韋麗婷, 劉丹丹, 范士龍, 王金明, 蘆 星, 李思媛, 劉明明, 陳宋琴, 劉一凡, 郭慶勇, 巴音查汗, 張 偉

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院, 烏魯木齊 830052)

拉合爾鈍緣蜱Ornithodoroslahorensis是一種重要的體外專性吸血寄生蟲，隸屬節(jié)肢動物門(Arthropoda)蛛形綱(Arachnida)蜱螨亞綱(Acari)蜱目(Ixodida)軟蜱科(Argasidae)鈍緣蜱屬Ornithodoros(艾力西熱·買買提等, 2017)。在國外主要分布于俄羅斯、烏克蘭、巴基斯坦等國家和地區(qū)，在國內(nèi)主要分布于新疆、甘肅和河南等地區(qū)(孔繁瑤, 1997; 于心等, 1997; 劉洋, 2012; 孫明, 2016; Zhaoetal., 2019)。該蜱為新疆地區(qū)軟蜱中的優(yōu)勢種，主要分布于新疆吐魯番、喀什等地區(qū)(艾力西熱·買買提, 2017; Zhaoetal., 2018b, 2019)。拉合爾鈍緣蜱常寄生于牛、羊、駱駝和犬等(Sonenshine and Roe, 2014; 張璘, 2014; Zhaoetal., 2018a)，在吸血過程中除了造成動物皮膚損傷外，更嚴重的可能將自身攜帶的病毒、細菌、立克次體、寄生蟲等病原傳播給宿主，對流行地區(qū)的養(yǎng)殖業(yè)、畜牧業(yè)發(fā)展及人員安全造成了巨大的威脅(Jeppesenetal., 2012; Zhaoetal., 2018a, 2019)。

目前對于拉合爾鈍緣蜱的相關(guān)研究主要集中在流行病學(xué)調(diào)查、生物防治等方面(Philip and Burgdorfer, 1961; Sidorov and Kriuchechnikov, 1968; Sureauetal., 1980; Reháceketal., 1989; Estrada-Pea and Jongejan, 1999; Zhaoetal., 2018a, 2019)，其形態(tài)學(xué)特征研究僅有少量關(guān)于成蜱期及部分若蜱期的形態(tài)特征報道(孔繁瑤, 1997; 于心等, 1997; 艾力西熱·買買提等, 2017; 呂繼洲等, 2017)。據(jù)研究表明，鈍緣蜱的生活史需要經(jīng)歷卵、幼蜱、若蜱和成蜱4個階段，其中若蜱期一般需經(jīng)歷2～9個齡期，其若蜱的齡期數(shù)根據(jù)鈍緣蜱種類不同而存在差異。目前對于鈍緣蜱若蜱各齡期的劃分，主要以蛻皮次數(shù)為依據(jù)，對于以若蜱形態(tài)特征為不同齡期區(qū)分依據(jù)的研究還未見報道(Landulfoetal., 2012; Ribeiroetal., 2013; Ramirezetal., 2016; Diyes and Rajakaruna, 2017; González-Moragaetal., 2018)。因此，本研究在前期進行拉合爾鈍緣蜱生活史研究的基礎(chǔ)上，借助體視顯微鏡和掃描電子顯微鏡對拉合爾鈍緣蜱1-5齡若蜱形態(tài)結(jié)構(gòu)特征進行全面、細致的觀察研究并補充完善其形態(tài)學(xué)參數(shù)，旨在為拉合爾鈍緣蜱若蜱期齡期劃分提供依據(jù)，對補充軟蜱不同齡期的鑒別特征依據(jù)具有重要參考價值。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與飼養(yǎng)

