廖文宇, 呂卓鴻, 張友軍, 楊中俠,*

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 植物病蟲害生物學(xué)與防控湖南省重點實驗室, 長沙 410128; 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所, 北京 100081)

蘇云金芽孢桿菌Bacillusthuringiensis(Bt)是革蘭氏陽性細(xì)菌，多分布于土壤中，短桿狀，單生或成短鏈，產(chǎn)芽孢、以周生鞭毛運動；該菌首先由石渡繁胤于1902年在家蠶Bombyxmori中發(fā)現(xiàn)，隨后Ernst Berliner于1911年從德國圖林根州(Thüringen)一面粉廠染病的地中海粉螟Ephestiakuehniella中再次發(fā)現(xiàn)，并被正式命名為Bacillusthuringiensis。Bt伴孢晶體含有多種殺蟲晶體蛋白(insecticidal crystal proteins, ICPs, 又稱δ-內(nèi)毒素)及β外毒素等多種其他毒素，可特異性地殺死多種不同昆蟲。Bt于1938年首次作為農(nóng)藥上市，目前已成為最成功的生物農(nóng)藥(Ayersetal., 1977; Reardonetal., 1994; Ibrahimetal., 2010; Bravoetal., 2011)。然而已有約13種害蟲對Bt產(chǎn)生了抗性(Tabashnik and Carrière, 2017; Xiao and Wu, 2019)。因此探明昆蟲對Bt產(chǎn)生抗性的機(jī)制意義重大。

長久以來，人們對昆蟲Bt抗性機(jī)制的研究主要集中在兩個方向：由于中腸蛋白酶突變或表達(dá)減少導(dǎo)致Cry原毒素的激活受阻(Forcadaetal., 1996; Liuetal., 2014)導(dǎo)致的昆蟲Bt抗性；因各類Cry毒素受體突變或表達(dá)減少(Gahanetal., 2001; Guoetal., 2020)，進(jìn)而導(dǎo)致昆蟲對Bt產(chǎn)生抗性。而近年來的許多研究發(fā)現(xiàn)昆蟲免疫系統(tǒng)也參與了對Bt的對抗(Liuetal., 2019; Cacciaetal., 2020; Linetal., 2020)。本文詳細(xì)介紹了昆蟲體液免疫及昆蟲Bt抗性機(jī)制的研究成果，對昆蟲體液免疫參與昆蟲形成Bt抗性的主要通路進(jìn)行了歸納和推論，根據(jù)已有研究成果描繪了一個較為清晰的關(guān)于昆蟲體液免疫系統(tǒng)與昆蟲Bt抗性之間關(guān)系的圖譜，為探究昆蟲對Bt的抗性機(jī)制提供新的思路。

1 昆蟲體液免疫系統(tǒng)

有別于脊椎動物，昆蟲的免疫防御主要依賴于其高效的先天免疫系統(tǒng)。先天免疫是有機(jī)體在演化中逐步形成的一系列天然防御功能，其對多種病原侵染都有作用，沒有明顯的選擇性，并可穩(wěn)定遺傳。

昆蟲的免疫系統(tǒng)主要包括屏障結(jié)構(gòu)、細(xì)胞免疫和體液免疫。屏障結(jié)構(gòu)包括外骨骼、骨質(zhì)氣管、腸道圍食膜等，為抵御病原物的第一防線。病原物突破第一防線后，昆蟲通過模式識別受體(pattern recognition reporters, PRRs)如：肽聚糖識別蛋白(peptidoglycan recognition proteins, PGRPs)、β-葡聚糖識別蛋白(β-glucan recognition proteins, βGRPs)以及清道夫受體(scavenger receptors, SRs)等，特異性識別病原體，進(jìn)而激活下游細(xì)胞免疫及體液免疫相關(guān)反應(yīng)，如：誘導(dǎo)吞噬作用和包囊作用、激活免疫缺陷(immune deficiency, IMD)或Toll等免疫信號通路、激活酚氧化酶原級聯(lián)反應(yīng)等。細(xì)胞免疫主要通過不同血細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用、凝集或包被作用對抗病原物。同時昆蟲的體液免疫和細(xì)胞免疫并不是相互獨立的，而是相互聯(lián)系的。很多體液免疫的因子會影響到血細(xì)胞的功能，同時血細(xì)胞產(chǎn)生的酶也會影響到體液免疫。體液免疫主要依賴血淋巴中的各種抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)及蛋白，它們主要通過水解破壞微生物細(xì)胞壁、破壞微生物細(xì)胞膜通透性、阻止微生物分裂、代謝毒物的殺傷與鈍化作用等方式對抗病原物(王蔭長等, 2001; S?derh?ll, 2010; 楊代群, 2012; 張明明等, 2012)。昆蟲抗菌肽受IMD或Toll等免疫信號通路控制表達(dá)，是昆蟲體液免疫的主要效應(yīng)因子。抗菌肽為小分子多肽，目前人們從不同生物中已發(fā)現(xiàn)7 000～8 000余種抗菌肽，其中昆蟲抗菌肽400余種，并構(gòu)建了相關(guān)數(shù)據(jù)庫(Wangetal., 2015; Waghuetal., 2016)。抗菌肽不僅可殺死革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌，還對真菌、病毒，甚至原生動物和癌細(xì)胞有殺傷活性，當(dāng)然，不同種類的抗菌肽有不同的活性譜(Reddyetal., 2004; Hoskin and Ramamoorthy, 2008; Wuetal., 2018; Tonketal., 2019)。

1.1 模式識別受體

模式識別受體(PRRs)通過感知被稱為病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)的保守結(jié)構(gòu)，例如細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、肽聚糖(peptidoglycan, PGN)、磷壁酸(lipoteichoic acid, LTA)以及真菌β-1, 3-葡聚糖(β-1, 3-glucan)，從而在病原體識別中起關(guān)鍵作用(Akiraetal., 2006)。已發(fā)現(xiàn)的昆蟲PRRs主要包括以下6類：PGRPs、βGRPs或革蘭氏陰性菌結(jié)合蛋白(Gram-negative bacteria-binding proteins, GNBPs)、SRs、含硫酯蛋白(thioester-containing proteins, TEPs)、唐氏綜合癥細(xì)胞粘附分子(Down syndrome cell adhesion molecule, Dscam)及凝集素(lectin)(Luetal., 2020)。其中PGRPs被研究較多，且其在昆蟲免疫系統(tǒng)中扮演了多種不同的角色。

