韓永強(qiáng), 李丹丹, 鄧權(quán)權(quán), 侯茂林

(1. 宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院, 江西省作物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江西 宜春 336000; 2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100193)

褐飛虱Nilaparvatalugens是我國(guó)水稻上重要的害蟲(chóng)之一，不僅刺吸稻株汁液造成直接危害，也可傳播病毒造成間接危害，嚴(yán)重威脅水稻生產(chǎn)安全(Chengetal., 2013)。目前褐飛虱防治主要依賴(lài)化學(xué)殺蟲(chóng)劑，但長(zhǎng)期過(guò)量使用殺蟲(chóng)劑，不僅會(huì)增強(qiáng)褐飛虱抗藥性，導(dǎo)致殺蟲(chóng)劑防效下降；同時(shí)會(huì)殺死害蟲(chóng)天敵，破壞稻田生態(tài)平衡，造成害蟲(chóng)再猖獗(Tanakaetal., 2000)。應(yīng)用抗蟲(chóng)品種是防治褐飛虱經(jīng)濟(jì)有效的措施之一，然而褐飛虱致害性的變異加劇了抗蟲(chóng)品種的選育難度(呂仲賢等, 2002)。采用栽培管理措施提高植物自身抗蟲(chóng)性成為害蟲(chóng)防治可供選擇的方法之一。

硅通常不被認(rèn)為是植物生長(zhǎng)所必需的元素，但由于它在植物營(yíng)養(yǎng)方面的重要作用，被認(rèn)為是一種“有益物質(zhì)”或“準(zhǔn)必需物質(zhì)”(Ma, 2004)。研究表明，褐飛虱取食施硅水稻時(shí)存活率、羽化率、棲息率、取食量、產(chǎn)卵量和卵孵化率降低，而且若蟲(chóng)期延長(zhǎng)、成蟲(chóng)壽命縮短、種群增長(zhǎng)率降低(Heetal., 2015; Yangetal., 2017b; Linetal., 2022)，說(shuō)明施硅能夠增強(qiáng)水稻對(duì)褐飛虱的抗生性、降低褐飛虱對(duì)水稻的選擇性。此外，施硅也可調(diào)控褐飛虱誘導(dǎo)的水稻防御反應(yīng)，包括激活水楊酸信號(hào)通路、增強(qiáng)多種防御酶活性、促進(jìn)植物次生代謝物積累(Alagaretal., 2010; Yangetal., 2017a; Linetal., 2022)和誘導(dǎo)胼胝質(zhì)沉積(Yangetal., 2018)。

與植物防御策略相對(duì)應(yīng)，昆蟲(chóng)也進(jìn)化出多種生理機(jī)制以適應(yīng)植物防御，其中保護(hù)酶系和解毒酶系就是主要的適應(yīng)方式之一(劉建業(yè)等, 2014)。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD), 過(guò)氧化物酶(peroxidase, POD)和過(guò)氧化氫酶(catalase, CAT)是昆蟲(chóng)體內(nèi)重要的保護(hù)酶系，在維持昆蟲(chóng)內(nèi)環(huán)境活性氧平衡及生理代謝平衡方面具有重要作用(Lozinskayaetal., 2004)。此外，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferase, GST), 羧酸酯酶(carboxylesterase, CarE)和多功能氧化酶(mixed-functional oxidase, MFO)是昆蟲(chóng)體內(nèi)重要的解毒酶系，能夠代謝外源和內(nèi)源有毒物質(zhì)，是昆蟲(chóng)適應(yīng)逆境脅迫及植物防御的重要方式(Tiwarietal., 2011)。

