康舒淇，徐麗，張明惠，陳博，晉玲，2，3，朱田田，2，3

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.西北中藏藥省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省珍稀中藥資源評(píng)價(jià)與保護(hù)利用工程研究中心，甘肅 蘭州 730000

肉蓯蓉為列當(dāng)科肉蓯蓉屬植物肉蓯蓉Cistanche deserticolaY.C.Ma和管花肉蓯蓉Cistanche.tubulosa（Schenk）Wight的干燥帶鱗葉肉質(zhì)莖[1]。全球約有22種肉蓯蓉屬植物，多分布于北半球歐亞溫暖的沙漠、荒漠等干燥地帶。據(jù)《中國(guó)植物志》記載，中國(guó)的肉蓯蓉屬植物主要有5種，包括肉蓯蓉C.deserticolaY.C.Ma、管花肉蓯蓉C.tubulosa（Schenk）Wight、鹽生肉蓯蓉Cistanche salsa（C.A.Mey.）G.Beck、沙蓯蓉Cistanche sinensisG.Beck及蘭州肉蓯蓉Cistanche.lanzhouensisZ.Y.Zhang，主要分布在新疆、內(nèi)蒙古、甘肅等西北部地區(qū)[2]。肉蓯蓉不僅具有較高的藥用價(jià)值，因其有利于沙漠治理和土壤改善，也具有較高的生態(tài)效益[3]。甘肅省作為2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定正品肉蓯蓉的主要分布省份之一，野生蘊(yùn)藏量和人工種植面積的合理規(guī)劃和采收尤為重要[4]。隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展及國(guó)民健康需求的不斷增加，肉蓯蓉需求量日益增長(zhǎng)，通過對(duì)甘肅肉蓯蓉資源現(xiàn)狀進(jìn)行實(shí)地調(diào)查[5]，發(fā)現(xiàn)在皋蘭、靖遠(yuǎn)等多個(gè)地區(qū)仍然存在對(duì)野生肉蓯蓉的大規(guī)模、滅絕式采挖現(xiàn)象，致使野生資源受到嚴(yán)重破壞。非藥典種在民間大量使用的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，大量偽品肉蓯蓉進(jìn)入藥市[6]，種質(zhì)混亂勢(shì)必造成商品肉蓯蓉質(zhì)量參差不齊，嚴(yán)重影響其經(jīng)濟(jì)價(jià)值，因此對(duì)不同種質(zhì)的肉蓯蓉進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定尤為重要。

分子鑒定技術(shù)因樣品用量少、速度快、準(zhǔn)確性高，已被廣泛用于動(dòng)植物的物種鑒定[7]，而當(dāng)前對(duì)甘肅肉蓯蓉的種質(zhì)資源分子鑒定研究還未見報(bào)道。本研究以核基因片段nrDNA的ITS和CD序列、葉綠體基因片段cpDNA的matK和rbcL序列為研究對(duì)象，對(duì)甘肅省不同種質(zhì)肉蓯蓉進(jìn)行分子鑒定，以期尋找適合肉蓯蓉分類的基因序列，并探究種質(zhì)內(nèi)與種質(zhì)間的差異，實(shí)現(xiàn)肉蓯蓉種質(zhì)的快速準(zhǔn)確鑒別，以此探討肉蓯蓉種質(zhì)間的分類地位，為甘肅肉蓯蓉資源的評(píng)價(jià)、保護(hù)和利用提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

OHAUS Corporation DV SERIES型電子天平，奧豪斯儀器有限責(zé)任公司；DK-98型數(shù)顯恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；TGL-16M型高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司；G1000改進(jìn)型基因聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀，杭州博日科技有限公司；4100型凝膠成像處理系統(tǒng)，上海天能科技有限公司；Vortex-Genie 2T型渦旋混勻器，德國(guó)IKA公司；BCD-451WDEMU1型冰箱，青島海爾股份有限公司。

