李文卉，王建魁，張念章，曲自剛，劉垠鞠，賈萬忠，付寶權(quán)，3

多頭帶絳蟲(Taeniamulticeps)成蟲寄生于犬等動(dòng)物的小腸，多頭帶絳蟲的中絳期幼蟲腦多頭蚴(Coenuruscerebralis)寄生于牛、羊等草食動(dòng)物的大腦，引起一種中樞神經(jīng)性疾?。蝗艘部勺鳛橹虚g宿主誤食多頭帶絳蟲蟲卵偶爾感染，可導(dǎo)致嚴(yán)重的病例狀況[1-5]。該病在世界范圍內(nèi)普遍流行[6-8]，在我國(guó)西北、華北、東北等廣大牧區(qū)最為多見[9]，該病感染動(dòng)物后中晚期治愈率很低，致死率可達(dá)100%，給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，是一種重要的人獸共患寄生蟲病[10-11]。

多頭帶絳蟲是兩宿主的寄生蟲，寄生于犬腸道成蟲長(zhǎng)度可達(dá)100 cm；而甚至有雞蛋大小的幼蟲期腦多頭蚴則是充滿囊液的半透明的包囊。顯然，多頭帶絳蟲的發(fā)育經(jīng)歷了兩種不同的宿主、不同的寄生環(huán)境，而且形態(tài)學(xué)和生理學(xué)是也完全不同，而且每個(gè)發(fā)育階段的生物學(xué)，包括發(fā)育調(diào)節(jié)、營(yíng)養(yǎng)代謝和細(xì)胞周期仍不清楚。同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(isobaric tags for relative and absolute quantification, iTRAQ)技術(shù)主要應(yīng)用于蛋白質(zhì)的鑒定與定量分析，結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜分析，該技術(shù)已成為目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要手段之一。本研究應(yīng)用iTRAQ技術(shù)分析多頭帶絳蟲成蟲及幼蟲發(fā)育階段差異蛋白，并用生物信息學(xué)方法對(duì)差異蛋白進(jìn)行比較分析，從蛋白組學(xué)角度分析與發(fā)育有關(guān)的生物學(xué)過程和分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 多頭帶絳蟲成蟲與幼蟲的收集 從甘肅省景泰屠宰廠收集感染腦多頭蚴的綿羊，開顱腔摘取完整的腦多頭蚴包囊，分離原頭節(jié)液氮保存?zhèn)溆谩Ａ韺⒁陨闲迈r的原頭節(jié)50～80個(gè)飼喂給提前驅(qū)過蟲的2只比格犬，60 d后安樂處死犬，縱向剖腸取完整的多頭帶絳蟲成蟲，清洗干凈后再用PBS洗滌3次，每個(gè)凍存管分裝1條成蟲液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 超聲破碎法多頭帶絳蟲成蟲與幼蟲總蛋白制備和SDS電泳 稱取適量腦多頭蚴原頭節(jié)及多頭帶絳蟲成蟲樣品，用PBS洗脫離心2次后，加入裂解液(1 mmol/L PMSF、2 mmol/L EDTA)，置于冰上5 min后加入終濃度為10 mmol/L DTT，200 W冰浴超聲裂解15 min。25 000×g 離心 20 min，取上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中，56 ℃使用10 mmol/L DTT處理1h，還原打開二硫鍵，接著在暗室使用55 mmol/L IAM 暗室室景置 45 min，進(jìn)行半胱氨酸的烷基化封閉，最后加入1 mL冷凍的丙酮，在-20 ℃放置過夜。次日25 000×g 離心20 min 棄去上清液，沉淀在300 μL 0.5 mol/L TEAB中200W超聲裂解15 min，25 000×g 離心20 min后上清液用于定量。Bradford 法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。每個(gè)樣品上樣量30 μg，蛋白標(biāo)志物上樣量10 μg, 進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

1.3 iTRAQ標(biāo)記 上述1.2制備的總蛋白用胰蛋白酶消化后，用真空離心泵抽干肽段，用0.5 mol/L TEAB復(fù)溶肽段，按照手冊(cè)進(jìn)行iTRAQ標(biāo)記，每一組肽段被不同的iTRAQ 標(biāo)簽標(biāo)記，室溫培養(yǎng)2 h；將標(biāo)記后的各組肽段混合，用SCX 柱進(jìn)行液相分離。