施硅對(duì)褐飛虱寄主選擇性、取食行為、生長(zhǎng)發(fā)育、存活、繁殖和種群增長(zhǎng)的影響已有報(bào)道(Heetal., 2015; Yangetal., 2017b; Linetal., 2022)。前人研究證實(shí)，寄主植物、水稻品種能誘導(dǎo)褐飛虱、白背飛虱Sogatellafurcifera和灰飛虱Laodelphaxstriatellus體內(nèi)酶活性發(fā)生變化(吳剛等, 1993; 趙士熙等, 1993; 呂仲賢等, 1997; 朱麟等, 2000; 陳建明等, 2002; Yaoetal., 2002; 周亦紅等, 2003; 劉玉坤等, 2011; 丁杰, 2020)，施硅可引起水稻組織和理化性狀的變化(Yangetal., 2017a; 賈路瑤等, 2020; Linetal., 2022)，褐飛虱取食施硅水稻后其體內(nèi)酶活性也可能發(fā)生改變。為此，本研究采用水培實(shí)驗(yàn)，測(cè)定和分析水稻施硅對(duì)褐飛虱成蟲(chóng)保護(hù)酶和解毒酶活性的影響，以期闡明取食施硅水稻后褐飛虱體內(nèi)酶活性的變化與施硅增強(qiáng)水稻抗蟲(chóng)性之間的關(guān)系，為硅肥用于褐飛虱種群調(diào)控奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試水稻及施硅處理

供試水稻品種為臺(tái)中1號(hào)(Taichung Native 1, TN1)(感蟲(chóng)品種)。水稻種子用10% H2O2消毒并用去離子水清洗3次后，置于人工氣候室催芽至露白，以放有石英砂的塑料育秧盒(長(zhǎng)×寬×高=40 cm×30 cm×15 cm)作苗床播種，10 d后幼苗移栽到裝有30 L木村B營(yíng)養(yǎng)液(Yoshidaetal., 1976)的塑料盒(長(zhǎng)×寬×高=71 cm×45 cm×18 cm)中。每塑料盒移栽48株稻苗，營(yíng)養(yǎng)液每7 d更換1次，每天調(diào)節(jié)pH值至5.0～6.0之間。

采用營(yíng)養(yǎng)液添加Na2SiO3·9H2O的方法設(shè)置施硅與不施硅處理。施硅處理(Si+)與不施硅處理(Si-)的硅添加濃度分別為112與0 mg Si/L。為避免雨水的影響和自然發(fā)生害蟲(chóng)的為害，水培稻苗置于溫室內(nèi)。

1.2 供試蟲(chóng)源

褐飛虱初始種群采自宜春學(xué)院實(shí)習(xí)農(nóng)場(chǎng)，用盆栽不施硅TN1稻苗在溫室紗網(wǎng)籠罩中飼養(yǎng)2代后，取褐飛虱長(zhǎng)翅型雌成蟲(chóng)用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 試蟲(chóng)處理

取移栽后30日Si+和Si-水培稻苗，稻苗莖基部用海綿塞(直徑4 cm，高3 cm)固定后插入到裝有150 mL施硅或不施硅營(yíng)養(yǎng)液的玻璃管(直徑4 cm，高25 cm)中，玻璃管管口以海綿塞封口，上下海綿塞相距8 cm，在兩個(gè)海綿塞中間接入10頭褐飛虱長(zhǎng)翅型雌成蟲(chóng)，接蟲(chóng)稻苗置于人工氣候室(溫度26±1℃，相對(duì)濕度85%±5%，光周期14L∶10D)。待取食時(shí)間達(dá)24, 48, 72和96 h時(shí)，隨機(jī)采集接蟲(chóng)稻苗上的褐飛虱成蟲(chóng)，每處理每時(shí)段采集180頭(每60頭為1次重復(fù)，重復(fù)取樣3次)，液氮速凍后-80℃保存，用于酶活性測(cè)定。

1.4 酶液制備及酶活性測(cè)定

1.4.1酶液制備：取1.3節(jié)冷凍保存的褐飛虱成蟲(chóng)60頭，稱(chēng)重后，按重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入無(wú)菌0.9%生理鹽水，冰浴勻漿，勻漿液于4℃ 2 500 r/min條件下離心10 min，取上清液為保護(hù)酶和解毒酶待測(cè)液。

