汪香君，劉墨祎，李迎，汪洺卉，范馨元，王添琦，劉麗梅

(北華大學(xué) 醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 吉林，132013)

五加科人參屬植物人參(Panaxginseng)、三七(Panaxnotoginseng)和西洋參(Panaxquinquefoliusm)是我國常用的珍貴中藥材。受環(huán)境影響，三者的植物形態(tài)和化學(xué)成分具有一定的相似性，但藥效存在很大差異，單純依靠傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)和化學(xué)分析法鑒定植物品種不夠精確，尤其是無法對參片及參粉等參類產(chǎn)品進(jìn)行鑒定。

人參、三七和西洋參為近源物種，三者在基因上差異較小，這導(dǎo)致快速鑒定方法的開發(fā)較為困難。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，DNA分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用使得藥用植物的鑒定更為準(zhǔn)確和便捷。第三代分子標(biāo)記物單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，因其分布廣，密度高，遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)，易于自動化等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于藏菖蒲、枇杷、化橘紅和紫蘇等藥用植物的鑒定中[1-4]。

SNP的檢測方法有單鏈構(gòu)象多態(tài)性、溫度梯度凝膠電泳、變性高效液相色譜、衍生酶切擴(kuò)增多態(tài)性、TaqMan探針技術(shù)、基因芯片和等位基因特異性PCR(allele-specific PCR, AS-PCR)等。其中AS-PCR應(yīng)用最廣，具有成本低，操作簡單，便捷，快速等優(yōu)點，但是其不足在于特異性不強(qiáng)。本研究通過對SNP位點進(jìn)行鎖核酸(locked nucleic acid，LNA)修飾和引入錯配堿基2種方式使3′末端實現(xiàn)封閉，增強(qiáng)引物特異性。建立人參、三七和西洋參的多重PCR檢測體系，并考察其在市售參類產(chǎn)品中的檢測情況。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試人參、西洋參及三七樣品由國家參茸檢驗檢測中心和吉林省益盛漢參生物科技有限公司提供，儲存于-80 ℃冰箱保持樣品新鮮(表1)。常見9種市售參類產(chǎn)品：生曬參片、紅參切片、西洋參切片、三七粉、人參丸、高麗參茶、人參蜜片、紅參藥片、西洋參膠囊(圖1)。20份粗加工參類產(chǎn)品：生曬參片(5份)、紅參切片(5份)、西洋參切片(5份)、三七粉(5份)購自當(dāng)?shù)丶熬€上銷售處。

表1 樣品名稱及產(chǎn)地表Table 1 Name and producing area of samples

1-生曬參片；2-人參丸；3-高麗參茶；4-人參蜜片；5-紅參切片；6-紅參藥片；7-西洋參切片；8-西洋參膠囊；9-三七粉圖1 市售樣品Fig.1 Commercially available samples

植物DNA提取試劑盒，北京BioTeke公司；rTaq DNA聚合酶，TaKaRa TaqTM Version 2.0；PrimeSTAR HS、DL2000，大連TaKaRa公司；6×DNA Loading Buffer，天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

H-2050R低溫高速離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；ETC811型基因擴(kuò)增儀，蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司；凝膠成像分析儀，德國耶拿公司；DNA/蛋白質(zhì)分析儀，Quawell。

1.3 實驗方法

1.3.1 特異性引物設(shè)計

本研究利用DNAMAN對比了NCBI中現(xiàn)有的人參屬植物基因序列，發(fā)現(xiàn)人參的18S rRNA序列(以KC593823.1為參照)在496、498和500位堿基處有3個SNP位點，人參為G、T、C，三七為C、A、G，西洋參為C、G、G。三七的rcbL序列(以GQ436707.1為參照)第212位堿基為C，而人參和西洋參為T。西洋參的psbE-petL序列(以JN700483.1為參照)第461位堿基為C，而人參和三七為T。以此為基礎(chǔ)利用Primer3設(shè)計特異性引物，使正向引物3′端位于SNP位點上并用LNA進(jìn)行修飾，在3′末端第二或第三堿基處引入錯配以確保3′末端實現(xiàn)完全封閉，引物序列見表2。

表2 人參、三七、西洋參特異性鑒別引物Table 2 Specific identification primers for Panax ginseng, Panax notoginseng， and Panax quinquefolium

1.3.2 DNA提取

本研究應(yīng)用改良的CTAB法提取人參、三七和西洋參的DNA[5]，用微量核酸蛋白質(zhì)檢測儀檢測DNA的純度及濃度。將質(zhì)量濃度調(diào)整到10 ng/μL用于PCR擴(kuò)增。

