邵博宇，徐寧，遲凱月，于文瑩，高麗君*，艾金霞，羅雁非，李明成，3

1(北華大學 醫(yī)學技術學院，吉林 吉林，132013)2(長春海關技術中心，吉林 長春，130062) 3(北華大學吉林省中藥DNA指紋檢測技術科技創(chuàng)新中心，吉林 吉林，132013)

梅花鹿是我國多種珍稀藥材的來源動物，梅花鹿養(yǎng)殖業(yè)是我國新興的經濟產業(yè)之一[1]。隨著日常生活質量的提高，人們除了食用常見的豬肉、牛肉、雞肉和鴨肉外，還增加了鹿肉及其肉制品的食用。鹿肉有低脂肪、高蛋白和低膽固醇等優(yōu)點，梅花鹿肉與馬鹿肉的營養(yǎng)成分含量相似，但梅花鹿肉的蛋白質含量明顯高于馬鹿肉[2-3]。我國的食鹿歷史源遠流長，從周朝時期就有食用鹿肉的文字記載，《名醫(yī)別錄》中記載鹿肉可治療中風，李時珍在《本草綱目》中寫道“鹿肉味甘，溫，無毒，益氣力，強五臟，養(yǎng)血生容”[4]。2011年，國家批準鹿肉可作為普通食品供大眾食用，鹿肉制品工業(yè)開始迅猛發(fā)展。各種鹿肉加工制品，如鹿肉醬、鹿肉丸、鹿肉腸等逐漸進入大眾的視野[5]。隨著鹿肉市場日漸高漲，不法商家以豬肉、牛肉等廉價肉類摻入鹿肉干及鮮鹿肉中，嚴重擾亂了鹿肉制品市場的秩序，影響鹿肉及其制品的食品安全。

近年來，肉類的鑒別摻假有理化性質分析方法，如近紅外光譜法分析樣品的特征性光譜區(qū)分不同物種的肉，和色譜質譜聯(lián)用技術分析物種的特異性多肽[6-7]；或是以免疫學為基礎的酶聯(lián)免疫法以及膠體金免疫層析法，檢測特異性蛋白鑒別摻假，但鹿肉經過加工制作后，蛋白發(fā)生變性就難以對其進行鑒別[8]。隨著分子生物學技術的發(fā)展，DNA檢測技術被廣泛用于物種的鑒別中[9-10]。本研究采用多重聚合酶鏈式反應(multiplex polymerase chain reaction, MPCR)對鮮梅花鹿肉或鹿肉干中的豬肉、牛肉進行鑒別與常規(guī)PCR相比，多重PCR既有單一PCR的特異性和敏感性，且更為便捷，相較于實時熒光PCR，其價格也更為低廉；并且在引物和設計PCR的反應條件上的靈活性也更強，可實現(xiàn)一步檢測出梅花鹿肉、牛肉、豬肉3種動物肉源性成分。選擇本方法目的是建立一種高效穩(wěn)定、簡便實用的鑒別方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品于2020年10月購入，消毒處理后保存于-20 ℃條件下。梅花鹿(Cervusnippon)肉購于長春市雙陽區(qū)鴻博鹿產品經銷公司；豬肉、牛肉、驢肉、狗肉、羊肉、雞肉、鴨肉購于吉林市江灣農貿市場。

2×TaqMaster Mix (Dye Plus)、Ultra GelRed(10 000×)，南京諾唯贊生物科技股份有限公司；100 bp DNA Marker、λDNA Hind Ⅲ，天根生物技術有限責任公司；瓊脂糖，西班牙Agrose公司。

1.2 儀器與設備

臺式高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；JY300E通用型電泳儀，北京君意東方電泳設備有限公司；ETC811 PCR基因擴增儀，蘇州東勝興業(yè)科學儀器有限公司；GeneAmp R PCR System 2700 Applied Biosystem，美國Perkin-Elmer 公司；UV WHITE2020D凝膠成像分析系統(tǒng)，美國Bio-rad公司；Q6000微量紫外分光光度計，美國Quawell公司。

1.3 樣品DNA提取

采用堿變性方法提取基因組DNA[11]。將梅花鹿肉樣品及其他常見物種樣品組織用70%(體積分數(shù))乙醇清洗3 min，37 ℃烘箱中揮發(fā)乙醇，用剪刀剪碎至約1 mm3。稱取樣品0.1 g放入離心管中，加入500 μL裂解液、15 μL蛋白酶K(20 mg/mL)和30 μL 10%(質量分數(shù))十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)，混勻后置于56 ℃水浴振蕩2 h，轉速為100 r/min。直接向裂解后的樣品中加入500 μL飽和乙酸鈉溶液，充分混勻，11 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液加入等體積的異丙醇，-20 ℃放置1 h，11 000 r/min、4 ℃離心10 min，棄上清液，留沉淀。用洗滌液(主要含有(體積分數(shù))70%的乙醇)洗滌沉淀2～3次，干燥沉淀，加滅菌雙蒸水80 μL進行溶解，于-20 ℃下保存，作為DNA模板。將提取的樣品DNA用微量紫外分光光度計測定濃度，根據(jù)OD260/OD280的值鑒定純度。