拉合爾鈍緣蜱樣品由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院獸醫(yī)寄生蟲學(xué)實驗室采集與保存。將雌蜱和雄蜱按照1∶2的比例放于密封容器中，再置于恒溫生化培養(yǎng)箱中(溫度25±1℃，相對濕度85%±5%，光周期12L∶12D)，待其產(chǎn)卵孵化為幼蜱后將其接種于成年雌性新西蘭大白兔耳部，參照邵志然等(2017)待其飽血脫落后將幼蜱收集到培養(yǎng)管后放入培養(yǎng)箱中，待幼蜱第1次蛻皮后獲得1齡若蜱，重復(fù)以上飼蜱、蛻皮步驟后依次獲得2-5齡若蜱。

1.2 樣品制備

選取培養(yǎng)中獲得的處于饑餓狀態(tài)下較活躍的1-5齡若蜱共10頭(每齡期若蜱隨機選擇2頭)，將樣品浸沒于80～90℃熱水中1 min，處死的同時使其軀體達到舒展狀態(tài)；將選取的樣品經(jīng)過超聲波清洗3次，每次10 min，清洗干凈后再用生理鹽水沖洗；用游標卡尺測量各個階段若蜱軀體的長與寬，并借助MOTIC ST-39B體視顯微鏡 (麥克奧迪實業(yè)集團有限公司)對拉合爾鈍緣蜱不同齡期若蜱進行初步觀察并用索尼A7RIV數(shù)碼相機記錄圖像資料；隨后置于2.5%戊二醛固定液中進行固定；再經(jīng)梯度酒精逐級脫水，酒精濃度依次為30%, 50%, 70%, 90%和100%，每個濃度連續(xù)脫水2次，每次15 min；最終將樣品置于100%叔丁醇中，4℃保存；將樣品放入ALPHA1-2LD plus冷凍干燥機 [Christ (德國) 集團]；將干燥好的樣品用鑷子小心地粘附在貼有雙面導(dǎo)電膠的樣品臺上，用108AUTO離子濺射儀Sputter Coater (廣州競化工科技有限公司)噴金；噴金后放入SIGMA 500場發(fā)射掃描電子顯微鏡[蔡司 (德國) 公司]、SU1510掃描電子顯微鏡[日立 (日本) 公司]下觀察并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel處理實驗所得數(shù)據(jù)，利用SPSS 20.0進行單因素方差分析(ANOVA)；利用Photoshop對電鏡圖片進行編排。

2 結(jié)果

2.1 體視顯微鏡下拉合爾鈍緣蜱1-5齡若蜱主要形態(tài)

在體視顯微鏡下，拉合爾鈍緣蜱1-5齡若蜱隨著齡期的增長，軀體逐漸增大，除了軀體尺寸不相同以外，其他形態(tài)結(jié)構(gòu)相似度較高。軀體長為軀體前端的頂突至軀體后緣的距離，軀體寬為第2基節(jié)之間水平體緣的距離，1齡若蜱軀體長1.70±0.12 mm，軀體寬0.89±0.11 mm；2齡若蜱軀體長3.12±0.44 mm，軀體寬1.67±0.21 mm；3齡若蜱軀體長5.14±0.52 mm，軀體寬2.79±0.36 mm；4齡若蜱軀體長6.39±0.32 mm，軀體寬3.47±0.21 mm；5齡若蜱軀體長7.82±0.38 mm，軀體寬4.22±0.34 mm。各期若蜱軀體均呈卵圓形或橢圓形，前端較窄，后部鈍圓，呈深黃色或黃褐色；頂突逐漸明顯，部分的口下板和須肢被掩蓋；背、腹表皮粗糙，且高低不平，其上著生細毛；體中央色深呈棕褐色或者棕色；兩側(cè)緣較直且接近平行，體側(cè)緣圓鈍，呈淡黃色，背面與腹面交界處無縫線分隔；盤窩較淺且大小不一，排列不規(guī)則；足4對，中等長度，呈淡黃色，半透明；生殖孔還未形成，性別無法區(qū)分 (圖1)。

圖1 體視顯微鏡下拉合爾鈍緣蜱1-5齡若蜱形態(tài)Fig. 1 Morphology of the 1st-5th instar nymphs of Ornithodoros lahorensis under stereo microscopeA, F: 1齡若蜱1st instar nymph; B, G: 2齡若蜱2nd instar nymph; C, H: 3齡若蜱3rd instar nymph; D, I: 4齡若蜱4th instar nymph; E, J: 5齡若蜱5th instar nymph. A-E: 背面觀Dorsal view; F-J: 腹面觀Ventral view.