1.3.3 PCR擴(kuò)增及電泳

20 μL PCR反應(yīng)體系為：4 μL 10 ng/μL模板DNA，10 μL rTaq DNA聚合酶，人參上下游引物(10 μmol/L)各0.15 μL，三七上下游引物(10 μmol/L)各1.25 μL，西洋參上下游引物(10 μmol/L)各0.3 μL，2.6 μL去離子水，反應(yīng)在基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s；59 ℃退火30 s；72 ℃延伸20 s，35次循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物加入Loading buffer后經(jīng)EB預(yù)染的20 g/L(質(zhì)量濃度)的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。

1.3.4 熒光定量PCR

20 μL PCR反應(yīng)體系為：4 μL 10 ng/μL模板DNA，10 μL PrimeSTAR HS，人參上下游引物(10 μmol/L)各0.15 μL，三七上下游引物(10 μmol/L)各1.25 μL，西洋參上下游引物(10 μmol/L)各0.3 μL，2.6 μL去離子水。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s；59 ℃退火20 s；72 ℃延伸20 s，35次循環(huán)；每個循環(huán)在72 ℃收集熒光信號，每個反應(yīng)設(shè)3個復(fù)孔。

1.3.5 方法學(xué)評價

1.3.5.1 多重PCR反應(yīng)條件評價

溫馨提示：因為白薯的淀粉含量高，換算成米飯的時候就不能按照4∶1了，要按3∶1才對，所以說當(dāng)你吃3份白薯的時候，你當(dāng)天吃的米飯的量就得減少1份了。

分析影響多重PCR效果的關(guān)鍵因素，包括退火溫度、循環(huán)數(shù)、DNA含量和引物含量。

1.3.5.2 多重PCR反應(yīng)體系靈敏性評價

使用ddH2O將人參、三七和西洋參的DNA濃度梯度稀釋為10～10-4ng/μL。按照1.3.3中多重PCR反應(yīng)體系，保持其中兩種模板濃度不變，使剩余一種模板濃度梯度遞減進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.3.6 混合樣品檢測

將人參，三七，西洋參標(biāo)準(zhǔn)品按照一定比例均勻混合，總共分成7組，Ⅰ組是3個樣品混合，人參、三七、西洋參質(zhì)量比為1∶1∶1，6∶3∶1和6∶1∶3。Ⅱ～Ⅶ組為兩兩混合，分別是人參中混入三七，人參中混入西洋參；西洋參中混入三七，西洋參中混入人參，三七中混入人參，三七中混入西洋參，其質(zhì)量比分別為1∶1，4∶1和9∶1?；旌虾玫臉悠酚酶牧嫉腃TAB法提取DNA，PCR擴(kuò)增后用20 g/L(質(zhì)量濃度)的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。

1.3.7 市售樣品檢測

用改良的CTAB和試劑盒法提取市售9份人參制品的基因組，將濃度稀釋至10 ng/μL，按照1.3.3中多重PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增后用20 g/L(質(zhì)量濃度)的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。

2 結(jié)果與分析

2.1 多重PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

用特異性引物對人參、三七、西洋參進(jìn)行擴(kuò)增，在55～60 ℃時分別能擴(kuò)增出249、366、212 bp的特異性條帶，以此為基礎(chǔ)對影響多重PCR特異性和靈敏性的因素進(jìn)行摸索。結(jié)果表明退火溫度在58～60 ℃時人參、三七、西洋參均能產(chǎn)生特異性條帶，但在61 ℃之后西洋參特異性條帶亮度明顯降低。根據(jù)電泳條帶的亮度確定多重PCR的退火溫度為59 ℃(圖2-A)。對循環(huán)數(shù)的考察，25～40個循環(huán)時均能對人參、三七、西洋參進(jìn)行鑒別，能明顯的看出35個循環(huán)時條帶亮度最高，最清晰，且無非特異性擴(kuò)增(圖2-B)。