NEP003-2型植物基因組提取試劑盒（批號(hào)B00B00103），北京鼎國(guó)昌盛科生物技術(shù)有限責(zé)任公司；β-巰基乙醇（批號(hào)20191103）、Agarose瓊脂糖（批號(hào)0000590598）、BSA（批號(hào)20191203）、引物、Taq DNA Polymerase（批號(hào)W9910e）、dNTPs（批號(hào)R6409）、GoldView核酸染料（批號(hào)321523BB）等PCR試劑，上海生工生物工程股份有限公司；DNA Marker（批號(hào)20190601），大連寶生物股份有限公司；乙醇、氯仿、異戊醇、異丙醇為分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；水為屈臣氏純凈水。

肉蓯蓉樣品共27份，多數(shù)為自采，部分為市場(chǎng)購(gòu)買，其中肉蓯蓉（C.deserticola）16份、沙蓯蓉（C.sinensis）6份、鹽生肉蓯蓉（C.salsa）4份、蘭州肉蓯蓉（C.lanzhouensis）1份。經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)晉玲教授鑒定為以上基原肉蓯蓉的肉質(zhì)莖，所有樣品采集后于干燥硅膠中保存，樣品來源信息見表1。

表1 肉蓯蓉樣品來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 肉蓯蓉基因組DNA提取與質(zhì)量檢測(cè)

用75%乙醇擦拭樣品表面后置于2 mL離心管中，粉碎成細(xì)粉。采用植物基因組DNA快速抽提試劑盒提取樣品的基因組DNA，提取操作方法參照試劑盒說明書。由于肉蓯蓉藥材多糖含量較高，對(duì)DNA提取有一定干擾，故在此方法基礎(chǔ)上用75%乙醇純化DNA 3～4次。提取的基因組DNA于-20℃冰箱中保存。采用電泳1%瓊脂糖凝膠，1×TAE緩沖液，于電泳儀（220 V，50 mA，30 min）進(jìn)行基因組DNA完整性檢測(cè)。電泳完成后，置于凝膠成像儀下觀察，選取條帶清晰明亮，無明顯拖尾雜帶的DNA用于后續(xù)分析。

2.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

2.2.1 引物信息

在查閱文獻(xiàn)[8-10]的基礎(chǔ)上進(jìn)行篩選，選用擴(kuò)增成功率較高的4對(duì)引物：ITS2-ITS3、CD1F-CD1R、matK3F-matK1R和rbcL1F-rbcL724R。引 物 信 息見表2。

表2 肉蓯蓉基因組序列PCR引物信息

2.2.2 反應(yīng)體系與檢測(cè)

PCR擴(kuò)增總體系為25μL：10×PCR Buffer 2.5μL，dNTPs（10 mmol/L）2.0μL，BSA 0.5μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，正向及反向引物各0.5μL，DNA模板2μL，ddH2O 15.5μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，根據(jù)不同引物的退火溫度復(fù)性30 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min，4℃保存。27份肉蓯蓉樣品經(jīng)4對(duì)引物擴(kuò)增后電泳檢測(cè)，其擴(kuò)增條帶清晰明亮，擴(kuò)增成功率均為100%（見圖1）。將符合測(cè)序條件的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

圖1 肉蓯蓉基因組序列部分PCR產(chǎn)物電泳

2.3 結(jié)果分析

2.3.1 樣品測(cè)序結(jié)果

將測(cè)序所得序列文件用Chromas和ContigExpress軟件去除兩端不穩(wěn)定信號(hào)的低質(zhì)量堿基，用以校對(duì)峰圖，并將每個(gè)樣品測(cè)序后的正反向序列拼接[11]，對(duì)拼接后的每條序列峰圖進(jìn)行檢查及人工校對(duì)，將處理得到的樣品序列及采集信息上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。ITS2F-ITS3R序列登錄號(hào)為OL827059-OL827085，CD1F-CD1R序列登錄號(hào)為OL827086-OL827112，matK3F-matK1R序列登錄號(hào)為OL827113-OL827139，rbcL1F-rbcL724R序列登錄號(hào)為OL827140-OL827166（見表3）。

表3 肉蓯蓉樣品序列GenBank登錄號(hào)