1.4.2酶活性測(cè)定：采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的CAT, POD, SOD, GST, CarE和MFO活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定1.3節(jié)不同處理褐飛虱成蟲(chóng)體內(nèi)酶活性。測(cè)定方法按照各酶活性試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，酶液蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法(Bradford, 1976)測(cè)定。酶活性單位用U/mg表示。每處理每時(shí)段的保護(hù)酶和解毒酶活性采用不同樣品重復(fù)測(cè)定3次。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。用雙因素方差分析(two-way ANOVA)檢驗(yàn)施硅處理、取食時(shí)間及兩者交互作用對(duì)褐飛虱成蟲(chóng)保護(hù)酶和解毒酶活性影響的顯著性。用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較同一取食時(shí)間Si+和Si-處理組間酶活性的差異顯著性(P=0.05)。

2 結(jié)果

2.1 取食施硅水稻對(duì)褐飛虱成蟲(chóng)體內(nèi)保護(hù)酶活性的影響

2.1.1CAT活性：雙因素方差分析結(jié)果表明，施硅處理對(duì)褐飛虱成蟲(chóng)CAT活性影響不顯著(F=0.236,df=1,23,P=0.634)，而取食時(shí)間有顯著影響(F=14.813,df=3,23,P<0.001)，兩者之間存在的交互作用也有顯著影響(F=8.747,df=3,23,P=0.001)(圖1: A)。褐飛虱成蟲(chóng)取食水稻植株24, 48和96 h時(shí)，CAT活性在Si+與Si-處理組間差異不顯著(|t|≤2.022,df=4,P≥0.113)；取食Si+植株72 h時(shí)CAT活性最大，比取食Si-植株的顯著增加16.5%(|t|=4.087,df=4,P=0.015)(圖1: A)。

圖1 褐飛虱成蟲(chóng)取食施硅(Si+)或不施硅(Si-)水稻植株后體內(nèi)保護(hù)酶過(guò)氧化氫酶(CAT)(A)、過(guò)氧化物酶(POD)(B)和超氧化物歧化酶(SOD)(C)活性的變化Fig. 1 Changes in the activities of protective enzymes, catalase (CAT)(A), peroxidase (POD)(B) and superoxide (SOD)(C), in Nilaparvata lugens adults feeding on rice plants applied with silicon (Si+) or not applied with silicon (Si-) Si+: 施硅(112 mg Si/L)水稻植株Rice plants grown in nutrient solution added with 112 mg Si/L; Si-: 不施硅水稻植株Rice plants grown in nutrient solution without addition of silicon. 圖中數(shù)值為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤；星號(hào)表示同一時(shí)間點(diǎn)Si+和Si-處理組間差異顯著(P<0.05, t檢驗(yàn))。圖2同。Data in the figure are mean ±SE. The asterisk indicates significant difference between Si+ and Si- treatment groups at the same time point (P<0.05, t-test). The same for Fig. 2.

2.1.2POD活性：施硅處理(F=97.309,df=1,23,P<0.001)、取食時(shí)間(F=6.868,df=3,23,P=0.003)及其交互作用(F=27.170,df=3,23,P<0.001)均顯著影響褐飛虱成蟲(chóng)POD活性(圖1: B)。褐飛虱成蟲(chóng)取食水稻植株24和48 h時(shí)，Si+處理組POD活性顯著高于Si-處理組(|t|≥9.299,df=4,P≤0.001)，分別增加101.2%和55.2%；取食水稻植株72和96 h時(shí)，POD活性在Si+和Si-處理組間沒(méi)有顯著差異(|t|≤1.585,df=4,P≥0.188)(圖1: B)。

2.1.3SOD活性：與POD活性一樣，施硅處理(F=163.636,df=1,23,P<0.001)、取食時(shí)間(F=15.232,df=3,23,P=0.001)及其交互作用(F=69.227,df=3,23,P<0.001)對(duì)褐飛虱成蟲(chóng)SOD活性均有顯著影響(圖1: C)。褐飛虱成蟲(chóng)取食Si+植株24, 48和72 h時(shí)，其SOD活性分別比取食Si-植株的顯著增加78.2%, 19.6%和29.7%(|t|≥5.166,df=4,P≤0.007)；取食96 h時(shí)，SOD活性反而顯著降低12.6%(|t|=5.008,df=4,P=0.007)(圖1: C)。