肽聚糖識別蛋白(PGRPs)是大多數(shù)無脊椎動物和哺乳動物中最常見的模式識別受體(PRRs)，但未在較低級的后生動物或植物中發(fā)現(xiàn)。所有PGRP均包含至少一個與噬菌體或細(xì)菌2型酰胺酶(type 2 amidases, Amidase-2)同源的保守PGRP結(jié)構(gòu)域(Wang Jetal., 2018)。根據(jù)分子量的大小，PGRP可以被分為長(L)、短(S)兩種類型。短型PGRP(PGRP-S)一般為小于20 kDa的胞外蛋白；而長型PGRP(PGRP-L)通常有PGRP-S兩倍大，它們可能是胞外蛋白(如PGRP-LB)，或跨膜蛋白(如PGRP-LC)，或胞內(nèi)蛋白(如PGRP-LE和PGRP-LB)(Werneretal., 2000; Charrouxetal., 2018)。PGRP保守結(jié)構(gòu)域一般由外圍3～4個α螺旋，中心5～7個β折疊構(gòu)成，它們均具有PGN結(jié)合槽(PGN-binding groove)(Kimetal., 2003; Limetal., 2006; Huetal., 2019)。如果PGN結(jié)合槽中具有3個鋅離子(Zn2+)配位殘基(His, His, Cys)，則該PGRP具有酰胺酶活性，稱為催化性PGRP(catalytic PGRPs)；如缺乏關(guān)鍵的與Zn2+結(jié)合的半胱氨酸殘基(Cys)，則該PGRP無酰胺酶活性，稱為非催化性PGRP(non-catalytic PGRP)(Lowetal., 2011; Paredesetal., 2011)。PGRPs在昆蟲免疫系統(tǒng)中扮演的角色可概括為3種：識別受體、免疫調(diào)節(jié)因子、殺菌劑。

識別受體(圖1)：PGRP-SA-GNBP1復(fù)合物識別賴氨酸型肽聚糖(Lys-type PGN)激活Toll通路(Micheletal., 2001; Gobertetal., 2003)，PGRP-SD作為革蘭氏陽性細(xì)菌受體在功能上與PGRP-SA-GNBP1復(fù)合物有部分冗余(Bischoffetal., 2004)。另外PGRP-SD似乎還可以識別二氨基庚二酸型肽聚糖(DAP-type PGN)從而激活Toll通路(Leoneetal., 2008; Valanneetal., 2011)。PGRP-LC識別DAP-type PGN激活I(lǐng)MD通路(Gottaretal., 2002; R?metetal., 2002a)。Yoshida等(1996)最早報道了家蠶的PGRP-S1可以結(jié)合PGN并激活酚氧化酶(phenoloxidase, PO)級聯(lián)反應(yīng)，而PGRP-S5可以同時識別且降解Lys-type PGN和DAP-type PGN，并啟動PO級聯(lián)反應(yīng)(Chenetal., 2014, 2016)。果蠅Drosophila的PGRP-LE結(jié)合DAP-type PGN激活PO級聯(lián)反應(yīng)(Takehanaetal., 2002, 2004)，同時細(xì)胞內(nèi)全長PGRP-LE識別DAP-type PGN后可獨立于IMD和Toll通路誘導(dǎo)自噬以消除細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌，如李斯特菌Listeriamonocytogenes(Yanoetal., 2008)。棉鈴蟲HelicoverpaarmigeraPGRP-A可同時識別Lys-type PGN和DAP-type PGN，并激活PO級聯(lián)反應(yīng)(Lietal., 2015)。

圖1 Cry毒素作用機(jī)制及昆蟲體液免疫系統(tǒng)Fig. 1 Mechanism of Cry toxin action and the humoral immune system of insects左上角示意Bt作用機(jī)制，左下角示意IMD通路，右上角示意Toll通路，右下角示意酚氧化酶原激活系統(tǒng)。Top left corner: Mechanism of Bt action. Lower left corner: IMD pathway. Top right corner: Toll pathway. Lower right corner: proPO-AS. ALP: 堿性磷酸酶Alkaline phosphatase; AMP: 抗菌肽Antimicrobial peptide; APN: 氨肽酶N Aminopeptidase-N; CAD: 鈣粘蛋白Cadherin; GNBP: 革蘭氏陰性細(xì)菌結(jié)合蛋白Gram-negative bacteria-binding protein; 20E: 20-羥基蛻皮酮20-Hydroxyecdysone; GPI: 糖基磷脂酰肌醇Glycosylphophatidyl inositol; Grass: 革蘭氏陽性細(xì)菌特異的絲氨酸蛋白酶Gram-positive-specific serine protease; JH: 保幼激素Juvenile hormone; PGRP: 肽聚糖識別蛋白Peptidoglycan recognition protein; ModSP: 模塊化絲氨酸蛋白酶Modular serine protease; Spz: Sp?tzle; proSpz: Sp?tzle前體pro-Sp?tzle; SPE: Sp?tzle加工酶Sp?tzle-processing enzyme; SPH: 絲氨酸蛋白酶同系物Serine protease homologs; PAP: 酚氧化酶原激活絲氨酸蛋白酶proPO activating serine protease; PPO: 酚氧化酶原Prophenoloxidase; PO: 酚氧化酶Phenoloxidase; Serpins: 絲氨酸蛋白酶抑制劑Serine protease inhibitors; TFs: 轉(zhuǎn)錄因子Transcription factors.

