王若輝，李慶楊，劉毅華，莫潤宏*

1(中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州，311400)2(南京林業(yè)大學 林學院，江蘇 南京，210037)

酚類物質(zhì)是植物的重要次生代謝產(chǎn)物，具有良好的抗菌、消炎和神經(jīng)保護作用[1]，還能夠改善血脂狀況，降低冠心病和心臟病的風險[2]，但其也是食物澀味的重要來源。澀味是由于酚類物質(zhì)苯環(huán)上的酚羥基與口腔內(nèi)的唾液蛋白發(fā)生反應，觸覺機械感受器感覺到后，由三叉神經(jīng)的游離神經(jīng)末梢傳導刺激神經(jīng)，從而產(chǎn)生澀感[3-4]。輕度的澀味會在一定程度上豐富食物的口感，而重度的澀味往往會引起食用者的不適[5]。因此，通過研究澀味的產(chǎn)生和強弱對改善產(chǎn)品口感，增強產(chǎn)品市場競爭力有重要意義，同時可以通過市場認可度來倒逼品種選育和生產(chǎn)加工向“輕澀”、“適澀”方向研究。

核桃仁中的酚主要分布在內(nèi)種皮上，雖然其在一定程度上能阻止核桃仁的酸敗氧化[6]，但也是核桃仁澀味的主要來源[7]。已有學者對核桃中酚類物質(zhì)代謝途徑[8]、核桃內(nèi)種皮澀味形成的標志物[9]、關鍵澀味物質(zhì)[10]等方面進行了研究，并且證實了不同品種核桃間的苦澀味物質(zhì)具有差異[7]?，F(xiàn)有研究雖初步分析了核桃中澀味物質(zhì)的代謝合成途徑、種類和結(jié)構(gòu)等，但對核桃仁澀味評定方法仍停留在感官評審法，該法易受主觀感受、個體差異、環(huán)境因子等因素的影響[11]，且隨著反復品嘗易產(chǎn)生“感受疲勞”[3]。另外，電子舌[12]雖然能克服傳統(tǒng)感官評審的缺點，但其無法測定滋味物質(zhì)在口腔中的釋放和持久性[13]。因此，學界近年開始利用體外蛋白質(zhì)[牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)等模擬唾液蛋白]與酚類物質(zhì)在非競爭體系下相互作用的非感官評定法對澀味進行定量和機理的研究，該體系下蛋白質(zhì)與酚類物質(zhì)直接反應后，通過蛋白的減少量來反映澀味的強弱[14-16]。例如，在不同葡萄酒的蛋白-酚的互作模型中，結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠電泳和熒光光譜法，并根據(jù)它們與BSA相互作用的強度來反映不同葡萄酒的澀味程度[15]；也有學者利用紫外-可見分光光度法(ultraviolet and visible spectrophotometry, UV-vis)[16]成功鑒定了大批量的葡萄酒澀味程度。而有關競爭體系下蛋白質(zhì)和小分子互作反應的相關研究也已應運至食品過敏原檢測方面[17]。目前，有關非競爭體系中蛋白質(zhì)-酚類物質(zhì)互作多見于葡萄酒等液體飲品上的澀味評定，未見其在核桃澀味評定中應用，更未見競爭體系在澀味評定中的相關報道。綜上所述，本研究根據(jù)澀感產(chǎn)生的原理建立了核桃仁內(nèi)種皮的體外蛋白質(zhì)-酚類物質(zhì)互作定量評定方法，探索了非競爭體系/競爭體系中紫外分光光度法、高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)法對固態(tài)樣品核桃仁澀味評定的適應性。研究結(jié)果可為核桃及其他干果澀味程度的定量評定提供參考，也為核桃品種選育和副產(chǎn)品加工改良等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用核桃樣品采自中國北方地區(qū)核桃圃。選取樹齡一致、長勢良好、產(chǎn)量穩(wěn)定的不同品種核桃植株，每個品種隨機采取核桃果實50個，果實大小基本一致且飽滿。

甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙腈、甲酸(均為色譜純)，德國Merck公司；丙酮、無水乙醇、冰醋酸、鹽酸、氫氧化鈉、三氟乙酸(AR)，國藥集團化學試劑有限公司；單寧酸(AR)，美國SUPELCO公司；BSA，美國Genview公司。