2.2 取食施硅水稻對(duì)褐飛虱成蟲(chóng)體內(nèi)解毒酶活性的影響

2.2.1GST活性：施硅處理(F=327.578,df=1,23,P<0.001)、取食時(shí)間(F=58.650,df=3,23,P<0.001)對(duì)褐飛虱成蟲(chóng)GST活性有顯著影響，兩者間的交互作用也有顯著影響(F=48.460,df=3,23,P<0.001)(圖2: A)。褐飛虱成蟲(chóng)取食Si+植株24, 48, 72和96 h時(shí)，其GST活性分別比取食Si-植株的顯著增加57.2%, 200.7%, 84.7%和45.9%(|t|≥4.711,df=4,P≤0.009)。

圖2 褐飛虱成蟲(chóng)取食施硅(Si+)或不施硅(Si-)水稻植株后體內(nèi)解毒酶谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)(A),羧酸酯酶(CarE)(B)和多功能氧化酶(MFO)(C)活性的變化Fig. 2 Changes in the activities of detoxification enzymes, glutathione-S-transferase (GST)(A), carboxylesterase (CarE)(B) and mixed-functional oxidase (MFO)(C), in Nilaparvata lugens adults feeding on rice plants applied with silicon (Si+) or not applied with silicon (Si-)

2.2.2CarE活性：施硅處理對(duì)褐飛虱成蟲(chóng)CarE活性有顯著影響(F=69.680,df=1,23,P<0.001)，取食時(shí)間對(duì)褐飛虱成蟲(chóng)CarE活性沒(méi)有顯著影響(F=2.813,df=3,23,P=0.073)，兩者的交互作用對(duì)褐飛虱成蟲(chóng)CarE活性有顯著影響(F=13.242,df=3,23,P<0.001)(圖2: B)。褐飛虱成蟲(chóng)取食水稻植株24和48 h時(shí)，CarE活性在Si+與Si-處理組間差異不顯著(|t|≤1.975,df=4,P≥0.119)；取食72和96 h時(shí)，Si+處理組顯著低于Si-處理組(|t|≥5.203,df=4,P≤0.007)，分別降低38.1%和32.0%。

2.2.3MFO活性：施硅處理(F=20.098,df=1,23,P<0.001)、取食時(shí)間(F=17.380,df=3,23,P<0.001)對(duì)褐飛虱成蟲(chóng)MFO活性有顯著影響，兩者之間的交互作用對(duì)MFO活性有顯著影響(F=15.541,df=3,23,P<0.001)(圖2: C)。褐飛虱成蟲(chóng)取食水稻植株24和48 h時(shí)，其MFO活性在Si+和Si-處理組間沒(méi)有顯著差異(|t|≤1.268,df=4,P≥0.273)；取食72和96 h時(shí)，Si+處理組顯著高于Si-處理組(|t|≥2.988,df=4,P≤0.040)，分別增加70.2%和28.3%。

3 討論

研究表明，殺蟲(chóng)劑、溫度、干旱、CO2濃度、寄主植物能誘導(dǎo)昆蟲(chóng)體內(nèi)保護(hù)酶活性發(fā)生變化，以適應(yīng)外界不利環(huán)境。如褐飛虱被黃綠綠僵菌侵染后，體內(nèi)SOD和CAT含量顯著上升(張玨鋒等, 2018)；高溫、干旱、CO2濃度升高能使褐飛虱體內(nèi)SOD和CAT活性顯著升高(馮從經(jīng)等, 2001; 羅定, 2012; 曾蕓蕓等, 2012)；褐飛虱和白背飛虱取食感染水稻黑條矮縮病或南方水稻黑條矮縮病的稻株后，體內(nèi)SOD, POD和CAT活性顯著增加(Xuetal., 2014; 陳晨等, 2016)。