免疫調(diào)節(jié)因子(圖1)：PGRP-LA參與IMD通路的調(diào)節(jié)(Gendrinetal., 2013)，PGRP-SD對IMD通路進(jìn)行正調(diào)節(jié)(Iatsenkoetal., 2016)，而PGRP-LF, rPGPR-LC(PGRP-LC的一種剪接體), PGRP-LB, PGRP-SC1a/b和PGRP-SC2是IMD通路的負(fù)調(diào)控因子(Mellrothetal., 2003; Bischoffetal., 2006; Zaidman-Rémyetal., 2006; Mailletetal., 2008; Paredesetal., 2011)。

殺菌劑(圖1)：PGRP-SB1可通過降解DAP-type PGN直接殺死細(xì)菌(Mellroth and Steiner, 2006; Zaidman-Rémyetal., 2011)。家蠶的PGRP-S5對革蘭氏陽性及陰性細(xì)菌均具有抗菌活性(Chenetal., 2014, 2016)。

1.2 IMD免疫信號通路

IMD通路(圖1)主要通過識別DAP-type PGN應(yīng)對革蘭氏陰性菌的感染(Ferrandonetal., 2007; Buchonetal., 2014; Galenza and Foley, 2019)：PGRP-LCa-PGRP-LCx異二聚體以及細(xì)胞內(nèi)的全長PGRP-LE識別單體PGN，PGRP-LCx同源二聚體識別聚合的PGN，從而激活I(lǐng)MD通路(Choeetal., 2002; Kanekoetal., 2004, 2006)。只含有PGRP結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞外PGRP-LE促進(jìn)PGN與PGRP-LCx的相互作用(Kanekoetal., 2006; Neyenetal., 2012)。PGRP-SD與DAP-type PGN結(jié)合并增強(qiáng)激活I(lǐng)MD通路(Iatsenkoetal., 2016)。PGRP-LF和PGRP-LCx可以形成非信號異二聚體下調(diào)IMD通路(Mailletetal., 2008)。rPGRP-LC可選擇性識別死亡革蘭氏陰性菌聚合的PGN，并抑制IMD通路，同時它可與IMD通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子Pirk相互作用(Neyenetal., 2016)。PGRP-LB和PGRP-SC(均具有酰胺酶活性)通過降解PGN充當(dāng)IMD通路的負(fù)調(diào)節(jié)劑(Mellrothetal., 2003; Bischoffetal., 2006; Zaidman-Rémyetal., 2006; Mailletetal., 2008; Paredesetal., 2011)。如圖1所示：識別PGN信號后，形成了由IMD、Fas死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白(Fas-associated protein with death domain, FADD)及與胱天特異性蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase) caspase-8同源的Dredd(death-related Ced-3/Nedd2-like protein)組成的復(fù)合物(Lemaitreetal., 1995; Georgeletal., 2001; Leulieretal., 2002; Choeetal., 2005)。Dredd被E3連接酶凋亡抑制劑2 (E3-ligase inhibitor of apoptosis 2, Iap2)泛素化激活(Meinanderetal., 2012)。而Iap2與Uev1a(E2-ubiquitin-conjugating enzyme variant 1a)、Ubc13(Bendless)及Ubc5(Effete)結(jié)合(Zhouetal., 2005)。被激活后，Dredd裂解IMD，為Iap2創(chuàng)建一個新的結(jié)合位點，使IMD被K63多泛素化(Paquetteetal., 2010; Meinanderetal., 2012)。這導(dǎo)致Tab2/Tak1復(fù)合體(transforming growth factor β-activated kinase, Tak; Tak-binding protein, Tab)的形成和激活，Tab2/Tak1復(fù)合體繼而激活I(lǐng)κB 激酶(IκB kinase, IKK)復(fù)合體，Relish的N端被IKK復(fù)合體磷酸化從而被激活(Rutschmannetal., 2000; Silvermanetal., 2000; Luetal., 2001; Kleinoetal., 2005; Ertürk-Hasdemiretal., 2009)。Relish是IMD通路中一種NF-κB樣轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors, TFs)(Dushayetal., 1996; Khushetal., 2001)，它被Dredd水解，C端部分(Rel-49, IκB樣片段)被留在細(xì)胞質(zhì)中，而被IKK活化的N末端部分(Rel-68，具有Rel同源域)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，激活A(yù)MP基因的轉(zhuǎn)錄(St?venetal., 2000, 2003)。同時該轉(zhuǎn)錄的激活必須有Akirin(一種高度保守的核蛋白)的存在，且受其正向調(diào)控(Gotoetal., 2008)。Sickie是Relish激活所必需的(Foley and O′Farrell, 2004)；Pirk(Kleinoetal., 2008)、Caspar(Kimetal., 2006)和Dnr1(defence repressor 1)(Foley and O′Farrell, 2004; Guntermannetal., 2009)是IMD通路的負(fù)調(diào)控因子。

IMD通路在Tab2/Tak1處分出了c-Jun氨基末端激酶 (c-Jun N-terminal kinase, JNK)通路(Silvermanetal., 2003; Delaneyetal., 2006; Valanneetal., 2007)。JNK是絲裂原活化蛋白激酶家族成員(mitogen-activated protein kinase family, MAPK family)(Davis, 1994; Pelech, 1996)。而已有的研究表明，Tak1是一種MAP3K(mitogen-activated protein kinase kinase kinase)(Wangetal., 2001; Silvermanetal., 2003)。Tak1通過激活MKK4(MAPK kinase 4)及Hep(Hemipterous, 與MAPK kinase 7同源)而激活JNK，繼而激活A(yù)P-1(activating protein 1)，AP-1進(jìn)入細(xì)胞核激活應(yīng)激基因(stress genes)的轉(zhuǎn)錄(Gliseetal., 1995; Slussetal., 1996; Tournieretal., 1997; Boutrosetal., 2002; R?metetal., 2002b; Silvermanetal., 2003; Valanneetal., 2011)。AP-1主要是由Jun和Fos家族亞單位組成的二聚體轉(zhuǎn)錄因子，它們與一個共同的DNA位點——AP-1結(jié)合位點——結(jié)合(Perkinsetal., 1988, 1990; Karin, 1996; Karinetal., 1997; Riesgo-Escovar and Hafen, 1997)。同時Tak1還能激活其他不同類型的MKKs，進(jìn)而激活不同通路的MAPK級聯(lián)反應(yīng)，如p38(stress-activated MAPK of 38 kDa)通路(Wangetal., 2001; Delaneyetal., 2006; Buchonetal., 2014)。