1.4 液相串聯(lián)質(zhì)譜LC-MS/MS分析及生物信息學(xué)分析 采用高分辨力和高精度的AB SCIEXTriple TOP5600 質(zhì)譜儀對(duì)分離后的肽段進(jìn)行LC-MS/MS分析，配合在線微流高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析。采用Mascot2.3.02蛋白質(zhì)鑒定軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜索。并對(duì)差異蛋白進(jìn)行GO 分類注釋及KEGG通路富集分析。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time quantitative PCR, qRT-PCR)驗(yàn)證 TRIzol法提取多頭帶絳蟲成蟲和幼蟲原頭蚴總RNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質(zhì)量。按照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。將篩選的10個(gè)差異明顯的蛋白序列分別匹配到多頭帶絳蟲基因的CDS序列[12]，根據(jù)CDS序列應(yīng)用軟件Primer Premier 6.0 設(shè)計(jì)引物(表1)，選取β-tublin為內(nèi)參基因，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。選取的蛋白進(jìn)行qRT-PCR 驗(yàn)證。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：SYBR Green qPCR Master Mix(2×)10 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL、DNA模板2.0 μL、ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性7 s, 57 ℃退火10 s和延伸15 s，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)反應(yīng)。最后60 ℃～95 ℃制備熔解曲線。

表1 差異表達(dá)蛋白qRT-PCR引物Tab.1 qRT-PCR primers for differentially expressed proteins

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用2-(ΔΔCt)法驗(yàn)證熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 6 軟件分析處理，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD)-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定及SDS-PAGE電泳檢測(cè)：提取的多頭帶絳蟲成蟲和幼蟲蛋白，經(jīng)Bradford 法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度和總蛋白質(zhì)量(表2)，通過SDS-PAGE檢測(cè)蛋白，從圖1可以看出，提取的蛋白質(zhì)條帶清晰，符合下一步質(zhì)譜分析需求。

表2 多頭帶絳蟲成蟲和幼蟲蛋白質(zhì)的濃度Tab.2 Concentrations of proteins from of T.multiceps adults and larvae

注：M:蛋白質(zhì)標(biāo)記物；1—2成蟲； 3—4幼蟲。圖1 多頭帶絳蟲成蟲和幼蟲蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳結(jié)果Fig.1 SDS-PAGE electrophoresis profiles from T. multiceps adults and larvae

2.2 多頭帶絳蟲蛋白質(zhì)鑒定信息的質(zhì)譜分析 從多頭帶絳蟲成蟲和幼蟲共鑒定獲得684個(gè)蛋白質(zhì)，其中蛋白質(zhì)質(zhì)量在20～60 kDa為 472個(gè)，占全部鑒定蛋白的69.00%；蛋白質(zhì)質(zhì)量在60～100 kDa為109個(gè)，占全部鑒定蛋白的15.93%。在相對(duì)定量時(shí)，如果同一蛋白質(zhì)的量在兩個(gè)樣品間沒有顯著的變化，那么其蛋白質(zhì)豐度比接近于1。當(dāng)?shù)鞍椎牟町愗S度比即差差異倍數(shù)達(dá)到1.5倍以上，且經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)LSD-t=-1.15,P<0.05，視該蛋白為不同樣品間的差異蛋白。對(duì)每個(gè)蛋白質(zhì)差異倍數(shù)以2為底取對(duì)數(shù)后作出分布圖如圖2。以此判定存在顯著差異的有130個(gè)蛋白。其中相對(duì)于幼蟲，成蟲期上調(diào)蛋白數(shù)量為69個(gè)，下調(diào)蛋白61個(gè)。上調(diào)蛋白為副肌球蛋白，果糖-1,6-二磷酸酶，亮氨酰肽酶，鈣結(jié)合蛋白，六鉤蚴蛋白Tso22c，熱休克蛋白70，8 kDa糖蛋白，肌球蛋白輕鏈，鈣調(diào)蛋白等；下調(diào)蛋白為抗原cC1，鈣蛋白酶，膜聯(lián)蛋白B3，皮層蛋白，糖脂轉(zhuǎn)移蛋白，微管相關(guān)蛋白，乳酸脫氫酶B，氨基酰化酶，xpa-結(jié)合蛋白等。

注：該圖顯示可定量的所有蛋白質(zhì)的差異倍數(shù)的分布情況，其中橫坐標(biāo)表示差異倍數(shù)經(jīng)過以2為底數(shù)的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化后的值。大于0的為表達(dá)量上調(diào)，小于0的為表達(dá)量下調(diào)。其中差異倍數(shù)大于1.5的點(diǎn)用紅色和綠色標(biāo)出(紅色為表達(dá)量上調(diào)，綠色為表達(dá)量下調(diào))。圖2 蛋白質(zhì)豐度比分布Fig.2 Protein ratio distribution

