張 靜，范葶莉，穆春雨

（滄州職業(yè)技術(shù)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系，河北 滄州 061000）

近年來，由于抗微生物藥物的廣泛及不合理應(yīng)用，大量細(xì)菌產(chǎn)生了耐藥性，這導(dǎo)致藥物臨床療效的降低，甚至無(wú)效，感染畜禽的發(fā)病率和死亡率明顯升高。中藥是我國(guó)的天然資源，具有資源廣、毒副作用低等特點(diǎn)，因此，在中藥中篩選耐藥抑制劑具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值和良好的開發(fā)前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 豬源大腸桿菌耐藥菌 A-3，由本研究室分離鑒定并保存；標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌質(zhì)控菌ATCC 25922，購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所。

1.1.2 藥品 鹽酸環(huán)丙沙星，含量為 98.1 %，批號(hào) 211101；中藥材：五倍子、胡椒、細(xì)辛、山楂、金銀花、牡丹皮等30味中藥材。

1.1.3 培養(yǎng)基及試劑 培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基，批號(hào) 100311；麥糠凱瓊脂培養(yǎng)基，批號(hào) 100414；試劑：95 % 乙醇，TTC。

1.1.4 儀器設(shè)備 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司；YXQ-LS-50SⅡ型高壓蒸汽滅菌鍋；ZD-85型氣浴恒溫振蕩器：金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國(guó) Heidolph；微量移液器：德國(guó)eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 藥品儲(chǔ)備液的制備 鹽酸環(huán)丙沙星儲(chǔ)備液：鹽酸環(huán)丙沙星用滅菌水配成 5 120 μg/ml，經(jīng)過濾除菌后，保存于 4 ℃ 冰箱備用。中藥儲(chǔ)備液：30味中藥分別用乙醇回流2次，濾液合并、減壓濃縮、離心后定容至生藥濃度為 1 g/ml，此為醇提液，剩余藥渣再水煎 2次，合并 2次煎液，濃縮離心定容至生藥濃度為 1 g/ml，此為水煎劑。均過濾除菌后保存于4 ℃ 冰箱備用。

1.2.2 鹽酸環(huán)丙沙星及中藥提取物最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定 MIC測(cè)定具體方法：采用試管 2倍稀釋法進(jìn)行，將培養(yǎng)過夜的大腸桿菌 A-3菌鹽酸環(huán)丙沙星 MI液用肉湯做 500~1 000倍稀釋，校正菌液濁度至 0.5麥?zhǔn)蠁挝唬瑯?biāo)準(zhǔn)鹽酸環(huán)丙沙星儲(chǔ)備藥液做5倍稀釋后再將藥液倍比稀釋9個(gè)梯度，濃度依次為 512、256、128、64、32、16、8、4、2 μg/ml，每管依次用微量移液器加入稀釋后的菌液 100 μl，每組設(shè)陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組以及空白對(duì)照，加液完畢后，充分震蕩混勻，于 37 ℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng) 16~18 h。藥品作雙樣品測(cè)定，記錄無(wú)菌生長(zhǎng)的最低濃度為鹽酸環(huán)丙沙星MIC。

中藥提取物MIC測(cè)定具體操作方法參照鹽酸環(huán)丙沙星。若因中藥提取液顏色太深或是中藥與營(yíng)養(yǎng)肉湯發(fā)生反應(yīng)而出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象影響 MIC讀取，應(yīng)采用滴加TTC或平板劃線培養(yǎng)再做觀察。

1.2.3 中藥耐藥抑制劑的篩選 選取無(wú)抑菌效果的中藥提取物，直接等體積加入已經(jīng)倍比稀釋 5個(gè)梯度的鹽酸環(huán)丙沙星中，并設(shè)置對(duì)照。加液完畢后，充分震蕩混勻，于培養(yǎng)箱 37 ℃ 培養(yǎng) 16~18 h。每種藥物作雙樣品測(cè)定，記錄無(wú)菌生長(zhǎng)的最低濃度，觀察加入中藥提取物以后，鹽酸環(huán)丙沙星的最小抑菌濃度是否會(huì)發(fā)生變化。取剩余有抑菌作用的中藥提取物，用營(yíng)養(yǎng)肉湯稀釋至亞抑菌濃度后，等體積加入到已經(jīng)倍比稀釋 5個(gè)梯度的鹽酸環(huán)丙沙星中，并設(shè)置對(duì)照。加液完畢后，充分震蕩混勻，于培養(yǎng)箱 37 ℃ 培養(yǎng) 16~18 h。每種藥物作雙樣品測(cè)定，記錄無(wú)菌生長(zhǎng)的最低濃度，觀察加入中藥提取物以后，鹽酸環(huán)丙沙星的最小抑菌濃度是否會(huì)發(fā)生變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽酸環(huán)丙沙星及中藥提取物抑菌效果

