單 萍 張繼龍 笱玉蘭 羅利俊

(湖北省武漢市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，武漢，430022)

癲癇是一種全球范圍內(nèi)常見的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1]，它影響了世界所有地區(qū)的各個年齡階段的人類健康。任何引起大腦生理結(jié)構(gòu)或功能紊亂的因素都能導致癲癇，且可發(fā)生于人的任何階段[2]。癲癇以自發(fā)性發(fā)作為特征[3]，其發(fā)作是一種涉及部分或整個身體的短暫不自覺顫抖，有時伴有意識喪失，且癲癇發(fā)作的強度和頻率都有差異[4]。研究發(fā)現(xiàn)，目前抗癲癇藥物已無法控制20%～30%具有藥物抵抗性的難治性癲癇發(fā)病[5]。因此，尋找具有較好療效且不良反應少的抗癲癇藥尤為重要，而中醫(yī)學可成為抗癲癇藥物的替代品[4]。據(jù)相關(guān)報道，星形膠質(zhì)細胞可通過控制細胞外空間體積以及離子和神經(jīng)遞質(zhì)穩(wěn)態(tài)來調(diào)節(jié)突觸的活動，當其出現(xiàn)功能障礙時，可導致神經(jīng)功能發(fā)生重大改變，從而參與了癲癇的發(fā)病機制[6-7]。柴胡龍骨牡蠣湯出自《傷寒論》，具有較好的抗癲癇作用，且與柴胡龍骨牡蠣湯的劑量正相關(guān)[8-9]。課題組前期研究結(jié)果顯示：柴胡加龍骨牡蠣湯對戊四氮(Pentylenetetrazol，PTZ)點燃癲癇小鼠的大腦神經(jīng)元具有保護作用[10]，但柴胡龍骨牡蠣湯治療癲癇的具體作用機制并未闡明。因此，本研究將使用PTZ刺激小鼠海馬星形膠質(zhì)細胞，用不同劑量的柴胡龍骨牡蠣湯處理后，檢測細胞內(nèi)相關(guān)炎癥介質(zhì)的表達情況，初步探討柴胡龍骨牡蠣湯治療癲癇的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取60只孕20 d的清潔級小鼠，購自湖北省疾病預防控制中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂)2015-0018，動物實驗倫理審批號：HLK-20181118-02。飼養(yǎng)溫度為22～26 ℃，相對濕度為50%～60%，人工光照明暗各12 h，自由飲水、飲食。

1.1.2 藥物 柴胡龍骨牡蠣湯(柴胡12 g，龍骨、黃芩、生姜、鉛丹、人參、桂枝、茯苓、牡蠣各4.5 g，半夏、大黃各6 g，大棗6枚)由我院中藥制劑中心釆用水煮醇提法制備，提取濃縮成含生藥為1 g/mL的柴胡加龍骨牡蠣湯，置于冰箱中備用。