2.2 1-5齡若蜱共有形態(tài)特征

軀體背面、腹面表皮呈山脊樣褶皺，盤窩呈圓形或橢圓形，排列不規(guī)則，背面和腹面均有剛毛(圖2: A-E)。足由6個節(jié)段組成，從基部開始分別為基節(jié)、轉(zhuǎn)節(jié)、股節(jié)、脛節(jié)、后附節(jié)、跗節(jié)，足末端有爪 (圖3: A, B, E)，爪墊不發(fā)達 (圖3: E)；每節(jié)段表面光滑無褶皺，且腹面連接處表皮為乳突樣 (圖3: C, D)；第1基節(jié)與第2基節(jié)分開，第2基節(jié)、第3基節(jié)、第4基節(jié)相互靠近 (圖3: C, D)。第1對足的跗節(jié)背面有瘤突 (圖4: B-E)；哈氏器位于第1對足的跗節(jié)背面，瘤突與瘤突之間，呈橫裂樣，前窩和后囊均有剛毛 (圖4: B-E)?？谙掳宄拭?，齒占口下板的2/3，前端齒小，中部齒大，基部無齒排列 (圖5: A-E)；須肢位于口下板兩側(cè)，由4個節(jié)段組成，每節(jié)段均附有剛毛 (圖5: B-E)；假頭基中等大小，頭窩呈三角形，深而窄 (圖5: D, E)。氣門呈半圓形，氣門板不發(fā)達，其表面密布大小不等的微孔，位于第4基節(jié)的背側(cè)方(圖6: A-E)。肛門呈圓形，由兩對葉狀肛瓣構(gòu)成，其上有肛瓣毛，位于假頭基后緣至軀體后緣的中部 (圖7: A-D, F)。肛前溝從第2基節(jié)起至肛門前端 (圖7: C)；肛后中溝自肛門起至軀體后部邊緣 (圖7: B)；無肛后橫溝；未見生殖孔 (圖7: A-C)。

圖2 掃描電子顯微鏡下拉合爾鈍緣蜱1-5齡若蜱表皮形態(tài)Fig. 2 Morphology of the cuticle of the 1st-5th instar nymphs of Ornithodoros lahorensis under scanning electron microscopeA: 1齡若蜱1st instar nymph; B: 2齡若蜱2nd instar nymph; C: 3齡若蜱3rd instar nymph; D: 4齡若蜱4th instar nymph; E: 5齡若蜱5th instar nymph. di: 盤窩Discs; st: 剛毛Setae.

圖3 掃描電子顯微鏡下拉合爾鈍緣蜱1-5齡若蜱足形態(tài)Fig. 3 Morphology of legs of the 1st-5th instar nymphs of Ornithodoros lahorensis under scanning electron microscopeA: 1齡若蜱1st instar nymph; B: 2齡若蜱2nd instar nymph; C: 3齡若蜱3rd instar nymph; D: 4齡若蜱4th instar nymph; E: 5齡若蜱5th instar nymph. cl: 爪Claw; c1-4: 第1-4基節(jié)1st-4th coxae; fe: 股節(jié)Femur; mt: 后附節(jié)Meta-tarsus; tb: 脛節(jié)Tibia; ta: 跗節(jié)Tarsus; tr: 轉(zhuǎn)節(jié)Trochanter. 白色箭頭為節(jié)段連接乳突樣表皮。The white arrow indicates the intersegmental mammillae.