1.2 儀器與設備

CPA225D十萬分位分析天平，德國Sartorius公司；SB-5200 DTD大功率超聲波水浴，寧波新芝生物科技公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司；R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士Buchi公司；UV-3210PC紫外可見分光光度計，上海精科儀器有限公司；Free Zone 6 L真空冷凍干燥機，美國LABCONCO公司；Agilent 1290高效液相色譜儀(配二極管陣列檢測器)，美國Agilent公司；Biofuge Stratos高速冷凍離心機，美國Therm公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

采收后的核桃鮮樣人工去青皮得到核桃仁，分離內(nèi)種皮和種仁。將內(nèi)種皮冷凍干燥24 h后，稱取0.5 g 于50 mL離心管中，加70%(體積分數(shù))丙酮水溶液15 mL，均質(zhì)后超聲提取30 min，8 000 r/min離心5 min，取上層提取液，重復3次，合并上層提取液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)掉合并提取液中的丙酮，用2 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)剩余液體pH值至2.0，用15 mL乙酸乙酯提取3次，合并乙酸乙酯層，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙酸乙酯，用10 mL甲醇定容，得到核桃仁內(nèi)種皮的提取液。

1.3.2 感官評審

根據(jù)已有文獻[18]，由3～5名身體健康、富有感官評審經(jīng)驗的評審人員組成感官評審小組，對核桃樣品進行澀味感官評定。評審人員統(tǒng)一在上午10∶00進行核桃澀味評定，評審前2 h不進食。評審員品嘗后進行打分(1～10分)，樣品澀感越強，分數(shù)越高。將3位評審員的感官澀味評分取平均，對核桃樣品進行高(G,7.1～10分)、中(Z,4.3～7.0分)、低(D,1～4.2分)澀味程度劃分，結(jié)果如表1所示。

1.3.3 紫外法對核桃澀味定量評定

1.3.3.1 單寧酸標準曲線的建立

取5.7 mL冰醋酸，加水定容至1 000 mL，用0.8 mol/mL氫氧化鈉將pH調(diào)至5，制備得到100 mol/mL醋酸緩沖液。用醋酸緩沖液分別配制7個濃度梯度的BSA溶液和單寧酸溶液，即0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、2.4 mg/mL和0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL的反應液。隨后將單寧酸溶液和BSA溶液均取1 mL按梯度混合，渦旋10 s，在37 ℃條件下水浴2 h，取出后12 000 r/min離心10 min。取離心后上清液1 mL，用醋酸緩沖液1∶1(體積比)稀釋，搖勻后靜置10 min，在320 nm處測吸光值。固定單寧酸濃度，用該濃度下的BSA濃度梯度的吸光值作圖，獲得對數(shù)曲線斜率絕對值。再用單寧酸濃度梯度與該濃度下對數(shù)曲線斜率絕對值作圖，得到單寧酸標準曲線。

表1 不同品種核桃的澀味感官評分Table 1 The sensory astringency scores in different varieties of walnuts

1.3.3.2 非競爭體系中樣品澀味程度測定

分別取樣品加樣體積梯度10、20、30、40、50、60 μL至2 mL離心管中，氮氣吹干后加1 mL醋酸緩沖液混勻。隨后將樣品與BSA溶液按梯度混合，按1.3.3.1余下步驟得到吸光值，確定樣品加樣體積，用該加樣體積與BSA濃度梯度的吸光值作圖，獲得對數(shù)曲線斜率絕對值。

1.3.3.3 競爭體系中樣品澀味程度測定

分別取10、20、30、40、50、60 μL樣品提取液到2 mL離心管中，氮氣吹干后加1 mL 0.8 mg/mL的單寧酸溶液，渦旋10 s，將單寧酸-樣品加樣體積溶液梯度分別與0.8 mg/mL 1 mL BSA溶液混合，渦旋10 s，按1.3.3.1中步驟得到吸光值。1 mL 0.8 mg/mL的單寧酸溶液與1 mL 0.8 mg/mL的BSA溶液反應后的吸光值為0.642，理論競爭體系吸光值為0.642與純樣品加樣體積吸光值之和。在BSA-單寧酸-樣品提取液競爭反應體系中，單寧酸和樣品提取液都能夠與BSA結(jié)合，但二者與BSA結(jié)合能力可能存在差異，因此可能會出現(xiàn)爭奪BSA上結(jié)合位點的現(xiàn)象，這種爭奪能力的強弱可用樣品競爭力表示。樣品競爭力的計算如公式(1)所示：