1.1.3 材料與儀器 PTZ(美國Sigma公司，美國，貨號：P6500-25G)；杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s Modified Eagle Medium，DMEM)(美國Hyclone公司，美國，貨號：SH30022.01B)；胎牛血清(美國Gibco公司，美國，貨號：10270-106)；0.25%胰蛋白酶、抗熒光衰減封片劑(含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)、小鼠前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)酶聯(lián)免疫吸附試驗分析試劑盒和小鼠環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒(中國Bioswamp公司，貨號：PAB180002、PAB180018、MU30391、MU30589)；小鼠抗膠質(zhì)細胞原纖維酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein，GFAP)單克隆抗體、兔抗COX-2多克隆抗體和兔抗PGE2受體(Prostaglandin E Receptor 2，PTGER2)(英國Abcam公司，英國，貨號：ab10062、ab52237、ab167171)；兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase，GAPDH)單克隆抗體(美國CST公司，美國，貨號：2118)；聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride，PVDF)膜和化學發(fā)光試劑(美國Millipore公司，美國，貨號：IPVH00010、WBKLS0010)。超凈工作臺(蘇州金凈凈化設備公司，型號：SW-CJ-2D)；顯微鏡(日本Nikon公司，型號：TS100-F)；熒光顯微鏡(日本Olympus公司，日本，型號：AX53)；酶標儀(芬蘭雷勃公司，芬蘭，型號：MK3)；全自動化學發(fā)光分析儀(上海天能科技有限公司，型號：Tanon-5200)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠海馬星形膠質(zhì)細胞分離及培養(yǎng) 取孕20 d的清潔級小鼠，處死后取出胎鼠，乙醇消毒后取出海馬組織于含DMEM的離心管中。將組織剪成1 mm3的組織塊，0.25%胰蛋白酶消化后，加入含10%胎牛血清的DMEM終止消化，175× g，離心5 min，棄上清，并用DMEM重懸細胞。使用200目孔徑的不銹鋼網(wǎng)除去未消化組織，收集細胞于含10%胎牛血清的DMEM中，培養(yǎng)90 min后采用差速貼壁分離技術(shù)去除成纖維細胞。調(diào)整細胞密度為5×105個/mL，接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后換液，以后隔3 d換1次。待細胞融合達70%～80%時，進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 星形膠質(zhì)細胞鑒定 將單細胞懸液接種于放置有細胞爬片的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)過夜。取出培養(yǎng)皿，磷酸鹽緩沖液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)清洗后加入4%多聚甲醛固定30 min。加入0.5% Triton X-100室溫通透20 min，再加入5%牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)封閉1 h。加入一抗稀釋液(GFAP稀釋比1∶100)，4 ℃孵育過夜，PBS清洗后加入二抗稀釋液，室溫孵育1 h后，PBS清洗。取一塊干凈的載玻片，滴一滴抗熒光衰減封片劑(含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)。用鑷子取出蓋玻片，吸去多余的液體，細胞朝下，貼在載玻片上，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 分組及處理 將鑒定成功的海馬星形膠質(zhì)細胞以5×105個/mL的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)48 h后，采用無血清DMEM培養(yǎng)24 h。將細胞分為4組：對照組、PTZ組、PTZ+柴胡龍骨牡蠣湯低劑量組和PTZ+柴胡龍骨牡蠣湯高劑量組。PTZ組采用10 mmol/L的PTZ刺激細胞2 h。PTZ+柴胡龍骨牡蠣湯低劑量組和PTZ+柴胡龍骨牡蠣湯高劑量組細胞在10 mmol/L PTZ刺激2 h后，分別采用10 mg/L和20 mg/L的柴胡龍骨牡蠣湯預處理細胞6 h，再用10 mmol/L PTZ刺激2 h。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測COX-2/PGE2水平 根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒說明進行，測定標準品和各組細胞培養(yǎng)液上清于450 nm處的光密度(Optical Density，OD)值，繪制標準曲線得到直線回歸方程式后計算各組細胞培養(yǎng)液中COX-2和PGE2濃度，每組設置3個復孔。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測細胞內(nèi)COX-2/PGE2表達水平 采用放射免疫沉淀試驗(Radio Immunoprecipitation Assay，RIPA)裂解試劑盒(材料部分未提及)提取各組細胞總蛋白，蛋白定量后取20 μg上樣，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白。濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，脫脂奶粉室溫封閉2 h。加入一抗稀釋液(COX-2稀釋比：1∶1 000；PTGER2稀釋比：1∶5 000；GAPDH稀釋比：1∶1 000)，室溫孵育1 h。清洗后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG，室溫孵育1 h后清洗。將膜置于暗室中，加入化學發(fā)光試劑，于全自動化學發(fā)光分析儀中檢測。

2 結(jié)果

2.1 小鼠海馬星形膠質(zhì)細胞形態(tài)觀察及鑒定 分離培養(yǎng)的小鼠原代海馬星形膠質(zhì)細胞貼壁生長，大部分細胞胞突外伸，且長短不一。見圖1A。免疫熒光染色顯示，細胞呈GFAP陽性表達，鑒定細胞為星形膠質(zhì)細胞。見圖1B。

圖1 海馬星形膠質(zhì)細胞形態(tài)觀察(×100)

2.2 柴胡龍骨牡蠣湯對COX-2和PGE2的影響 與對照組比較，PTZ組海馬星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液上清中的COX-2和PGE2濃度顯著升高(P<0.01)；與PTZ組比較，PTZ+柴胡龍骨牡蠣湯低劑量組、PTZ+柴胡龍骨牡蠣湯高劑量組海馬星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液上清中的COX-2和PGE2濃度均呈現(xiàn)顯著降低(P<0.01)，且PTZ+柴胡龍骨牡蠣湯高劑量組更明顯(P<0.01)，有劑量依賴性。見表1。