圖4 掃描電子顯微鏡下拉合爾鈍緣蜱1-5齡若蜱足跗節(jié)形態(tài)Fig. 4 Morphology of tarsi of the 1st-5th instar nymphs of Ornithodoros lahorensis under scanning electron microscopeA: 1齡若蜱1st instar nymph; B: 2齡若蜱2nd instar nymph; C: 3齡若蜱3rd instar nymph; D: 4齡若蜱4th instar nymph; E: 5齡若蜱5th instar nymph. ap: 前囊Anterior pit; cho: 哈氏器后囊Posterior capsule of Haller’s organ; ho: 哈氏器Haller’s organ; hu: 瘤突Hump.

圖5 掃描電子顯微鏡下拉合爾鈍緣蜱1-5齡若蜱口下板形態(tài)Fig. 5 Morphology of hypostomes of the 1st-5th instar nymphs of Ornithodoros lahorensis under scanning electron microscopeA: 1齡若蜱1st instar nymph; B: 2齡若蜱2nd instar nymph; C: 3齡若蜱3rd instar nymph; D: 4齡若蜱4th instar nymph; E: 5齡若蜱5th instar nymph. ca: 頭窩Camerostoma; hy: 口下板Hypostome; pa: 須肢Palpus.

圖6 掃描電子顯微鏡下拉合爾鈍緣蜱1-5齡若蜱氣門形態(tài)Fig. 6 Morphology of spiracles of the 1st-5th instar nymphs of Ornithodoros lahorensis under scanning electron microscopeA: 1齡若蜱1st instar nymph; B: 2齡若蜱2nd instar nymph; C: 3齡若蜱3rd instar nymph; D: 4齡若蜱4th instar nymph; E: 5齡若蜱5th instar nymph. nsp: 無氣門板No spiracular plate; sp: 氣門板Spiracular plate.

圖7 掃描電子顯微鏡下拉合爾鈍緣蜱1-5齡若蜱肛門形態(tài)Fig. 7 Morphology of the anus of the 1st-5th instar nymphs of Ornithodoros lahorensis under scanning electron microscopeA: 1齡若蜱1st instar nymph; B: 2齡若蜱2nd instar nymph; C: 3齡若蜱3rd instar nymph; D: 4齡若蜱4th instar nymph; E: 5齡若蜱5th instar nymph. an: 肛門Anus; mp: 肛后中溝Medium postanal grooves; pg: 肛前溝Preanal grooves.

2.3 1-5齡若蜱各齡鑒別特征

1齡若蜱：表皮剛毛長且粗；足的每節(jié)段及與腹面連接處表皮光滑，第1跗節(jié)無瘤突 (圖4: A)；口下板前端凹陷明顯，且凹陷的兩側(cè)較尖，口下板頂端齒式為2|2，口下板長為口下板頂端至假頭基前緣，口下板長234.41±13.61 μm (圖5: A)；氣門呈半圓形，氣門長徑為95.39±12.36 μm，無氣門板 (圖6: A)；肛瓣毛2對，肛門長徑為115.92±2.03 μm，未見肛前溝、肛后中溝 (圖7: A)。

2齡若蜱：表皮剛毛長且粗；足連接處表皮為乳突樣，第1跗節(jié)有3個不明顯的瘤突 (圖4: B)；口下板頂端有小凹陷，且凹陷的兩側(cè)圓鈍，口下板頂端齒式為3|3，齒共3排，每排有5～6枚小齒；口下板中部齒式為2|2，有6～7排，每排有1～4枚大齒，長382.43±1.50 μm (圖5: B)；氣門半圓形，氣門長徑為118.70±5.59 μm，有氣門板但不發(fā)達 (圖6: B)；肛門長徑為134.64±10.05 μm，肛前溝、肛中溝明顯 (圖7: B)。

3-5齡若蜱：表皮剛毛短且細；第1跗節(jié)有3個明顯瘤突 (圖4: C, D, E)；口下板頂端齒排列不規(guī)則，中部齒式排列為8～9排，每排有1～4個大齒 (圖5: C, D, E)；3齡若蜱口下板長535.22±5.81 μm，4齡若蜱口下板長556.09±8.50 μm，5齡若蜱口下板長600.01±11.68 μm。3齡若蜱肛門缺失 (圖7: C)，4齡若蜱肛瓣毛6對，肛門長徑為191.19±4.70 μm (圖7: D)，5齡若蜱肛瓣毛7對，肛門長徑為198.82±5.44 μm (圖7: E)。