2.3.2 肉蓯蓉序列特征

27份肉蓯蓉樣品均被成功擴(kuò)增和測(cè)序，使用Mega X軟件[12]中ClustalW程序?qū)?對(duì)引物擴(kuò)增出的序列進(jìn)行比對(duì)，再分別將nrDNA和cpDNA序列聯(lián)合得到2組合并序列的序列特征（見表4）。4對(duì)序列的GC含量分別為56.8%、56.9%、30.3%和41.3%，而cpDNA合并序列GC含量比nrDNA合并序列低，為34.6%。

表4 肉蓯蓉樣品序列特征

2.3.3 核苷酸多態(tài)性

運(yùn)用DanSP5.10.01軟件[13]進(jìn)行核苷酸多態(tài)性分析，肉蓯蓉樣品在ITS、CD、matK和rbcL序列的堿基位點(diǎn)中存在著不同程度的變異，其中，matK序列的變異位點(diǎn)、單一突變位點(diǎn)、簡(jiǎn)約信息性位點(diǎn)、插入-缺失位點(diǎn)及平均核苷酸差異數(shù)均明顯高于其余3對(duì)序列，共檢測(cè)到481個(gè)變異位點(diǎn)、369個(gè)單一突變位點(diǎn)、112個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)和88個(gè)插入-缺失位點(diǎn)，平均核苷酸差異數(shù)為62.761。cpDNA合并序列的變異位點(diǎn)、單一突變位點(diǎn)、簡(jiǎn)約信息性位點(diǎn)、插入-缺失位點(diǎn)及平均核苷酸差異數(shù)均明顯高于nrDNA合并序列，共檢測(cè)到534個(gè)變異位點(diǎn)、388個(gè)單一突變位點(diǎn)、146個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)和120個(gè)插入-缺失位點(diǎn)，平均核苷酸差異數(shù)為77.276，但其核苷酸多樣性低于nrDNA合并序列（見表5）。

表5 肉蓯蓉樣品核苷酸多態(tài)性信息

2.3.4 單倍型多樣性

根據(jù)DanSP5.10.01軟件分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉樣品的4對(duì)序列和2組合并序列的單倍型多樣性均大于0.5，值越大，則可推斷多樣性程度越高。在4對(duì)序列中，matK序列中單倍型數(shù)量最多，共形成21個(gè)單倍型；2組合并序列中，cpDNA序列的單倍型多樣性更高，其單倍型數(shù)量達(dá)到24個(gè)（見表6）。

表6 肉蓯蓉樣品單倍型多樣性

2.3.5 種質(zhì)遺傳距離分析

基于kimura2-parameter（K2P）模型計(jì)算肉蓯蓉ITS、CD、matK和rbcL4對(duì)序列的種質(zhì)遺傳距離（見表7）可知，4對(duì)序列的平均遺傳距離為0.209 3、0.010 8、0.109 4、0.027 1，經(jīng)比較其遺傳距離ITS＞matK＞rbcL＞CD。4對(duì)序列得到的所有樣品遺傳距離范圍分別為0～1.405 6、0～0.064 1、0～0.992 5、0～0.077 3。對(duì)比可得，ITS和matK序列的變異性較大，CD和rbcL序列較保守。此外，計(jì)算遺傳距離均顯示蘭州肉蓯蓉與肉蓯蓉的遺傳距離最近，使用matK序列通過GraphPad Prism 8.0.1軟件繪制遺傳距離矩陣熱圖，遺傳距離為0.001 2（見圖2）。