1.4 梅花鹿肉及其它物種肉樣品檢測

1.4.1 樣品DNA純度及濃度測定

用微量紫外分光光度計測定提取的樣品DNA濃度，根據(jù)OD260/OD280的比值鑒定所提取DNA的純度。

1.4.2 樣品DNA瓊脂糖凝膠電泳

配制質量濃度為8 g/L的膠，膠中加入核酸凝膠染色劑GelRed[1 μL染料/10 mL 1×三羥甲基氨基甲烷-硼酸鹽-乙二胺四乙酸(tris-borate-ethylene diamine tetraacetic acid，TBE)]；PCR反應溶液的上樣量為6 μL，電壓85 V/cm。取凝膠于紫外分析儀上進行檢視。

1.5 三重PCR引物

根據(jù)文獻[12-14]選擇針對梅花鹿、豬、牛3個物種的PCR特異性引物。

表1 三重PCR引物序列及擴增片段長度Table 1 Triplex PCR primer sequence and extended segment length

1.6 三重PCR檢測

1.6.1 三重PCR引物特異性

單重PCR反應體系為2×TaqPCR Mix 酶12.5 μL，所提取的常見動物樣品DNA溶液(100 ng/μL)1 μL，各物種的正向、反向引物(12.5 ng/μL)各0.5 μL，無菌ddH2O補足至25 μL。將PCR反應管放置于PCR儀。PCR反應參數(shù)設定為：95 ℃預變性5 min，循環(huán)反應35次(95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)，延伸(72 ℃) 5 min，4 ℃保存。

1.6.2 PCR產物瓊脂糖凝膠電泳檢測

配制質量濃度為15 g/L的膠，膠中加入核酸凝膠染色劑GelRed(1 μL染料/10 mL 1×TBE)；PCR反應溶液的上樣量為5 μL，6×Loading buffer上樣量為1 μL，電壓85 V/cm。取凝膠于紫外分析儀上進行檢視。

1.6.3 三重PCR退火溫度檢測

三重PCR反應體系為2×TaqPCR Mix 酶12.5 μL，模板(100 ng/μL)4 μL，牛、豬的正向、反向引物(12.5 ng/μL)各0.2 μL，梅花鹿的正向、反向引物(12.5 ng/μL)各0.6 μL，無菌ddH2O補足至25 μL。將PCR反應管置PCR儀，PCR反應參數(shù)：95 ℃預變性3 min，循環(huán)反應35次(95 ℃ 30 s，54～63 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)，延伸(72 ℃) 5 min，4 ℃保存。用1.6.2的電泳檢測方法進行檢測。

1.6.4 三重PCR特異性檢測

采用1.6.3的體系，同時加入梅花鹿、豬、牛3個物種、兩兩組合、單一物種以及常見動物DNA進行PCR檢測特異性。PCR反應管置PCR儀，PCR反應參數(shù)：95 ℃預變性5 min，循環(huán)反應35次(95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s)，延伸(72 ℃) 5 min，4 ℃保存。用1.6.2的電泳檢測方法進行檢測。

1.6.5 三重PCR重復性檢測

采用1.6.4中的反應體系及反應條件，同一操作人員不同時間重復試驗5次。PCR反應管置PCR儀，PCR反應參數(shù)：95 ℃預變性5 min，循環(huán)反應35次(95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s)，延伸(72 ℃)5 min，4 ℃保存。用1.6.2的電泳檢測方法進行檢測。

1.6.6 三重PCR靈敏度檢測

用所提取的DNA先稀釋到100 ng/μL，然后按照1∶10倍比稀釋作為DNA模板，取單一物種DNA模板和3個物種DNA模板，用1.6.4中的反應體系及反應條件檢測三重PCR靈敏性。PCR反應管置PCR儀，PCR反應參數(shù)：95 ℃預變性5 min，循環(huán)反應35次(95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s)，延伸(72 ℃) 5 min，4 ℃保存。用1.6.2的電泳檢測方法進行檢測。

1.6.7 三重PCR混合DNA驗證

提取鹿肉、豬肉、牛肉DNA，然后按比例混合制作成不同鹿肉DNA濃度百分比的模擬混合DNA，用1.6.4中的反應體系及反應條件驗證三重PCR。PCR反應管置PCR儀，PCR反應參數(shù)：95 ℃預變性5 min，循環(huán)反應35次(95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s)，延伸(72 ℃) 5 min，4 ℃保存。用1.6.2的電泳檢測方法進行檢測。