綜上所述，1-2齡若蜱的主要鑒別特征為瘤突、足連接處表皮形態(tài)、口下板與齒式、氣門、肛前溝及肛中溝等特征；2-3齡若蜱的主要鑒別特征為剛毛、瘤突、口下板及齒式等特征；4-5齡若蜱的主要鑒別特征為肛瓣毛數(shù)量。

3 討論

拉合爾鈍緣蜱是新疆地區(qū)流行最廣泛的軟蜱之一，該蜱可以攜帶多種病原微生物，對人畜造成嚴重的危害。但目前國內(nèi)外對其相關(guān)的研究較少，尤其是對于其不同發(fā)育時期形態(tài)結(jié)構(gòu)特征的研究，尚未見詳細報道。經(jīng)過研究團隊前期對于拉合爾鈍緣蜱生活史研究發(fā)現(xiàn)，該蜱整個發(fā)育過程需經(jīng)歷卵期、幼蜱期、5個若蜱期(若蜱期間共蛻皮4次)、成蜱期4個階段(韋麗婷, 2021)。在此基礎(chǔ)上，本研究以拉合爾鈍緣蜱各齡期若蜱為研究對象，借助體視顯微鏡和掃描電子顯微鏡首次全面細致地記錄拉合爾鈍緣蜱不同若蜱期形態(tài)學(xué)資料，并補充部分數(shù)據(jù)，為軟蜱蜱種鑒定及生物學(xué)特征研究提供參考依據(jù)。

在體視顯微鏡下觀察拉合爾鈍緣蜱5個若蜱期形態(tài)結(jié)構(gòu)特征發(fā)現(xiàn)，其宏觀結(jié)構(gòu)特征基本相似，僅在軀體尺寸方面存在細微差異，因此僅憑體視顯微鏡觀察的結(jié)構(gòu)特征來辨別不同齡期若蜱相對困難(圖1)。通過比較拉合爾鈍緣蜱各齡期若蜱與成蜱形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，若蜱和成蜱的體緣、縫線、盤窩排列等鑒別特征基本相似(孔繁瑤, 1997; 于心等, 1997; Ribeiroetal., 2013; 孫明, 2016)。因此，以上鑒別特征也可作為區(qū)別拉合爾鈍緣蜱若蜱與其他軟蜱若蜱的鑒別依據(jù)。

掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示，拉合爾鈍緣蜱不同齡期若蜱表皮、盤窩、足、哈氏器及生殖孔等結(jié)構(gòu)特征基本相似 (圖2-4)，而剛毛、瘤突、口下板、齒式、氣門、氣門板、肛瓣毛、肛前溝、肛中溝等形態(tài)特征差異明顯 (圖2和圖4-7)，因此上述特征可以作為拉合爾鈍緣蜱1-5齡若蜱的主要鑒別特征。在此基礎(chǔ)上，本研究還利用掃描電子顯微鏡測量軟件測量了拉合爾鈍緣蜱不同齡期若蜱軀體、口下板、氣門和肛門等相關(guān)數(shù)據(jù)(圖1和 圖5-7)，進一步完善了于心等(1997)、艾力西熱·買買提等(2017)和呂繼洲等(2019)關(guān)于拉合爾鈍緣蜱形態(tài)學(xué)的相關(guān)研究結(jié)果。