表7 肉蓯蓉不同序列種質(zhì)遺傳距離

圖2 肉蓯蓉matK序列遺傳距離矩陣

2.3.6 聚類分析

通過GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載草蓯蓉屬Boschniakia植物丁座草Boschniakia himalaicaHook.f.et Thoms.序列信息（ITS和CD為AY911212.1，matK為MH659839.1，rbcL為MG546905.1），以其為外類群與nrDNA和cpDNA序列及2組合并序列構(gòu)建鄰接法（NJ）聚類樹[14]，結(jié)果表明，外類群丁座草可單獨(dú)聚為一支，4對(duì)序列在屬水平上的鑒定成功率均為100%。ITS和CD序列聚類圖顯示，27份肉蓯蓉樣品可聚為3類，其中樣品27單獨(dú)為一個(gè)進(jìn)化支，樣品6、11、12、13、14、19、21、22、26、24為一個(gè)進(jìn)化支，其余為一個(gè)進(jìn)化支（見圖3A、圖3B）。matK序列聚類圖顯示，27份肉蓯蓉樣品可聚為4類，其中樣品13單獨(dú)為一個(gè)進(jìn)化支，樣品22、21、24、14為一個(gè)進(jìn)化支，樣品19、1、23、16、20、18、17為一個(gè)進(jìn)化支，其余為一個(gè)進(jìn)化支（見圖3C）。rbcL序列聚類圖顯示，27份肉蓯蓉樣品可聚為4類，其中樣品26、6、2分別為一個(gè)進(jìn)化支，其余為一個(gè)進(jìn)化支（見圖3D）。2組合并序列聚類圖表明，nrDNA合并序列可將大多數(shù)沙蓯蓉、鹽生肉蓯蓉與正品肉蓯蓉區(qū)分開，只有樣品11、12、13未能區(qū)分（見圖3E）；cpDNA合并序列則可將樣品13單獨(dú)聚為一個(gè)進(jìn)化支，其余肉蓯蓉聚為另一個(gè)進(jìn)化支，從而進(jìn)行有效鑒別區(qū)分（見圖3F）。所有構(gòu)建的NJ聚類樹均顯示樣品1、23、21、22（鹽生肉蓯蓉）分別為不同進(jìn)化支，樣品1和23為一個(gè)進(jìn)化支，樣品21和22則為另一個(gè)進(jìn)化支，且蘭州肉蓯蓉始終與肉蓯蓉聚為一支。

圖3 肉蓯蓉樣品基因組序列NJ系統(tǒng)聚類樹

2.3.7 方差分析

將采樣地不同但屬于同種的肉蓯蓉樣品歸為一組，共分為3組，即肉蓯蓉組、鹽生肉蓯蓉組和沙蓯蓉組，采用Arlequin3.5軟件[15]對(duì)nrDNA和cpDNA合并序列進(jìn)行方差分析（見表8），結(jié)果表明，肉蓯蓉遺傳變異主要來自組內(nèi)變異，即同一物種不同種質(zhì)間分化明顯。ITS和CD的合并序列遺傳分化指數(shù)（Fst）為0.206 8，基因流（Nm）為1.01；matK和rbcL的合并序列Fst 為0.230 7，Nm為0.92，說明肉蓯蓉不同種質(zhì)間存在一定基因流動(dòng)，但基因交流不頻繁。

表8 肉蓯蓉樣品基因組序列方差分析

3 討論

以往研究表明，nrDNA ITS序列進(jìn)化速率快，變異信息位點(diǎn)較豐富，被廣泛應(yīng)用于植物的遺傳多樣性分析[16]。而cpDNA序列則可提供豐富的遺傳信息，為評(píng)估物種遺傳多樣性和親緣關(guān)系提供科學(xué)參考[17]。本研 究 利 用4對(duì) 引 物（ITS2-ITS3、CD1F-CD1R、matK3F-matK1R和rbcL1F-rbcL724R）進(jìn)行序列比對(duì)、遺傳距離分析及NJ聚類樹的構(gòu)建，結(jié)果表明，肉蓯蓉種質(zhì)資源多樣性程度較高，且在種質(zhì)間水平上均有豐富的變異性。畢毓芳等[18]研究表明，matK序列是進(jìn)化速率最快的葉綠體基因組序列，常在科級(jí)、屬級(jí)、種間和種內(nèi)水平上被用于系統(tǒng)進(jìn)化研究。馬麗等[19]在對(duì)石榴種質(zhì)資源進(jìn)行基因組序列分析時(shí)發(fā)現(xiàn)石榴物種的matK基因片段擴(kuò)增及測(cè)序成功率高，聚類準(zhǔn)確度較強(qiáng)。董斌等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在matK序列變異位點(diǎn)較多的情況下，遺傳差異也較大，有利于鑒別同一物種的不同種質(zhì)。本研究中，matK序列是4對(duì)序列中變異位點(diǎn)最多的序列，具有481個(gè)變異位點(diǎn)，其中單一突變位點(diǎn)為369個(gè)，所占比例最大，是變異的主要來源。按Grant等[21]提出的標(biāo)準(zhǔn)，單倍型多樣性以0.5為臨界值，核苷酸多樣性以0.005為臨界值，二者值越大，群體的多樣性程度越高。4對(duì)序列中matK序列單倍型多樣性最高，而cpDNA合并序列的單倍型多樣性明顯高于nrDNA合并序列，因此，matK序列更適合作為肉蓯蓉遺傳多樣性分析的序列，也證明了葉綠體基因片段在群體遺傳學(xué)研究中的優(yōu)越性。此外，對(duì)鹽生肉蓯蓉，由于采集樣品地理位置的差異，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)的同種肉蓯蓉也存在地理遺傳差異性，與楊俊譽(yù)等[22]研究結(jié)果一致。