2.3 生物信息學(xué)分析及功能注釋 對(duì)鑒定出的所有蛋白進(jìn)行GO功能注釋分析，通過protein2go針對(duì)3個(gè)本體：生物進(jìn)程、細(xì)胞組成及分子功能中所涉及到各條目的分布情況，結(jié)果顯示生物進(jìn)程中16.40%的蛋白涉及細(xì)胞過程、13.75%的蛋白參與代謝過程；細(xì)胞組成中參與細(xì)胞和細(xì)胞組分的蛋白各占27.39%，兩者占據(jù)了細(xì)胞組成中總蛋白數(shù)一半以上的比例；特別值得注意的是，分子功能中有一半以上(51.17%)是具有結(jié)合功能的蛋白，其次比例較高的34.27%的蛋白具有催化活性(圖3)。在25個(gè) COG分類中，數(shù)量最多的是通用功能預(yù)測(cè)的蛋白，接下來依次是參與翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、伴侶及翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生的蛋白。將差異表達(dá)的蛋白進(jìn)行代謝路徑注釋，表3 列舉了數(shù)量較多的20個(gè)路徑，其中參與代謝途徑的差異蛋白數(shù)量最多(116，22.01%)。

表3 20個(gè)數(shù)量較多的差異表達(dá)蛋白質(zhì)途徑注釋Tab.3 Top 20 pathway annotations for differentially expressed proteins

2.4 篩選差異蛋白序列做qRT-PCR 將多頭帶成蟲和幼蟲差異蛋白配比到已知多頭帶絳蟲基因組序列上，得到對(duì)應(yīng)的CDS序列，依據(jù)其序列隨機(jī)選取5個(gè)上調(diào)蛋白(CL4425.Contig1/Tmu008054、CL4866.Contig1/Tmu01091、Unigene968/Tmu-000235、CL5675.Contig1/Tmu006666、Unigene5259/Tmu008659)，5個(gè)下調(diào)蛋白(Unigene1651/Tmu002472、Unigene687/Tmu002004、Unigene728/Tmu003244、Unigene1485/Tmu009112、Unigene913/Tmu004362)設(shè)計(jì)qRT-PCR引物(表1)，選擇β-tublin(CL1614.Contig2/Tmu007343)基因作為內(nèi)參基因，以幼蟲為對(duì)照，計(jì)算2-(ΔΔCt)值。結(jié)果表明，相對(duì)于幼蟲期，成蟲期上調(diào)表達(dá)蛋白及下調(diào)表達(dá)蛋白與蛋白組差異表達(dá)分析結(jié)果基本相似(圖4)。

(A)為生物學(xué)進(jìn)程，(B)為細(xì)胞成分，(C)為分子功能圖3 利用基因本體(GO)對(duì)蛋白質(zhì)功能進(jìn)行分類。蛋白質(zhì)分為生物學(xué)、細(xì)胞成分、分子功能3種本體論過程Fig.3 Classification of protein functions by Gene Ontology (GO). Proteins were classified into three ontologies: biological process, cellular component, and molecular function

①P<0.05，②P<0.01，③P<0.001。圖4 qRT-PCR驗(yàn)證多頭帶絳蟲成蟲與幼蟲部分蛋白在基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)Fig.4 qRT-PCR confirmed the expression of a part of proteins in adult/larva T.multiceps at gene transcription level

3 討 論

多頭帶絳蟲的生活史需要經(jīng)歷兩個(gè)宿主，成蟲寄生于犬、狼等終末宿主的小腸，當(dāng)成熟孕節(jié)隨糞便排出體外后，被中間宿主羊吞食，蟲卵在腸道消化液的作用下，六鉤蚴逸出鉆入腸壁血管并隨血流到達(dá)腦和脊髓中，逐漸生長(zhǎng)發(fā)育為腦多頭蚴包囊。當(dāng)犬等吞食了含有腦多頭蚴的大腦后，原頭蚴附著在小腸壁上逐漸發(fā)育，經(jīng)41～73 d發(fā)育為成蟲。眾所周知，腦多頭蚴對(duì)中間宿主神經(jīng)系統(tǒng)大腦具有獨(dú)特的偏好性，顯然決定寄生蟲寄生去向的根本原因是其與宿主蛋白的復(fù)雜調(diào)控作用。Podesta 等[13]認(rèn)為扁型動(dòng)物門寄生蟲蛋白質(zhì)的合成在轉(zhuǎn)錄后受到控制，并且這些細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)機(jī)制被宿主免疫反應(yīng)的效應(yīng)器激活或抑制，顯然這種時(shí)相特異性蛋白對(duì)于寄生蟲適應(yīng)宿主尤為重要。