此外蛻皮激素20-羥基蛻皮酮(20-hydroxyecdysone, 20E)對果蠅先天免疫的調(diào)節(jié)至關(guān)重要(Reganetal., 2013)。20E可控制IMD主要受體PGRP-LC的表達(dá)，從而調(diào)控IMD通路的活性(Rusetal., 2013)。

1.3 Toll免疫信號通路

Toll通路(圖1)主要應(yīng)對真菌及革蘭氏陽性細(xì)菌感染(Ferrandonetal., 2007; Lemaitre and Hoffmann, 2007; Chamyetal., 2008; Buchonetal., 2014)：革蘭氏陽性細(xì)菌被PGRP-SA-GNBP1復(fù)合體或PGRP-SD識別(Micheletal., 2001; Gobertetal., 2003; Bischoffetal., 2004; Leoneetal., 2008)，真菌的β葡聚糖(β-glucan)被GNBP3所識別，細(xì)菌或真菌的毒力因子(virulence factors)被一種絲氨酸蛋白酶Persephone所識別(Ligoxygakisetal., 2002; Gottaretal., 2006)。PGRPs及GNBPs的識別信號被模塊化絲氨酸蛋白酶(modular serine protease, modSP)整合，然后激活革蘭氏陽性細(xì)菌特異的絲氨酸蛋白酶(Gram-positive-specific serine protease, Grass)，進(jìn)而激活絲氨酸蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致Sp?tzle加工酶(Sp?tzle-processing enzyme, SPE)被激活，而Persephone則直接激活SPE(Gottaretal., 2006; Jangetal., 2006; Kambrisetal., 2006; Chamyetal., 2008; Buchonetal., 2009; Rohetal., 2009)。Sp?tzle(Spz)是一種結(jié)構(gòu)類似于哺乳動物白細(xì)胞介素-17(interleukin-17, IL-17)的具有胱氨酸結(jié)(cystine knot)的細(xì)胞因子，以非活性的前體(proSpz)形式存在，被SPE激活后裂解為Toll的活性配體(Morisato and Anderson, 1994; Mizuguchietal., 1998; Hymowitzetal., 2001; Weberetal., 2007; Arnotetal., 2010)。有兩種Spz與Toll結(jié)合的模型，一種認(rèn)為1個Spz二聚體與2個Toll形成復(fù)合物(Weberetal., 2003, 2005)，另一種認(rèn)為2個Spz二聚體與2個Toll形成復(fù)合物，復(fù)合物的形成導(dǎo)致Toll構(gòu)象變化，進(jìn)而激活下游信號(Gangloffetal., 2008)。

果蠅的Toll與哺乳動物IL-1Rs均有一個被稱為Toll/IL-1R(TIR)結(jié)構(gòu)域的胞質(zhì)同源結(jié)構(gòu)域(Imler and Hoffmann, 2001)。激活的Toll受體通過細(xì)胞內(nèi)的TIR結(jié)構(gòu)域與接頭蛋白MyD88結(jié)合(Horng and Medzhitov, 2001; Sunetal., 2002; Tauszig-Delamasureetal., 2002)。而后MyD88、Tube和激酶Pelle通過死亡結(jié)構(gòu)域(death domain, DD)介導(dǎo)的相互作用被招募來，形成MyD88-Tube-Pelle異源三聚體復(fù)合物(Xiaoetal., 1999; Sunetal., 2002)。MyD88和Pelle并不接觸，而是由接頭蛋白Tube中的兩個不同的DD表面分別結(jié)合MyD88和Pelle(Sunetal., 2002; Moncrieffeetal., 2008)。高度保守的Pelle/IL-1R相關(guān)激酶(Pelle/IL-1R-associated kinase, IRAK)互作蛋白Pellino是Toll信號的正調(diào)節(jié)因子(Haghayeghietal., 2010)。Pellino作為含有RING樣結(jié)構(gòu)域的蛋白家族，具有內(nèi)在的泛素E3連接酶活性，因此果蠅Pellino可能以類似于哺乳動物Pellinos多泛素化IRAK1的方式泛素化Pelle(Moynagh, 2009)。

Dorsal是一種Rel蛋白，最初被認(rèn)為與背腹(dorsal-ventral, DV)極化有關(guān)，和Dif(dorsal-related immunity factor)均是NF-κB轉(zhuǎn)錄因子，而Cactus是一種IκB因子，與Dorsal和(或)Dif結(jié)合，從而抑制兩者的核定位及活性(Ipetal., 1993; Tatei and Levine, 1995; Grossetal., 1996)。信號經(jīng)過MyD88-Tube-Pelle異源三聚體復(fù)合物及細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)導(dǎo)致Cactus的磷酸化和降解，從而釋放Dorsal和(或)Dif，它們轉(zhuǎn)運至細(xì)胞核，并激活相關(guān)基因(如AMP基因)的轉(zhuǎn)錄(Kidd, 1992; Reichhartetal., 1993; Edwardsetal., 1997; Wu and Anderson, 1998; Fernandezetal., 2001; Towbetal., 2001; Huangetal., 2010)。G蛋白偶聯(lián)受體激酶2(G protein-coupled receptor kinase 2, Gprk2)雖不參與Cactus的降解，但可與其相互作用，是Toll通路的調(diào)節(jié)因子(Valanneetal., 2010)。

1.4 酚氧化酶原激活系統(tǒng)