2.1.2 DNA含量與最適引物量

20 μL體系中模板含量分別為20、30、40、50 ng，結(jié)果人參、三七和西洋參均能擴(kuò)增出特異性條帶，多次重復(fù)試驗發(fā)現(xiàn)模板量在40 ng時條帶最亮，確定DNA含量為40 ng(圖2-C)。多重PCR中，引物用量及引物間相互作用對PCR結(jié)果有重要影響，確保PCR總體系中DNA含量為40 ng，模擬混合摻假調(diào)整引物比例致使人參、三七和西洋參的擴(kuò)增效率一致。在調(diào)整引物量的過程中發(fā)現(xiàn)人參和西洋參的特異性引物擴(kuò)增效率明顯高于三七。為了確保電泳結(jié)果的清晰和準(zhǔn)確，最終確定引物配比為人參引物量∶三七引物量∶西洋參引物量體積比為 0.15 μL∶1.25 μL∶0.3 μL(圖2-D)。

M-DL 2000 DNA Marker；Pg-人參；Pn-三七；Pq-西洋參A-不同退火溫度；B-不同循環(huán)數(shù)；C-不同模板量；D-最適引物量摸索圖2 人參、三七、西洋參不同PCR反應(yīng)條件的電泳圖Fig.2 Electrophoresis diagram of Panax ginseng, Panax notoginseng, and Panax quinquefolium under different PCR reaction conditions注：D中1～4號樣品DNA總含量為40 ng；1號樣品人參：三七：西洋參DNA含量為1∶1∶1；2號樣品人參：三七DNA含量為1∶1；3號樣品人參：西洋參DNA含量為1∶1；4號樣品三七：西洋參DNA含量為1∶1；Ⅰ～Ⅵ組人參：三七：西洋參引物量體積比分別為1∶1∶1、0.75∶1∶0.75、0.5∶1∶0.5、0.25∶1∶0.25、0.1∶1∶0.25、0.15∶1.25∶0.3

2.2 多重PCR反應(yīng)體系靈敏性評價

如圖3-A～C所示，調(diào)節(jié)人參、三七、西洋參的模板濃度，使其中任意一模板濃度梯度遞減，其余兩種模板濃度保持不變，按照最佳多重PCR反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，其中人參最低檢測限可達(dá)到1 ng/μL，三七和西洋參可達(dá)到5 ng/μL。本研究所建立多重PCR檢測體系結(jié)果穩(wěn)定，當(dāng)任意一種DNA減少至5 ng/μL時，仍可準(zhǔn)確檢測，且無交叉無污染。

M-DL2000 DNA Marker；1-10 ng/μL；2-5 ng/μL；3-1 ng/μL；4-10-1 ng/μL；5-10-2 ng/μL；6-10-3 ng/μL；7-10-4 ng/μL；N-空白對照A-人參；B-三七；C-西洋參圖3 多重PCR檢測體系靈敏度檢測Fig.3 Sensitivity detection of multiplex PCR detection system

2.3 熒光定量PCR

應(yīng)用熒光定量PCR檢測多重PCR檢測體系發(fā)現(xiàn)其能對3種樣品進(jìn)行準(zhǔn)確快速的區(qū)分，其出峰時間與片段大小密切相關(guān)(圖4)。

圖4 人參、三七和西洋參多重?zé)晒釶CR檢測Fig.4 Multiplex real-time PCR detection of Panax ginseng, Panax notoginseng， and Panax quinquefolium

2.4 混合樣品檢測

人工模擬混合樣品檢測，圖5中Ⅰ組為人參、三七、西洋參三種樣品按照不同比例混合，其余6組為2種樣品混合，提取基因組DNA后進(jìn)行多重PCR檢測。各泳道僅出現(xiàn)特異性條帶，混合樣品檢出限為10%。但經(jīng)過多次重復(fù)試驗發(fā)現(xiàn)，條帶亮度并不總是隨著摻假比例的減少而增高，如圖5中Ⅲ組為人參中混入西洋參，人參和西洋參質(zhì)量比為4∶1時反而比1∶1和9∶1亮，這可能與2種樣品粉末本身質(zhì)量和基因組提取效率相關(guān)。

2.5 市售樣品檢測

應(yīng)用改良的CTAB和試劑盒法提取市售產(chǎn)品的基因組，多重PCR檢測結(jié)果表明生曬參片、紅參片、西洋參片和三七粉等粗加工產(chǎn)品的檢出率明顯高于人參蜜片和人參茶等深加工保健品。選取市場上不同來源的粗加工產(chǎn)品進(jìn)行多重PCR檢測，結(jié)果顯示在16份試售產(chǎn)品中有13份與其成分相符，檢驗陽性率達(dá)到80%(圖6)。