鹽酸環(huán)丙沙星對(duì)大腸桿菌 ATCC25922的MIC 為 2 μg/ml，對(duì)臨床分離大腸桿菌 A-3的MIC為 512 μg/ml，即 A-3對(duì)乳酸環(huán)丙沙星表現(xiàn)出了高水平耐藥。

從30味60種中藥的水煎劑與醇提液中篩選出對(duì)大腸埃希菌有抑菌作用的有牡丹皮醇提與水煎劑、山楂醇提液與水煎劑、金銀花醇提液與水煎劑等 45種中藥提取物（見表 1）。本試驗(yàn)所選中藥中，以胡椒和山楂醇提液抑菌活性最強(qiáng)，其MIC為 31.25 mg/ml，而山楂水煎劑也表現(xiàn)出良好的抑菌作用，其MIC為62.5 mg/ml。

表1 單味中藥提取物對(duì)耐藥菌株A-3和質(zhì)控均株ATCC25922 MIC （mg/ml）

部分中藥提取物的水煎劑和醇提液的抑菌效果不同，其中淫羊藿、夏枯草的水煎劑具有抑菌作用而醇提液無(wú)抑菌作用；茵陳、馬鞭草等 3味中藥的醇提液具有抑菌效果而水煎劑無(wú)抑菌作用，但抑菌范圍均在250~500 mg/ml范圍內(nèi)。

所選 60種中藥提取物中，臨床分離多重耐藥大腸桿菌 A-3對(duì)蒼耳子水煎劑、天仙子醇提液與水煎劑、藿香水煎劑、桑白皮醇提液 4種中藥提取物產(chǎn)生了耐藥性，其中以蒼耳子水煎劑最為嚴(yán)重，其對(duì)質(zhì)控大腸埃希菌MIC為7.8125 mg/ml而對(duì)耐藥菌MIC為250 mg/ml。臨床分離菌對(duì)其他中藥提取物并未產(chǎn)生耐藥，MIC基本一致。

2.2 中藥提取物聯(lián)合鹽酸環(huán)丙沙星抑菌效果

本試驗(yàn)采用中藥提取物與鹽酸環(huán)丙沙星聯(lián)合應(yīng)用，通過觀察鹽酸環(huán)丙沙星對(duì)高水平耐藥菌株大腸桿菌 A-3的 MIC是否存在影響來判斷該中藥提取物對(duì)大腸桿菌的耐藥性是否存在抑制作用，其中地黃等 42種中藥取物與鹽酸環(huán)丙沙星聯(lián)用后，鹽酸環(huán)丙沙星對(duì)耐藥大腸桿菌 A-3 MIC大于 512 μg/ml，表現(xiàn)為拮抗作用；桑白皮等 16種中藥提取物與鹽酸環(huán)丙沙星聯(lián)用后，鹽酸環(huán)丙沙星對(duì)耐藥大腸桿菌A-3MIC等于512 μg/ml；而細(xì)辛中藥提取物與鹽酸環(huán)丙沙星聯(lián)用，可使其MIC下降8倍，表現(xiàn)出良好的耐藥抑制作用（見表 2）。