PO是昆蟲重要的免疫防衛(wèi)因子，在昆蟲血淋巴中主要以無活性的酚氧化酶原(prophenoloxidase, PPO)的形式存在(S?derh?ll and Cerenius, 1998)。它通過酚氧化酶原激活系統(tǒng)(prophenoloxidase-activating system, proPO-AS)參與黑化反應(yīng)、吞噬作用、凝集作用、傷口愈合等多種免疫反應(yīng)及生理過程(Lemaitre and Hoffmann, 2007; Jiangetal., 2009; González-Santoyo and Córdoba-Aguilar, 2012)。一個通用的proPO-AS模型如下所述(圖1)：S型PGRP識別革蘭氏陽性和(或)陰性細(xì)菌(Yoshidaetal., 1996; Chenetal., 2014, 2016; Lietal., 2015)，PGRP-LE識別革蘭氏陰性細(xì)菌(Takehanaetal., 2002, 2004)，GNBP3識別真菌(Gottaretal., 2006; Mishimaetal., 2009; Matskevichetal., 2010)。而后這些識別信號激活一系列絲氨酸蛋白酶級聯(lián)(serine protease cascade)，最終激活酚氧化酶原激活絲氨酸蛋白酶(proPO activating serine protease, PAP)，也被稱為酚氧化酶原激活酶(proPO-activating enzyme, PPAE)，PAP繼而激活PPO形成活化的PO，PO則促使酚氧化為醌，醌最終形成黑色素(Ashidaetal., 1974; Ashida and Dohke, 1980; Chaseetal., 2000; Cerenius and S?derh?ll, 2004; Kanost and Gorman, 2008; González-Santoyo and Córdoba-Aguilar, 2012)。某些情況下，PAPs需要蛋白輔助因子或絲氨酸蛋白酶同系物(serine protease homolog, SPH)才對PPO表現(xiàn)出活性(Jiangetal., 1998; Kwonetal., 2000; Yuetal., 2003)。絲氨酸蛋白酶抑制蛋白(serine protease inhibitor proteins, Serpins)作為絲氨酸蛋白酶抑制劑調(diào)控proPO-AS(De Gregorioetal., 2002; Gettins, 2002; Jiangetal., 2003; Jiangetal., 2009)。同時有研究表明proPO-AS與Toll通路被相同的絲氨酸蛋白酶級聯(lián)控制調(diào)節(jié)(圖2)(Kanetal., 2008; Jiangetal., 2009; Parketal., 2010)。

圖2 Toll和黑色素合成級聯(lián)調(diào)控模型(改自Jiang et al., 2009和Park et al., 2010)Fig. 2 Model summarizing the molecular events in the regulation of the Toll and melanin synthesis cascades (adapted from Jiang et al., 2009, and Park et al., 2010)黃粉蟲Toll通路導(dǎo)致抗菌肽產(chǎn)生(Kim et al., 2008; Roh et al., 2009)和pro-PO級聯(lián)導(dǎo)致黑色素合成(Kan et al., 2008)的分子激活機(jī)制分別被報道。經(jīng)過加工的Sp?tzle誘導(dǎo)內(nèi)源性SPN40和SPN55產(chǎn)生，并作為Toll通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)器。此外，這3種Serpins阻斷了proPO的激活，從而抑制了黑色素的合成。The molecular activation mechanism of the Toll cascade of Tenebrio molitor leading to production of antimicrobial peptides (AMPs)(Kim et al., 2008; Roh et al., 2009) and the pro-PO cascade leading to melanin synthesis (Kan et al., 2008) were reported. Processed Sp?tzle induces the production of endogenous SPN40 and SPN55 as a negative feedback regulator of the Toll cascade. Also, the three Serpins block the activation of proPO, leading to inhibition of melanin synthesis. aMSP: 激活的MSP Activated MSP; aSAE: 激活的SAE Activated SAE; aSPE: 激活的SPE Activated SPE; GNBP: 革蘭氏陰性細(xì)菌結(jié)合蛋白Gram-negative bacteria-binding proteins; PGRP: 肽聚糖識別蛋白Peptidoglycan recognition protein; PO: 酚氧化酶Phenoloxidase; ProMSP: 模塊化絲氨酸蛋白酶前體Pro-modular serine protease; Pro-PO: 酚氧化酶原Prophenoloxidase; ProSAE: SPE激活酶前體Pro-SPE-activating enzyme; ProSPE: Sp?tzle加工酶前體Pro-Sp?tzle-processing enzyme; Pro-SPH: 絲氨酸蛋白酶同源物前體Pro-serine protease homologue; proSpz: Sp?tzle前體Pro-Sp?tzle; SPH: 絲氨酸蛋白酶同源物Serine protease homologue; SPN: 絲氨酸蛋白酶抑制蛋白Serine protease inhibitor protein; Spz: Sp?tzle.

2 Bt殺蟲晶體蛋白及其作用機(jī)制

Bt殺蟲晶體蛋白由Cry基因編碼，在大多數(shù)Bt菌株中，Cry基因位于質(zhì)粒上，目前已有800多種Cry毒素被發(fā)現(xiàn)(http:∥www.btnomenclature.info/)(Dean, 1984; Crickmoreetal., 1998)。Cry毒素對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目等昆蟲，以及線蟲均有活性(Schnepfetal., 1998; Weietal., 2003)，但不同的Cry毒素抗蟲譜并不一樣(Frankenhuyzen, 2009)，具體可在網(wǎng)站http:∥www.glfc.cfs.nrcan.gc.ca/bacillus中查詢。

以鱗翅目昆蟲為例，Bt被攝入后，伴孢晶體隨著Bt菌體細(xì)胞壁的破裂而與孢子一起被釋放；伴孢晶體在腸道堿性環(huán)境下溶解，并釋放出Cry原毒素；Cry原毒素分子量約130～140 kDa，在堿性環(huán)境下被蛋白酶水解，形成活化的單體Cry毒素(約60～65 kDa)；活化的Cry毒素最初與中腸上皮細(xì)胞的頂端微絨毛結(jié)合，可使昆蟲中腸上皮細(xì)胞裂解脫落，釋放大量細(xì)胞內(nèi)容物，為微生物生長提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，同時微生物(包括腸道菌群及Bt)通過腸道受損部位侵入血淋巴，進(jìn)而引發(fā)嚴(yán)重的敗血癥，最終導(dǎo)致昆蟲死亡(Heimpel and Angus, 1959; Materu, 1962; Sutter and Raun, 1967; Tojo and Aizawa, 1983; Salama and Sharaby, 1985; Knowles and Ellar, 1987; Bravoetal., 1992, 2005; Schnepfetal., 1998; de Maagdetal., 2001; Johnston and Crickmore, 2009; Raymondetal., 2010; Adangetal., 2014; Jurat-Fuentesetal., 2021)。然而活化的Cry毒素使昆蟲中腸上皮細(xì)胞死亡的機(jī)制還未完全明確。關(guān)于這一問題，目前主要有以下3種理論模型(仍以鱗翅目為例)。

