，從而導(dǎo)致其葉片煙堿含量高于T1處理，但隨著煙株生長，外源傷害對(duì)煙葉造成的影響逐漸減小，葉片煙堿合成代謝過程趨于正常，成熟期及調(diào)制后T2處理煙葉煙堿積累量較T1無顯著差異，或者是由于嫁接時(shí)損傷煙株，T1和T2處理煙株根系發(fā)育不同，具體影響機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

研究表明，用氮高效的烤煙品種作砧木，能夠提高嫁接苗氮代謝關(guān)鍵酶活性和氮代謝能力[28]，此外李耕等[21]研究表明，以烤煙為砧木能顯著提高白肋煙接穗氮還原同化能力，且糖含量及蛋白質(zhì)含量發(fā)生變化。因此，可能由于茄子與煙草氮代謝能力存在差異，導(dǎo)致煙茄嫁接后煙株氮素轉(zhuǎn)運(yùn)和碳氮分配發(fā)生改變，最終影響煙葉化學(xué)成分，因而嫁接后白肋煙糖含量升高，總氮、蛋白質(zhì)含量及硝酸鹽含量降低。而白肋煙與茄子嫁接后煙葉淀粉含量升高，可能是由于成熟后期葉片落黃較慢，采收時(shí)煙葉成熟度不足所導(dǎo)致，這與任夢(mèng)娟等[29]在烤煙上的研究結(jié)果一致。此外，煙草體內(nèi)游離氨基酸是合成蛋白質(zhì)的基本單位，也是蛋白質(zhì)降解的產(chǎn)物，同時(shí)也是合成煙堿、多酚等的原料，它參與煙株的氮、碳代謝，影響煙株內(nèi)含氮化合物及其他化學(xué)成分物質(zhì)的形成[30-31]。因此，煙茄嫁接后煙葉游離氨基酸含量增加可能是煙茄嫁接后煙堿合成減少或蛋白質(zhì)合成、降解發(fā)生改變，進(jìn)而使氨基酸在煙株體內(nèi)積累，其具體影響機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)中煙茄嫁接后白肋煙NNN、NNK、TSNAs含量降低。煙草特有亞硝胺(TSNAs)是煙草生物堿與含氮氧化合物經(jīng)過硝化反應(yīng)后生成的，研究表明，TSNAs與降煙堿、新煙草堿含量以及總生物堿含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系，NNN與降煙堿呈極顯著正相關(guān)關(guān)系[32]，而NNK含量與煙堿含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系[33]。煙茄嫁接后，白肋煙煙堿、降煙堿以及總生物堿含量降低幅度較大，且煙葉中未檢測(cè)出新煙草堿，這可能是嫁接后白肋煙TSNAs含量降低的重要原因。

煙堿和總氮含量直接影響煙葉的生理強(qiáng)度，同時(shí)也對(duì)煙葉感官質(zhì)量有重要影響。白肋煙氮堿比與香氣量及白肋煙風(fēng)格程度緊密相關(guān)，一般認(rèn)為隨著總氮和煙堿含量升高，煙葉香氣量增加，此外有學(xué)者認(rèn)為，氮堿比值以1∶1較為適合，若比值過大，煙氣香味會(huì)逐漸減少[34]。本研究中，煙茄嫁接后白肋煙煙葉香氣量、勁頭、刺激性減小。這可能與煙堿含量大幅降低、氮堿比增大緊密相關(guān)。

白肋煙與茄子嫁接后，煙株農(nóng)藝性狀未顯著改變，煙葉常規(guī)化學(xué)成分有顯著變化，主要表現(xiàn)在葉片煙堿含量大幅降低，氨基酸總量增加，NNN、NNK以及TSNAs含量顯著降低。同時(shí)，煙茄嫁接后白肋煙煙葉香氣量減少，勁頭、刺激性明顯減小。本研究為通過農(nóng)業(yè)措施大幅降低白肋煙煙堿含量提供了技術(shù)支持。