表2 添加細(xì)辛提取物后鹽酸環(huán)丙沙星對(duì)耐藥菌株A-3 MIC變化 （μg/ml）

3 討論

3.1 中藥有效成分提取

就傳統(tǒng)中藥提取工藝而言，中藥有效成分的提取包括水提法和醇提法：其中熱水浸提法即煎煮法，為中藥有效成分提取最常用的方法之一；乙醇提取法適用于含雜質(zhì)較多的藥材，乙醇提取法又分為滲漉法和回流法。而現(xiàn)代提取分離技術(shù)包括膜分離技術(shù)、超臨界流體萃取法、超微粉碎技術(shù)、分子蒸餾法、超聲提取法等。本試驗(yàn)采用傳統(tǒng)中藥提取法聯(lián)合應(yīng)用，首先采用醇提法，在此基礎(chǔ)上再采用水煎法，每一味中藥材經(jīng)過 2種處理方法均得到 2種中藥有效成分提取液，最大限度的保證了藥品成分不丟失。

3.2 中藥對(duì)大腸桿菌的抑菌作用

研究證實(shí)單味中藥及一些復(fù)方中藥在抗菌方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。抗菌中藥有著廣泛的篩選范圍，如清熱解毒藥、瀉下藥、補(bǔ)虛藥、理血藥等。2020年，向雙云等檢測(cè)了黃芩、五味子、黃柏等 8種中草藥對(duì)大腸桿菌的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中黃連、魚腥草、五味子和艾草 4種中藥對(duì)大腸桿菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的的抑菌效果[1]。2021年，胡安古麗·努爾別克等試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，駱駝蓬子、沒食子對(duì)犢牛腹瀉致病菌有較好的抑菌作用[2]。本試驗(yàn)選取的30味常見中藥中有45種中藥提取物對(duì)臨床分離耐藥大腸桿菌存在抑菌作用，除蒼耳子水煎劑、桑白皮醇提液、天仙子醇提液與水煎劑、藿香水煎劑 4種中藥提取物產(chǎn)生了耐藥性外，耐藥大腸桿菌對(duì)其余中藥提取物均不存在耐藥性，表明應(yīng)用中藥提取物發(fā)揮抑菌作用存在很大優(yōu)勢(shì)。

3.3 中藥逆轉(zhuǎn)大腸桿菌耐藥

由于抗微生物藥物的廣泛應(yīng)用甚至濫用，臨床分離大腸桿菌對(duì)多種抗微生物藥物均產(chǎn)生了耐藥，本研究室通過對(duì) 2021年滄州地區(qū)臨床分離大腸桿菌的敏感性試驗(yàn)，其中對(duì)恩諾沙星、環(huán)丙沙星的耐藥率分別為 79.45 %、70.09 %。為解決細(xì)菌耐藥性帶來的影響，2015年，司紅彬等人通過白頭翁水提取物與抗菌藥聯(lián)合抗含耐磷霉素基因型和超廣譜 β-內(nèi)酰胺酶型大腸埃希菌體外研究，表明白頭翁水提取物與 13種抗菌藥聯(lián)合使用，可增強(qiáng)抗菌藥抗菌活性，降低抗菌藥MIC[3]。2018年，王莉貞等研究發(fā)現(xiàn)倒扣草水煮液與部分抗菌藥聯(lián)用可降低抗菌藥對(duì)多重耐藥大腸桿菌的最小抑菌濃度[4]。2020年，劉超怡等人探究了艾葉對(duì)大腸桿菌的耐藥消除作用，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)艾葉提取物在一定程度上能夠消除禽源大腸桿菌的耐藥性[5]。

本試驗(yàn)通過對(duì)臨床常見 30味中藥材的水煎劑與醇提液與環(huán)丙沙星聯(lián)合試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，細(xì)辛具有耐藥抑制作用，細(xì)辛提取物在很大程度上可能是一種天然的外排泵抑制劑，而具體是哪一種成分有效還需進(jìn)一步分離驗(yàn)證；除此，存在地黃等42種中藥取物其與鹽酸環(huán)丙沙星聯(lián)用后，鹽酸環(huán)丙沙星對(duì)耐藥大腸桿菌 A-3的 MIC大于512 μg/ml，表現(xiàn)為拮抗作用，這說明，盡管目前中西藥結(jié)合抑菌是國(guó)內(nèi)研究的一個(gè)熱點(diǎn)，但是多數(shù)中藥材與喹諾酮類藥物聯(lián)用，表現(xiàn)為拮抗作用，臨床應(yīng)慎用，而其具體拮抗機(jī)制有待研究。