因寄生蟲在不同發(fā)育階段表達(dá)蟲體蛋白的差異和獨(dú)特的生活史，其對(duì)宿主的選擇性、致病性具有較大差異，將iTRAQ技術(shù)運(yùn)用于寄生蟲蛋白質(zhì)組學(xué)研究，能有效找出不同階段寄生蟲表達(dá)的差異蛋白及感染后宿主表達(dá)的差異蛋白，并能對(duì)其進(jìn)行高精度定量分析，這對(duì)進(jìn)一步探索寄生蟲生活史、研究與宿主的互作機(jī)制提供了技術(shù)支撐，同時(shí)對(duì)寄生蟲病的快速診斷及治療，尋找新的藥物靶點(diǎn)等具有重要意義[14]。

前期我們研究小組通過雙相電泳結(jié)合質(zhì)譜分析初步鑒定了腦多頭蚴原頭節(jié)蛋白，鑒定的蛋白有抗氧化蛋白(蘋果酸脫氫酶和烯醇化酶)、分子伴侶蛋白(熱休克蛋白60和小熱休克蛋白)以及一些結(jié)構(gòu)蛋白(肌動(dòng)蛋白、肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)蛋白和副肌球蛋白)，這些蛋白參與催化、結(jié)合、代謝、分子進(jìn)程及應(yīng)急反應(yīng)[15]。本研究通過iTRAQ 技術(shù)比較分析了多頭帶絳蟲和幼蟲差異表達(dá)蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對(duì)于幼蟲期，成蟲期69個(gè)上調(diào)表達(dá)的蛋白中，有35個(gè)六鉤蚴蛋白Tso22c肽段，24個(gè)熱休克蛋白60(Hsp60)肽段，20個(gè)副肌球蛋白肽段，12個(gè)8 kDa糖蛋白肽段，3個(gè)熱休克蛋白70(Hsp70)肽段，以上結(jié)果可以看出Hsp60、副肌球蛋白、Hsp70在成蟲期表達(dá)是富集的，且表達(dá)量是上調(diào)的，研究證實(shí)寄生蟲可通過產(chǎn)生Hsp70來減少溫度改變和氧化應(yīng)激等反應(yīng)對(duì)其造成的損傷，從而適應(yīng)新的寄生環(huán)境[16]，另外，最新研究發(fā)現(xiàn)副肌球蛋白可作為犬盤尾絲蟲病血清診斷的候選生物標(biāo)志物[17]。而相對(duì)于幼蟲，61個(gè)成蟲期下調(diào)表達(dá)的蛋白中鈣蛋白酶的肽段數(shù)為20 個(gè)，抗原cC1和Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶質(zhì)膜各自分別鑒定出12個(gè)肽段。因?yàn)榧纳诮K末宿主腸道中的成蟲，不僅需要適應(yīng)復(fù)雜的腸道環(huán)境，還要快速生長(zhǎng)發(fā)育，鈣依賴性的蛋白酶是一類在多種生物體內(nèi)廣泛表達(dá)的蛋白酶，且與多種生理功能和病理過程如局部腦缺血和神經(jīng)退行性疾病等相關(guān)。研究表明鈣蛋白酶在棘球絳蟲侵襲、遷移及免疫逃避中發(fā)揮重要作用，可能將是抗棘球蚴病藥物和疫苗研究的理想靶標(biāo)分子[18]。因此，我們推測(cè)以上差異表達(dá)蛋白可能在多頭帶絳蟲具有相似的功能。

值得注意的是，本研究中鑒定的多頭帶絳蟲路徑注釋的差異蛋白中總計(jì)約30%的蛋白參與代謝途徑和次生代謝物的生物合成，我們發(fā)現(xiàn)差異蛋白注釋路徑與一些神經(jīng)系統(tǒng)退行性或神經(jīng)功能障礙的疾病如阿爾茨海默病、亨丁頓舞蹈癥、帕金森病有關(guān)，不同的是腦多頭蚴病是由感染寄生蟲引起的一種神經(jīng)系統(tǒng)寄生蟲病，盡管目前的研究無法解釋多頭帶絳蟲寄生偏好性，但是當(dāng)前的研究無疑對(duì)多頭帶絳蟲不同階段生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)鍵蛋白的探索提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和思路。

利益沖突：無