孔道形成模型(圖1)：活化的Cry毒素穿過圍食膜，與中腸上皮細(xì)胞膜上的受體氨肽酶N(aminopeptidase-N, APN)或堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)以低親和力(APN: Kd=101 nmol/L; ALP: Kd=267 nmol/L)結(jié)合(Massonetal., 1995; Jurat-Fuentes and Adang, 2004; Arenasetal., 2010)。ALP及APN在細(xì)胞膜上具有很高的豐度，它們被糖基磷脂酰肌醇(glycosylphophatidyl inositol, GPI)錨定在膜上(Upadhyay and Singh, 2011)?；罨舅卦谂cALP和APN的相互作用下，集中在中腸上皮細(xì)胞的微絨毛膜上，在此處，活化毒素以高親和力(Kd=1 nmol/L)與鈣粘蛋白(cadherin, CAD)結(jié)合(Vadlamudietal., 1995; Gómezetal., 2006; Pachecoetal., 2009; Arenasetal., 2010)。CAD與活化毒素相互作用，進(jìn)一步將毒素N端水解(包括Domain I中的α螺旋1)，這使Cry毒素Domain I中的疏水區(qū)域暴露出來，觸發(fā)了活化毒素的寡聚化，形成Cry毒素前孔寡聚體(Gómezetal., 2002; Soberónetal., 2007; Pachecoetal., 2009; Arenasetal., 2010)。Cry毒素前孔寡聚體與ALP及APN的親和力增加了約200倍(APN: Kd=0.6 nmol/L; ALP: Kd=0.5 nmol/L)，Cry毒素以前孔寡聚體的形式再次與ALP和APN結(jié)合，而后這些前孔寡聚體被誘導(dǎo)插入細(xì)胞膜形成孔洞，最終導(dǎo)致細(xì)胞溶解(Knowles and Ellar, 1987; Zhuangetal., 2002; Bravoetal., 2004, 2005, 2007, 2011, 2013; Pachecoetal., 2009; Arenasetal., 2010; Pardo-Lópezetal., 2013)。最近十年的研究發(fā)現(xiàn)，三磷酸腺苷結(jié)合盒式(ATP-binding cassette, ABC)轉(zhuǎn)運蛋白也是重要的Cry毒素受體(Adangetal., 2014)。煙芽夜蛾Heliothisvirescens(Gahanetal., 2010)、小菜蛾P(guān)lutellaxylostella和粉紋夜蛾Tricholusiani(Baxteretal., 2011)最早被發(fā)現(xiàn)對Cry毒素產(chǎn)生抗性與ABC轉(zhuǎn)運蛋白有關(guān)。Gahan等(2010)認(rèn)為ABCC2蛋白可以促進(jìn)Cry毒素寡聚體插入細(xì)胞膜。Xiao和Wu(2019)認(rèn)為ABC轉(zhuǎn)運蛋白可能與CAD一起發(fā)揮關(guān)鍵作用：CAD負(fù)責(zé)激活Cry毒素的寡聚，這是Cry毒素與ABC轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)合所必需的，而Cry毒素寡聚體與ABC轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)合從而形成細(xì)胞膜穿孔。但是Cry毒素與ABC轉(zhuǎn)運蛋白相互作用的機(jī)制仍然不是十分清楚，需要更多更深入的研究來揭示。

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模型：Cry原毒素被水解釋放出活化的Cry毒素，Cry毒素與受體鈣黏蛋白BT-R1結(jié)合，激活鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白α亞基(guanine nucleotide-binding protein α-subunit, Gαs)及腺苷酸環(huán)化酶(adenylyl cyclase, AC)，導(dǎo)致環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)積累，進(jìn)而激活蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)。AC/PKA信號通路的激活，使得細(xì)胞骨架及細(xì)胞膜上的離子通道被破壞，這種對細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整性的損害導(dǎo)致細(xì)胞死亡(Zhangetal., 2005, 2006)。然而有許多研究表明毒素僅與CAD結(jié)合不足以產(chǎn)生毒性(Vachonetal., 2002, 2004; Jiménez-Juárezetal., 2007; Girardetal., 2008; Rodríguez-Almazánetal., 2009)，此外，經(jīng)改造去除α螺旋1的Cry1AMod毒素能夠跳過與CAD結(jié)合的步驟而殺死因CAD突變而對Bt產(chǎn)生抗性的棉紅鈴蟲Pectinophoragossypiella或是CAD被沉默的煙草天蛾Manducasexta，支持毒素僅與CAD結(jié)合，不足以在目標(biāo)昆蟲的中腸細(xì)胞中誘導(dǎo)毒性的假設(shè)(Soberónetal., 2007)。同時該模型完全忽略了一些已被充分證實的結(jié)論，使得信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模型被質(zhì)疑(Soberónetal., 2009; Vachonetal., 2012; Bravoetal., 2013; Pardo-Lópezetal., 2013; Adangetal., 2014)。

孔道形成+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模型：該模型認(rèn)為Cry毒素的活性是在上述孔道形成和信號傳導(dǎo)的共同作用下引起的(Jurat-Fuentes and Adang, 2006)，Adang等(2014)推測在Cry毒素濃度較低的情況下，可能會以信號轉(zhuǎn)導(dǎo)引起細(xì)胞死亡為主，而濃度較高則會以孔道形成為主。但上述均為假設(shè)，且信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模型存疑，因此并未得到廣泛認(rèn)同。