利用掃描電子顯微圖像比較拉合爾鈍緣蜱若蜱與成蜱超微形態(tài)特征發(fā)現(xiàn)，兩者微觀結(jié)構(gòu)存在明顯差異，如剛毛、瘤突、口下板、齒式、氣門、氣門板、肛前溝、肛中溝及生殖孔等形態(tài)結(jié)構(gòu)特征(圖2-7)。通過比較拉合爾鈍緣蜱與其他種類鈍緣蜱的各期若蜱形態(tài)特征發(fā)現(xiàn)，在背部表皮、足連接處表皮、頰部、氣門、肛后橫溝等部位存在顯著形態(tài)差異(圖2-7)。具體差別表現(xiàn)為：在背部表皮形態(tài)方面(圖2)，拉合爾鈍緣蜱呈褶皺樣，其他鈍緣蜱呈乳突樣；在足連接處表皮形態(tài)方面(圖3)，拉合爾鈍緣蜱呈微乳突樣，塞氏鈍緣蜱Ornithodorossavignyi呈褶皺樣，而微冠鈍緣蜱Ornithodorosmicrolophi、琺氏鈍緣蜱Ornithodorosfaccinii均呈乳突樣；在是否具有頰部方面(圖5)，拉合爾鈍緣蜱無頰部，好角鈍緣蜱Ornithodoroscapensis、兜福鈍緣蜱Ornithodorosperopteryx和洞棲鈍緣蜱Ornithodoroscavernicolous均有頰部；在氣門形態(tài)方面(圖6)，拉合爾鈍緣蜱呈半圓形，馬氏鈍緣蜱Ornithodorosmarinkellei呈長條形；在有無肛后橫溝方面(圖7)，拉合爾鈍緣蜱無肛后橫溝，而巴西鈍緣蜱Ornithodorosbrasiliensis、琺氏鈍緣蜱O.faccinii和尤馬鈍緣蜱Ornithodorosyumatensis均有肛后橫溝(Estrada-Peaetal., 2004; Labrunaetal., 2011; Barros-Battestietal., 2012, 2015; Navaetal., 2013; Venzaletal., 2013; Abdel-Shafyetal., 2016; Muoz-Lealetal., 2018, 2020)。因此，本研究不僅補充了拉合爾鈍緣蜱不同齡期若蜱的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征相關(guān)信息，而且為鈍緣蜱及軟蜱的鑒別提供了更加細致的形態(tài)特征比對依據(jù)。

雖然利用電子顯微技術(shù)能夠獲得清晰詳細的拉合爾鈍緣蜱形態(tài)學(xué)資料，但是仍存在不足之處：比如，在進行掃描電鏡拍攝前樣品處理過程中，由于拉合爾鈍緣蜱體表凹凸不平，導(dǎo)致噴金不均勻，為了獲得各部位清晰圖像，在拍攝時存在過度曝光的現(xiàn)象，如圖4(A)、圖5(B)和圖6(D)中所示。又如，在進行樣品清洗時，使用超聲清洗可將蜱體表大部分雜質(zhì)去除，但仍無法除去縫隙中、粘附性強的雜質(zhì)，如圖5(C-E)、圖6(D-E)和圖7(E)所示，若增大超聲頻率則有可能損壞軀體表面柔軟的剛毛及其他鑒別部位，如圖6(D)和圖7(C)所示。因此，在后續(xù)的研究中需要進一步細化操作流程，避免在樣品處理及拍攝過程中因操作不規(guī)范產(chǎn)生的影響蜱體形態(tài)特征的現(xiàn)象發(fā)生。又如，因拉合爾鈍緣蜱樣品來源較少，蟲體較珍貴，因此本次研究僅在每期若蜱中隨機選取2頭，在測量具體部位參數(shù)時，對數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析仍存在誤差。此外3齡若蜱因在電鏡拍攝時噴金不均勻，導(dǎo)致獲取圖像不清晰而缺失3齡若蜱肛門數(shù)據(jù)。以上不足我們將在后續(xù)研究中進行進一步完善和優(yōu)化。

綜上所述，本研究利用體視顯微鏡和掃描電子顯微鏡，首次完整的對拉合爾鈍緣蜱1-5齡若蜱鑒別特征進行描述，為拉合爾鈍緣蜱不同齡期若蜱劃分提供了形態(tài)學(xué)依據(jù)，為軟蜱形態(tài)學(xué)及生活史研究奠定了理論基礎(chǔ)。