表1 各組海馬星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液上清中COX-2和PGE2濃度比較

與對照組比較，PTZ組海馬星形膠質(zhì)細胞COX-2/PTGER2蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)。而經(jīng)過柴胡龍骨牡蠣湯干預后，顯著抑制了PTZ組海馬星形膠質(zhì)細胞內(nèi)COX-2/PTGER2的蛋白表達水平(P<0.01)，且有一定的劑量依賴性，PTZ+柴胡龍骨牡蠣湯高劑量組效果更明顯(P<0.01)。見表2。

表2 各組海馬星形膠質(zhì)細胞COX-2和PTGER2蛋白表達水平比較

3 討論

由于長期服用西藥抗癲癇，產(chǎn)生多種不良反應，導致部分患者不能耐受，使得中藥治療癲癇受到了醫(yī)學界越來越多的關(guān)注[11]。大量研究顯示中醫(yī)藥在抗癲癇方面具有獨特的優(yōu)勢[12-15]。柴胡加龍骨牡蠣湯可協(xié)調(diào)陰陽、祛痰調(diào)氣、定志攝神，令癇癥不作[9]。研究顯示，柴胡龍骨牡蠣湯具有多系統(tǒng)、多成分、多靶點的特點，有較好的抗癲癇療效[16-17]。柴胡龍骨牡蠣湯治療癲癇作用機制的研究報道較少，因此，本研究對其抗癲癇機制進行了初步探討。

癲癇發(fā)作后會發(fā)生星形膠質(zhì)細胞的激活，而激活后的星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生和釋放神經(jīng)遞質(zhì)、炎癥介質(zhì)等，對神經(jīng)元具有毒性作用，進而在癲癇、帕金森病、缺血性腦損傷等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過程發(fā)揮重要的促進作用[18]。因此，星形膠質(zhì)細胞的活化可作為癲癇的病理標志，可能成為藥物治療癲癇的新靶點[19]。前期研究發(fā)現(xiàn)，PTZ可誘導小鼠海馬星形膠質(zhì)細胞的活化，本研究在PTZ誘導活化星形膠質(zhì)細胞的基礎上，進一步檢測了星形膠質(zhì)細胞炎癥介質(zhì)COX-2/PGE2的表達。

COX-2是炎癥反應激活指標，在癲癇發(fā)作過程中，COX-2表達上調(diào)，其過度表達通常與急性條件下的神經(jīng)毒性和組織損傷有關(guān)[20-21]。COX-2激活后可促進癲癇活動誘導的神經(jīng)元損傷死亡，降低癲癇發(fā)作的閾值，進而促進癲癇的反復發(fā)作，而阻斷COX-2的信號級聯(lián)后可提高抗癲癇藥物的腦滲透能力并克服耐藥性[22-23]。前期實驗結(jié)果顯示COX-2與難治性癲癇有密切的關(guān)系，干預COX-2炎癥反應通路可能成為治療難治性癲癇的治療方向[24]。組織受損誘發(fā)炎癥反應，導致大量花生四烯酸釋放，而COX可將花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素[25]。PGE2作為COX-2炎癥反應通路中一種重要的炎癥效應物，在多種慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病(包括癲癇)中，通過其受體亞型EP2(前列腺素類激素受體)介導大腦炎癥和組織損傷[21]。Zhu等[25]研究發(fā)現(xiàn)，COX-2/PGE2信號通路介導的神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元損傷是PTZ點燃癲癇小鼠認知功能障礙的原因之一，認為在癲癇患者的大腦中靶向COX-2/PGE2信號通路可能會產(chǎn)生減輕神經(jīng)元損傷和預防認知功能障礙的效果。本研究結(jié)果顯示，PTZ誘導的星形膠質(zhì)細胞內(nèi)COX-2/PGE2通路表達顯著升高，經(jīng)過不同劑量的柴胡龍骨牡蠣湯治療后，COX-2、PGE2表達下調(diào)，柴胡龍骨牡蠣湯高劑量效果更明顯，提示柴胡龍骨牡蠣湯可有效抑制星形膠質(zhì)細胞內(nèi)COX-2/PGE2信號通路的表達水平。

綜上所述，柴胡龍骨牡蠣湯可下調(diào)PTZ誘導的星形膠質(zhì)細胞COX-2/PGE2信號通路的表達，該作用可能參與了柴胡龍骨牡蠣湯治療癲癇的作用機制。