1.6.7 三重PCR混合肉樣驗證

將鹿肉、豬肉、牛肉切碎至肉糜狀后按比例混合制作成不同鹿肉質量百分比的模擬混合肉樣，對混合肉進行DNA提取，用1.6.4中的反應體系及反應條件驗證三重PCR。PCR反應管置PCR儀，PCR反應參數(shù)：95 ℃預變性5 min，循環(huán)反應35次(95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s)，延伸(72 ℃) 5 min，4 ℃保存。用1.6.2的電泳檢測方法進行檢測。

2 結果與分析

2.1 動物基因組DNA提取結果

8 g/L(質量濃度)瓊脂糖凝膠電泳結果表明，各個泳道都可觀察到23 kp左右的條帶，且條帶清晰明亮，證明本研究提取DNA的方法效率高，質量好，碎片較少，可以高效提取各種動物組織的基因組DNA(圖1)。

2.2 提取動物DNA濃度和純度

將提取的樣品DNA用微量紫外分光光度計測定其濃度，結果如表2所示。由表2可知，利用該方法提取DNA效果良好；根據(jù)OD260/OD280判斷所提取DNA的純度，所得比值為1.8～2.0時符合進行PCR實驗的要求，本方法提取各動物DNA純度均在理想范圍內。

M-Marker；N-陰性對照；1-梅花鹿；2-豬；3-牛；4-驢；5-狗；6-羊；7-雞；8-鴨圖1 提取動物基因組DNA電泳結果Fig.1 Agarose gel electrophoresis patterns of various animal DNA

表2 實驗用動物樣品基因組DNA的濃度及純度Table 2 Concentration and purity of genomic DNA of experimental animal samples

2.3 引物特異性結果

由圖2可知，梅花鹿、豬、牛所對應泳道分別在525、212、116 bp處有單一的特異性條帶，明亮清晰。結果表明，3對引物均有良好的特異性。

M-Marker；N-陰性對照；1-牛；2-豬；3-梅花鹿；4-驢；5-羊；6-狗；7-雞；8-鴨a-牛引物；b-豬引物；c-梅花鹿引物圖2 各引物特異性的PCR反應產物瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.2 Agarose gel electrophoresis pattern of PCR reaction product specific to each primer

2.4 三重PCR檢測結果

2.4.1 退火溫度結果

退火溫度分別為54、55、56、57、58、59、60、61 ℃，由電泳圖(圖3)可知，在58 ℃時，PCR產物最清晰明亮，且3個條帶亮度一致。故選擇58 ℃作為三重PCR反應條件的最佳溫度。

M-Marker；1-54 ℃；2-55 ℃；3-56 ℃；4-57 ℃；5-58 ℃；6-59 ℃；7-60 ℃；8-61 ℃；9-62 ℃；10-63 ℃圖3 不同退火溫度PCR反應產物瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.3 Agarose gel electrophoresis patterns of PCR reaction products at different annealing temperatures

2.4.2 特異性結果

由圖4可知，梅花鹿、豬、牛三重PCR分別在525、212、116 bp處有清晰明亮的條帶，梅花鹿、豬、牛3個物種兩兩配對及單一物種加入到三重體系中也表現(xiàn)出良好的特異性。

2.4.3 重復性結果

由圖5可知，同一體系和反應條件下，同一操作人員不同時間進行的三重PCR產物條帶清晰明亮，結果均一致，三重PCR重復性良好。

2.4.4 靈敏度結果

由圖6可知，，當三重體系只加入單一物種，梅花鹿DNA質量濃度在10 ng/μL時，牛DNA質量濃度在1 ng/μL時，豬DNA質量濃度在1 ng/μL時，條帶清晰；當三重體系中有梅花鹿、牛、豬3個物種時，三者的質量濃度在100 ng/μL時，條帶清晰明亮，當質量濃度小于10 ng/μL時，有條帶但不清晰。

M-Marker；N-陰性對照；1-梅花鹿+豬+牛；2-梅花鹿+牛；3- 豬+牛；4-梅花鹿+豬；5-牛；6-梅花鹿；7-豬；8-雞；9-鴨；10-驢；11-羊；12-狗圖4 三重PCR特異性反應產物瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.4 Agarose gel electrophoresis pattern of specific reaction products of triplex PCR

M-Marker；N-陰性對照；1-20201107；2-20201114；3-20201121；4-20201128；5-20201205圖5 三重PCR重復性反應產物瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.5 Agarose gel electrophoresis pattern of repetitive reaction products of triplex PCR