M-DL 2000 DNA Marker圖5 混合樣品多重PCR檢測Fig.5 Multiplex PCR detection of mixed samples注：Ⅰ組1～3號樣品中人參:三七:西洋參DNA含量體積比分別為1∶1∶1、6∶3∶1、6∶1∶3；Ⅱ組1～3號樣品中人參∶三七DNA含量體積比分別為1∶1、4∶1、9∶1；Ⅲ組1～3號樣品中人參∶西洋參DNA含量體積比分別為1∶1、4∶1、9∶1；Ⅳ組1～3號樣品中西洋參∶三七DNA含量體積比分別為1∶1、4∶1、9∶1；Ⅴ組1～3號樣品中西洋參∶人參DNA含量體積比分別為1∶1、4∶1、9∶1；Ⅵ組1～3號樣品中三七∶人參DNA含量體積比分別為1∶1、4∶1、9∶1；Ⅶ組1～3號樣品中三七∶西洋參DNA含量體積比分別為1∶1、4∶1、9∶1

M-DL2000 DNA Marker；P-陽性對照；1～4-生曬參片；5～8-紅參切片；9～12-西洋參切片；13～16-三七粉；N-空白對照圖6 市售粗加工樣品多重PCR檢測電泳圖Fig.6 Electrophoresis diagram of multiplex PCR detection of commercial rough processed samples

3 結(jié)論與討論

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，人民生活水平和自我保健意識的提高，人參的價格和使用需求逐步增加，目前市場上的常見的人參產(chǎn)品有人參粉、人參片、人參顆粒和人參膠囊等。由于人參的經(jīng)濟(jì)價值和藥用價值較高，且人參屬植物的形態(tài)較為相似，導(dǎo)致一些商人在人參產(chǎn)品中摻入西洋參或三七等其他人參屬植物。因此人參及參類產(chǎn)品的鑒別成為目前人參研究的重點。研究者已開發(fā)了多種人參的分子標(biāo)記，其中包括限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism, AFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(random amplified polymorphic DNA, RAPD)、簡單序列重復(fù)區(qū)間(inter-simple sequence repeat, ISSR)、和簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat, SSR)[6-10]。然而，上述方法均有不足之處，不適用于大批量樣本的檢測，難以自動化，例如RFLP和AFLP操作較為繁瑣，很難比較分析，RAPD和ISSR很容易受到PCR反應(yīng)條件微小變化的影響，SSR多態(tài)性通常需要用到聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染等。

近年來，隨著下一代測序技術(shù)的進(jìn)步，表達(dá)序列標(biāo)簽的獲得和高通量技術(shù)的應(yīng)用使得SNP的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用成為可能。與其他DNA分子相比SNP具有檢測假陽性率低，分布廣，密度高和具有代表性等優(yōu)點被認(rèn)為是簡單有效的物品種鑒定方法。在人參方面的研究者中常用AS-PCR的方法檢測SNP位點[11-14]，通過引物3′端堿基與模板嚴(yán)格配對來實現(xiàn)SNP位點的檢測，在實驗過程中PCR反應(yīng)體系，循環(huán)數(shù)和退火溫度等均對PCR的擴(kuò)增產(chǎn)生明顯的影響，常常會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，且重復(fù)性不好。目前多采用引入錯配的方式提高引物的特異性[15-16]。在實驗的過程中發(fā)現(xiàn)僅憑借錯配堿基無法確保實現(xiàn)引物3′末端的完全封閉，因此在SNP位點處引入LNA修飾，這使得引物3′末端完全匹配與錯配的序列Tm值間存在著顯著差異，可以將SNP更好地區(qū)分出來[17]。

9份市售樣品的檢測結(jié)果表明4份與所含原料相符，其中粗加工產(chǎn)品多重PCR檢測陽性率明顯高于深加工保健品。對市場上16份人參粗加工產(chǎn)品進(jìn)行多重PCR檢測，陽性率較高，達(dá)到80%以上。這可能存在摻假的問題，也可能由于市售樣品中藥材本身含量較低，加工過程中高溫處理導(dǎo)致DNA嚴(yán)重降解或者產(chǎn)品本身添加輔料(如蜂蜜、淀粉、蔗糖和葡萄糖等)影響DNA提取效率。

本研究利用了基于SNP位點的多重PCR技術(shù)建立了人參、三七和西洋參的快速檢測體系，通過LNA修飾和引入錯配堿基的方式使3′末端實現(xiàn)完全封閉，達(dá)到增強(qiáng)引物特異性的目的，該方法靈敏度高，重復(fù)性好，基于常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳即可對樣品的成分進(jìn)行檢測，并可用于市售參類產(chǎn)品具體成分的鑒定。