本研究發(fā)現(xiàn)，褐飛虱成蟲(chóng)取食Si+水稻植株24和48 h時(shí)，SOD和POD活性顯著高于取食Si-植株；取食Si+植株72 h時(shí)，SOD和CAT活性顯著高于取食Si-植株(圖1)。推測(cè)取食Si+植株可能會(huì)增加褐飛虱體內(nèi)自由基含量，進(jìn)而誘導(dǎo)SOD, POD和CAT活性上升，以清除過(guò)量自由基。說(shuō)明取食Si+水稻前期(24-48 h)和中期(48-72 h)，褐飛虱通過(guò)增大體內(nèi)保護(hù)酶活性的方式來(lái)保護(hù)和維持機(jī)體的正常功能。這與呂仲賢等(1997)、陳建明等(2002)和劉玉坤等(2011)的研究結(jié)果相類(lèi)似，他們的結(jié)果表明，褐飛虱、白背飛虱和灰飛虱取食耐蟲(chóng)性或抗生性水稻品種，體內(nèi)SOD, POD和CAT活性顯著高于取食感蟲(chóng)品種的。

褐飛虱成蟲(chóng)取食Si+植株72-96 h內(nèi)，CAT, POD和SOD活性均有不同程度的降低，并在96 h時(shí)低于Si-處理組，其中SOD活性的降低達(dá)到顯著水平(圖1)?？梢?jiàn)取食Si+水稻后期(72-96 h)，由于保護(hù)酶活性不能長(zhǎng)時(shí)間維持應(yīng)激水平，導(dǎo)致體內(nèi)活性氧物質(zhì)不斷積累，自由基代謝失衡，從而對(duì)蟲(chóng)體造成氧化損傷。在稻縱卷葉螟Cnaphalocrocismedinalis上也報(bào)道了類(lèi)似結(jié)果，稻縱卷葉螟幼蟲(chóng)取食施硅水稻前期，體內(nèi)SOD, POD和CAT活性呈上升趨勢(shì)；取食后期，SOD, POD和CAT活性下降(韓永強(qiáng)等, 2016)。推測(cè)褐飛虱體內(nèi)保護(hù)酶活性的變化可能與施硅提高了水稻對(duì)褐飛虱的抗生性有關(guān)(Heetal., 2015; Yangetal., 2017b; Linetal., 2022)。

昆蟲(chóng)在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成了解毒、避毒、藏毒等適應(yīng)性策略來(lái)應(yīng)對(duì)植物防御。比如，通過(guò)改變解毒酶活性，對(duì)攝入體內(nèi)的外源或內(nèi)源有毒物質(zhì)(如殺蟲(chóng)劑、植物次生代謝物等)進(jìn)行解毒和排毒(陳澄宇等, 2015)。其中，GST能催化有毒物質(zhì)的親電子基團(tuán)與還原型谷胱甘肽(GSH)的巰基偶聯(lián)，增加其疏水性使其易于排出體外(尤燕春等, 2013)；CarE能水解酯類(lèi)化合物的酯鍵，或與親脂類(lèi)有毒化合物結(jié)合，通過(guò)降低其有效濃度來(lái)降低毒性(張麗陽(yáng)和劉承蘭, 2016)；MFO可通過(guò)過(guò)氧烷基、羥基化環(huán)氧化和硫醚氫化等方式參與殺蟲(chóng)劑和毒素的代謝(余源嬋等, 2022)。

本研究中，褐飛虱成蟲(chóng)取食Si+植株24-96 h時(shí)，GST活性均顯著高于Si-處理組(圖2: A)。原因可能是昆蟲(chóng)取食脅迫誘導(dǎo)植物激活體內(nèi)的防御反應(yīng)，施硅處理可能在一定程度上放大了植物的這種誘導(dǎo)防御反應(yīng)(Yangetal., 2017a; Linetal., 2022)，通過(guò)增加植物次生代謝物的合成和積累，從而引起褐飛虱GST活性上升。GST活性升高是植食性昆蟲(chóng)對(duì)干旱(羅定, 2012)、CO2濃度升高(劉建業(yè)等, 2014)、寄主植物(劉玉坤等, 2011; Xuetal., 2014; 陳晨等, 2016; 丁杰, 2020)、抗蟲(chóng)品種(Yaoetal., 2002; 周亦紅等, 2003; 凌炎, 2007)、殺蟲(chóng)劑(凌炎, 2007; 肖彩云等, 2020; 張凱倫等, 2020)的應(yīng)激反應(yīng)。因此，本研究中褐飛虱GST活性上升可能是對(duì)施硅水稻中次生化合物含量增大的反應(yīng)。