M-Marker；N-陰性對照；1-100 ng/μL；2-10 ng/μL；3-1 ng/μL；4-0.1 ng/μL；5-0.01 ng/μL；6-0.001 ng/μL；7-0.000 1 ng/μLa-梅花鹿；b-豬；c-牛；d-同時加入3個物種圖6 三重PCR靈敏性反應產物瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.6 Agarose gel electrophoresis pattern of the sensitive reaction product of triplex PCR

2.4.5 三重PCR檢測混合DNA結果

由圖7可知，DNA摻假量從10%～50%的梅花鹿混合DNA樣本，均可檢測出摻假的豬肉或牛肉DNA。

2.4.6 三重PCR檢測混合肉樣結果

由圖8可知，摻假量從10%～50%的混合肉樣樣本，均可檢測出摻假的豬肉或牛肉。

a-梅花鹿肉DNA混入牛肉DNA；b-梅花鹿肉DNA混入豬肉DNA；c- 梅花鹿肉DNA混入牛肉DNA、豬肉DNAM-Marker；N-陰性對照；P-陰性對照；1-10%；2-15%；3-20%；4-25%；5-30%；6-40%；7-50%圖7 三重PCR混合DNA反應產物瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.7 Agarose gel electrophoresis pattern of the mix DNA reaction product of triplex PCR

a-梅花鹿肉摻入豬肉；b-梅花鹿肉摻入牛肉；c-梅花鹿肉摻入牛肉和豬肉M-Marker；N-陰性對照；P-陰性對照；1-5%；2-10%；3-15%；4-20%；5-25%；6-30%；7-40%；8-50%圖8 三重PCR混合肉樣反應產物瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.8 Agarose gel electrophoresis pattern of the mix meat reaction product of triplex PCR

3 結論與討論

在我國，梅花鹿是傳統(tǒng)的藥用性動物之一，在東北地區(qū)多見。以梅花鹿各部分為原材料的中藥產品在臨床中并不少見，我國中藥學對于梅花鹿的利用有較久的歷史依據(jù)[15]。如今，梅花鹿也作各種鹿產品中的最佳原料而受到廣大人民的喜愛[16]。梅花鹿身體各部位入藥，制作成食品和藥膳越來越常見，梅花鹿肉營養(yǎng)價值高，可藥食兩用，可與中草藥搭配制作藥膳，烹飪方式多種多樣。鹿肉在中藥材和食用方面有著悠久的歷史，但目前沒有相關的行業(yè)規(guī)定和法律法規(guī)，導致市場上出現(xiàn)以次充好、以假亂真的現(xiàn)象。所以，研究一種針對鹿肉摻假定性的方法顯得尤其重要。

梅花鹿產品的鑒定方法在近些年研究甚廣，從對鹿茸[17]、鹿血[18]、鹿胎[19]、鹿鞭[20]等各種部位進行鑒別，到應用PCR、實時熒光定量PCR[21]、限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈式反應[22]等分子鑒定手段進行鑒別；有基于單核苷酸多態(tài)性基因座，設計梅花鹿等位基因特異性PCR鑒定的特異性引物，可用于快速，準確地鑒定梅花鹿源性成分[23]；還有通過DNA條形碼這種新興的鑒定體系對梅花鹿進行快速鑒定[24]。以上方法可以準確地鑒定出梅花鹿動物源性成分，但目前沒有方法可以同時鑒別出梅花鹿、豬、牛3種成分。

多重PCR是在同一PCR反應體系中加入多對特異性引物，針對不同物種的基因同時擴增出多個核酸片段的一種PCR反應。這種技術能夠高效地用一份動物樣本或加工炮制的中藥或藥膳成品同時區(qū)分梅花鹿、豬、牛3種動物源性成分，相較于其他鑒定方法，此方法在同一反應管中檢出，既節(jié)省時間及成本，又可以提供更加準確的鑒定結果。在單一引物PCR和三重PCR實驗中，各引物均表現(xiàn)出良好的特異性。通過退火溫度實驗，摸索出三重PCR反應的最佳條件。本方法表現(xiàn)出了很好的重復性和靈敏性，能在6 h內完成從提取DNA到PCR檢測結果的全部過程，特異性高、準確度好、靈敏性強，操作簡單易行，能夠很大程度上減少質檢人員的工作量，在混合DNA和混合肉樣檢測中，也表現(xiàn)出準確的檢測結果。本方法所用試劑及儀器較為常見，適用于各級別質檢單位，可以廣泛用于梅花鹿、牛、豬的肉源性產品，具有很高的實用性和長遠的應用前景。

綜上所述，本研究建立了一種快速靈敏、簡單易行的鑒定方法，為解決鹿肉中摻假成分的鑒別問題提供新途徑。