分子鑒定技術(shù)可有效對(duì)中藥材進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別，是對(duì)傳統(tǒng)經(jīng)典鑒定方法的有效補(bǔ)充，彌補(bǔ)了經(jīng)典鑒定方法的不足[23]。近年來，許多學(xué)者為實(shí)現(xiàn)對(duì)物種進(jìn)行快速鑒定，對(duì)適合植物物種鑒定的基因序列進(jìn)行了深入研究，其中主要包括ITS、ITS2、psbA-trnH、matK和rbcL序列[24]。徐素素等[25]認(rèn)為，單獨(dú)類型的序列鑒別存在一定局限性，分子鑒定體系的完善需要多條序列聯(lián)合應(yīng)用。李波等[26]在研究中使用核基因片段與葉綠體片段相結(jié)合的方法，從而達(dá)到提高物種鑒別效率。本研究以nrDNA和cpDNA序列構(gòu)建NJ聚類樹，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)某對(duì)序列并不能在種水平上有較好的鑒別效率。ITS和CD序列聚類圖表明，多數(shù)肉蓯蓉與沙蓯蓉、鹽生肉蓯蓉親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，會(huì)分別聚于不同進(jìn)化支，但也存在小部分肉蓯蓉與其他物種聚為一支的情況；matK和rbcL序列聚類圖表明，沙蓯蓉與鹽生肉蓯蓉親緣關(guān)系較近，可聚為同一大支，而兩物種又會(huì)分別聚為不同小支，但部分肉蓯蓉和鹽生肉蓯蓉存在聚類混亂的情況，不能準(zhǔn)確鑒別。故將nrDNA和cpDNA序列聯(lián)合使用，可進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)對(duì)肉蓯蓉種質(zhì)的快速、準(zhǔn)確鑒別。

蘭州肉蓯蓉在《中國(guó)植物志》中作為單獨(dú)的物種具有一定植物學(xué)分類地位，但近年來也有學(xué)者建議將蘭州肉蓯蓉及沙蓯蓉歸為同個(gè)物種[27]。而陳博等[6]在對(duì)甘肅肉蓯蓉進(jìn)行指標(biāo)性成分含量測(cè)定研究發(fā)現(xiàn)，蘭州肉蓯蓉與沙蓯蓉成分含量存在一定差異，與肉蓯蓉成分含量較為相似。本研究中，通過計(jì)算遺傳距離及構(gòu)建NJ聚類樹，結(jié)果蘭州肉蓯蓉與肉蓯蓉的遺傳距離較近，均可聚為同一個(gè)進(jìn)化支。由此，建議將蘭州肉蓯蓉與其他肉蓯蓉進(jìn)行分類區(qū)別，考慮作為正品肉蓯蓉的藥源補(bǔ)充，提高其資源開發(fā)利用度，后續(xù)可就此問題進(jìn)行深入研究。

近年來，隨著對(duì)肉蓯蓉藥材需求量的提升，為保證臨床安全用藥，對(duì)肉蓯蓉種質(zhì)資源的鑒別、評(píng)價(jià)及保護(hù)至關(guān)重要。本研究基于nrDNA和cpDNA序列，對(duì)甘肅省4種肉蓯蓉進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果表明肉蓯蓉種質(zhì)資源多樣性程度較高，可為進(jìn)一步細(xì)化肉蓯蓉不同種質(zhì)資源的分類提供參考。