前人研究表明，褐飛虱和白背飛虱取食感染南方水稻黑條矮縮病或經(jīng)殺蟲(chóng)劑處理的水稻后，體內(nèi)CarE活性顯著降低(張玨鋒等, 2018; 楊洪等, 2019; 肖彩云等, 2020)；取食耐蟲(chóng)性或抗生性水稻品種的褐飛虱、白背飛虱和灰飛虱體內(nèi)的CarE活性被顯著抑制(吳剛等, 1993; 趙士熙等, 1993; 朱麟等, 2000; 劉玉坤等, 2011)。此外，褐飛虱、白背飛虱和灰飛虱在施硅或抗蟲(chóng)水稻上的生長(zhǎng)發(fā)育延遲，存活率降低、壽命縮短(吳剛等, 1993; 趙士熙等, 1993; 劉玉坤等, 2011; Heetal., 2015; Yangetal., 2017b; Linetal., 2022)。本研究發(fā)現(xiàn)，褐飛虱成蟲(chóng)取食Si+水稻植株24-96 h時(shí)，CarE活性低于Si-處理組，并在72和96 h時(shí)差異達(dá)到顯著水平(圖2: B)。由此推測(cè)，CarE活性被抑制可能會(huì)干擾昆蟲(chóng)正常的生長(zhǎng)發(fā)育，最終導(dǎo)致昆蟲(chóng)死亡，這可能是施硅增大水稻對(duì)褐飛虱抗生性的結(jié)果。

在本研究中，褐飛虱成蟲(chóng)取食水稻植株72和96 h時(shí)，Si+處理組MFO活性顯著高于Si-處理組(圖2: C)。已有研究證實(shí)，水稻品種、殺蟲(chóng)劑、CO2濃度、寄主植物能誘導(dǎo)昆蟲(chóng)體內(nèi)MFO活性上升。如褐飛虱、白背飛虱和灰飛虱取食耐蟲(chóng)性或抗生性水稻品種時(shí)體內(nèi)MFO活性升高(劉玉坤等, 2011)；殺蟲(chóng)劑或高CO2濃度處理能使褐飛虱、灰飛虱、西花薊馬Frankliniellaoccidentalis和花薊馬F.intonsa體內(nèi)MFO活性顯著升高(凌炎, 2007; 劉建業(yè)等, 2014; 張凱倫等, 2020)；草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda幼蟲(chóng)取食次生代謝物含量高的寄主植物后，體內(nèi)MFO活性上升(魯智慧等, 2020)。因此，褐飛虱可能通過(guò)增大體內(nèi)MFO活性的方式以維持其正常的生理代謝。

根據(jù)本研究結(jié)果，水稻施硅引起褐飛虱成蟲(chóng)體內(nèi)保護(hù)酶活性先上升后下降，解毒酶GST和MFO活性升高、CarE活性降低。這些變化是因?yàn)樗臼┕韪淖兞巳~鞘組織結(jié)構(gòu)特征的直接結(jié)果，還是施硅影響植物生理代謝過(guò)程、誘導(dǎo)植物增加次生代謝物合成和積累的間接結(jié)果，抑或是施硅的直接和間接影響的綜合結(jié)果，還有待深入研究。本研究結(jié)果為探究褐飛虱體內(nèi)酶活性的變化與施硅增強(qiáng)水稻抗蟲(chóng)性之間的關(guān)系提供了理論依據(jù)，也為合理利用硅肥調(diào)控褐飛虱種群奠定了理論基礎(chǔ)。