3 昆蟲Bt抗性機(jī)制

昆蟲對Bt的抗性機(jī)制復(fù)雜多樣，但主要可歸結(jié)為以下3種類型。

其一，由于昆蟲中腸中缺乏蛋白酶、組成變化或蛋白酶啟動子突變，使得Cry原毒素的激活受阻，進(jìn)而對Bt產(chǎn)生抗性(Forcadaetal., 1996; Oppertetal., 1997; Herreroetal., 2001; Lietal., 2004; Rajagopaletal., 2009; Liuetal., 2014)。

其二，Cry毒素受體CAD, ALP, APN或ABC轉(zhuǎn)運蛋白的突變或減少，導(dǎo)致昆蟲對Bt產(chǎn)生抗性。如反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的插入破壞了一個CAD基因，導(dǎo)致煙芽夜蛾對Cry1Ac的高水平抗性(Gahanetal., 2001)。Wang L等(2018)報道了首例與昆蟲Bt抗性相關(guān)的CAD跨膜區(qū)域突變，該研究發(fā)現(xiàn)由于突變基因編碼缺失跨膜區(qū)域的CAD，導(dǎo)致CAD胞內(nèi)運輸被破壞，無法定位于細(xì)胞膜上發(fā)揮其毒素受體的作用，使棉紅鈴蟲獲得對Cry1Ac的抗性。Jurat-Fuentes和Adang(2004)從煙芽夜蛾中鑒定出一種膜結(jié)合形式的ALP，并發(fā)現(xiàn)該ALP可與Cry1Ac結(jié)合，且在抗Cry1Ac品系幼蟲中腸刷狀緣膜囊泡(brush border membrane vesicles, BBMV)中的含量降低。Jurat-Fuentes等(2011)進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)相較于敏感品系，煙芽夜蛾、棉鈴蟲及草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda抗Cry毒素品系的中腸膜結(jié)合ALP表達(dá)水平均降低，并提出應(yīng)將ALP表達(dá)量的降低作為鱗翅目害蟲對Cry毒素產(chǎn)生抗性的標(biāo)志。APN也是重要的Cry毒素受體。一種APN的表達(dá)缺失使得甜菜夜蛾Spodopteraexigua對Cry1Ca產(chǎn)生抗性(Herreroetal., 2005)；而Xu等(2014)在對亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis的研究中也發(fā)現(xiàn)，抗Cry1Ab品系的APN相對于敏感品系有多個氨基酸變異，且其表達(dá)量也與敏感品系存在差異。Gahan等(2010)最早報道ABC轉(zhuǎn)運蛋白與昆蟲Bt抗性有關(guān)：ABCC2的失活突變使Cry1Ac與BBMV的結(jié)合減少，導(dǎo)致煙芽夜蛾對其表現(xiàn)出高水平抗性。Tanaka等(2013)則首次證明ABCC2是Cry毒素的受體，并發(fā)現(xiàn)表達(dá)BmABCC2的Sf9細(xì)胞系對Cry毒素的敏感性遠(yuǎn)高于僅表達(dá)BtR175(一種CAD樣受體)毒素結(jié)合區(qū)的Sf9細(xì)胞系。有絲分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號通路是調(diào)節(jié)小菜蛾中ALP和ABCC基因表達(dá)的總開關(guān)(Guoetal., 2015)，而最新研究表明，昆蟲兩種主要激素：20-羥基蛻皮酮(20E)和保幼激素(juvenile hormone, JH)之間的串?dāng)_可以激活和微調(diào)MAPK級聯(lián)，進(jìn)而導(dǎo)致小菜蛾對Bt的抗性(Guoetal., 2020)。

其三，也有人指出昆蟲對Bt的抗性與免疫系統(tǒng)有關(guān)(Gunningetal., 2005)。Caccia等(2016)發(fā)現(xiàn)，Bt的殺蟲活性不僅與宿主的腸道菌群有關(guān)，還與宿主免疫系統(tǒng)的強(qiáng)弱有關(guān)。最近的一些研究也證明昆蟲對Bt的抗性與免疫系統(tǒng)有關(guān)。例如，Liu等(2019)發(fā)現(xiàn)，作為免疫系統(tǒng)重要模式識別受體的PGRPs的表達(dá)水平在小菜蛾Cry1Ac抗性品系和敏感品系間存在顯著差異，同時抗性品系幼蟲具有更高的酚氧化酶活性；通過RNA干擾敲除?；页嵋苟闟podopteralittoralis的免疫基因(Sl102)可以顯著增強(qiáng)Bt對其幼蟲的殺蟲活性(Cacciaetal., 2020)，García-Robles等(2020)發(fā)現(xiàn)馬鈴薯甲蟲Leptinotarsadecemlineata暴露于Cry3Aa毒素后，血淋巴中參與昆蟲生長的蛋白含量減少，免疫反應(yīng)相關(guān)蛋白含量增加，說明其對Bt的耐受性受到其免疫系統(tǒng)的影響。Lin等(2020)研究發(fā)現(xiàn)Toll, IMD, JNK和JAK-STAT等免疫通路均參與小菜蛾對Bt的免疫防御，而用重組的酚氧化酶原(PPO)飼喂受Bt感染的小菜蛾幼蟲可提高其成活率。Li等(2021)在研究腸道微生物對小菜蛾Bt敏感性的影響時亦得到與Lin等(2020)類似結(jié)果。在受到Bt侵染時，Anticarsiagemmatalis體內(nèi)激活I(lǐng)MD和Toll通路相關(guān)基因，以及proPO-AS相關(guān)絲氨酸蛋白酶基因的表達(dá)量均顯著上調(diào)(Pezentietal., 2021)。如上所述，近年來已有一些研究發(fā)現(xiàn)昆蟲的免疫系統(tǒng)參與了對抗Bt，同時多數(shù)研究提示昆蟲免疫系統(tǒng)在對抗Bt時主要依靠IMD和Toll免疫信號通路及proPO-AS(表1)。然而這些研究多是側(cè)面證明或很籠統(tǒng)地指出昆蟲免疫系統(tǒng)或某類免疫基因與其Bt抗性有關(guān)(Gunningetal., 2005; Liuetal., 2019; García-Roblesetal., 2020; Lietal., 2021; Pezentietal., 2021)。極少有研究能直接證明具體哪個免疫基因?qū)ハxBt抗性起了顯著作用(Cacciaetal., 2016, 2020; Linetal., 2020)，且還沒有研究能說明在對抗Bt侵染的過程中昆蟲免疫系統(tǒng)具體的作用機(jī)制。昆蟲免疫系統(tǒng)極為復(fù)雜，本文僅對其體液免疫的主要免疫通路做了歸納(圖1)。然而結(jié)合已有的研究，我們?nèi)钥奢^為清晰地看到這些免疫通路可能的參與對抗Bt的方式。

表1 昆蟲免疫系統(tǒng)參與對Bt的防御Table 1 Involvement of immune system in the defense against Bt in insects

首先，Guo等(2015)已證明MAPK信號通路是調(diào)節(jié)小菜蛾中ALP和ABCC基因表達(dá)的總開關(guān)。MAPKs是細(xì)胞表面到細(xì)胞核信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要中介，其調(diào)節(jié)涉及廣泛的生理過程(Davis, 1993, 1994)。MAPK信號通路極為復(fù)雜，其不僅包含多個信號通路，同時某些通路間還存在著不同程度的相互串?dāng)_，控制著不同基因的表達(dá)(Davis, 1993, 1994; Cahilletal., 1996; Pelech, 1996)。而IMD免疫通路中的Tak1是一種MAP3K，與Guo等(2021)研究中發(fā)現(xiàn)的MAP3K7作用相同，可以通過不同路徑激活下游JNK或p38等MAPK(Wangetal., 2001; Boutrosetal., 2002; Silvermanetal., 2003; Delaneyetal., 2006)，進(jìn)而激活相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(TFs)。這些TFs可能不僅激活應(yīng)激或免疫相關(guān)的基因表達(dá)，也可能直接或間接參與調(diào)節(jié)ALP和ABCC基因的表達(dá)，進(jìn)而影響昆蟲的Bt抗性。另一方面，參與激活和微調(diào)MAKP級聯(lián)，進(jìn)而導(dǎo)致小菜蛾對Bt表現(xiàn)出抗性的20E(Guoetal., 2020)亦參與了對IMD免疫通路的調(diào)控(Reganetal., 2013; Rusetal., 2013)。因此，IMD免疫通路可能通過MAPK信號通路參與調(diào)節(jié)昆蟲對Bt的抗性。

其次，通過AMP、黑化反應(yīng)，及(或)體液免疫與細(xì)胞免疫的相互關(guān)聯(lián)激活血細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用、凝集或包被作用等，對抗因中腸組織被Bt破壞而引起的腸道內(nèi)微生物大量繁殖及后續(xù)的敗血癥(Sutter and Raun, 1967; Salama and Sharaby, 1985; Bravoetal., 1992, 2005; Johnston and Crickmore, 2009; Lietal., 2021)，并通過JNK信號通路促使傷口愈合(Noselli, 1998; R?metetal., 2002b)，進(jìn)而提高昆蟲對Bt毒害的耐受力。 Sutter和Raun(1967)在研究中觀察到了血細(xì)胞沉積阻止Bt菌進(jìn)入血淋巴的證據(jù)。而本實驗室的研究發(fā)現(xiàn)小菜蛾Cry1Ac抗性品系中參與黑化反應(yīng)的PO活性遠(yuǎn)高于敏感品系(Liuetal., 2019)，且已有直接證據(jù)證明PPO可提高小菜蛾對Bt的抗性(Linetal., 2020)。這可能是因為Bt可導(dǎo)致昆蟲中腸穿孔(Adangetal., 2014)，而黑化反應(yīng)在昆蟲傷口愈合方面具有重要作用，且可直接殺死或鈍化通過傷口入侵的微生物(S?derh?ll and Cerenius, 1998; Lemaitre and Hoffmann, 2007; S?derh?ll, 2010; González-Santoyo and Cordoba-Aguilar, 2012)，從而控制后續(xù)敗血癥的發(fā)展。

4 小結(jié)

從20世紀(jì)末至今約30年的時間里，科學(xué)家們以Bt殺蟲晶體蛋白作用機(jī)制為向?qū)?，逐步探明了Bt原毒素活化受阻及各類Cry毒素受體突變或減少兩大類原因?qū)е吕ハx產(chǎn)生Bt抗性的機(jī)制。然而在腸道因Bt受損后，昆蟲是如何應(yīng)對的？相關(guān)研究并不多。結(jié)合前文的論述，我們知道這主要涉及到昆蟲的免疫系統(tǒng)，且可由此得到兩條新的尋找昆蟲免疫系統(tǒng)與其Bt抗性關(guān)系的思路：(1)免疫系統(tǒng)會否通過MAPK信號通路調(diào)節(jié)ALP和ABC轉(zhuǎn)運蛋白等Bt受體的表達(dá)，從而改變昆蟲對Bt的抗性？(2)Bt對中腸組織的破壞形成后，免疫系統(tǒng)的哪些反應(yīng)對修補(bǔ)組織、控制感染的作用最大？同時這些反應(yīng)的增強(qiáng)或減弱會否對其Bt抗性產(chǎn)生影響？明確昆蟲體液免疫系統(tǒng)與昆蟲Bt抗性之間的關(guān)系將有助于設(shè)計防治害蟲的新策略。隨著不同層面組學(xué)的發(fā)展，相關(guān)進(jìn)展將極大促進(jìn)對害蟲Bt抗性機(jī)制的深入探索，發(fā)現(xiàn)更多新的抗性機(jī)制，從而可以開發(fā)更多新的、更安全高效的害蟲綜合防治技術(shù)并加以應(yīng)用。