樣品競爭力(紫外-可見分光光度法)

(1)

1.3.4 HPLC法-核桃澀味定量評定

1.3.4.1 色譜條件

優(yōu)先在214 nm下測量；使用Zorbax 300SB-C18(9.4 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，以溶液A[0.1%的三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)超純水溶液]和溶液B(0.1%的TFA乙腈溶液)為流動相，梯度洗脫。洗脫程序如下：0～6 min，70%降至50%的A相，30%升至50%的B相；6～9 min，50%升至70%的A相，50%降至30%的B相；9～12 min，保持70%的A相，30%的B相。采集時間為12 min，進樣量10 μL。

1.3.4.2 非競爭體系中樣品澀味程度測定

用醋酸緩沖液將BSA母液稀釋得到質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL的BSA反應液，分別取10、20、30、40、50、60 μL樣品提取液，將樣品加樣體積梯度與1 mL 0.8 mg/mL的BSA溶液混合，渦旋10 s，在37 ℃條件下水浴2 h，取出后以轉(zhuǎn)速12 000×g離心10 min。離心后的上清液過膜裝瓶，上機測BSA峰面積。峰面積下降率的計算如公式(2)所示：

峰面積下降率/%

(2)

1.3.4.3 競爭體系中樣品澀味程度測定

分別取10、20、30、40、50、60 μL樣品提取液到2 mL離心管中，氮氣吹干后加1 mL 0.8 mg/mL的單寧酸溶液，渦旋10 s，將單寧酸-樣品加樣體積溶液梯度分別與1 mg/mL 1 mL BSA溶液混合，按1.3.4.2步驟上機測BSA峰面積。1 mL 0.8 mg/mL的單寧酸溶液與1 mL 1 mg/mL的BSA溶液反應后的峰面積為2 260.23，即理論峰面積，樣品競爭力的計算如公式(3)所示：

(3)

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2016進行初步處理，圖表采用Microsoft Excel 2016繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外-可見分光光度法在樣品澀味程度定量評定中的應用

2.1.1 單寧酸標準曲線建立

單寧酸濃度梯度與BSA濃度梯度反應后，吸光值如表2所示。固定單寧酸質(zhì)量濃度，隨著BSA質(zhì)量濃度的增大，吸光值呈減小趨勢，反應液中剩余單寧酸含量也呈減小趨勢。但是，當BSA質(zhì)量濃度為2.4 mg/mL，單寧酸質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.4 mg/mL以及BSA質(zhì)量濃度為1.6 mg/mL，單寧酸質(zhì)量濃度為0.1、0.2 mg/mL時，吸光值會驟然升高，從而出現(xiàn)“翹尾”現(xiàn)象。固定單寧酸濃度，用該濃度下的BSA濃度梯度的吸光值作對數(shù)曲線(除去“翹尾點”)，得到其斜率絕對值。再用單寧酸濃度梯度與對應的斜率絕對值作圖，得到線性方程：y=0.473 7x+0.011 4，兩者的相關性R2達到0.999 6，表明它們呈現(xiàn)較好的線性關系。由此可知，對數(shù)曲線斜率的絕對值可以反映單寧酸與BSA的結(jié)合能力，即斜率絕對值越大，單寧酸濃度越高，則相對應的澀味就越強。因此，可以用對數(shù)曲線的斜率絕對值衡量樣品的澀味程度相對強弱。

表2 單寧酸、BSA溶液梯度混合吸光值測定Table 2 The absorbance values of the reaction systems containing different concentrations of tannins and BSA

2.1.2 非競爭體系中樣品澀味程度定量評定

如圖1所示，隨著樣品加樣體積的增加，G1、Z1對數(shù)曲線斜率的絕對值也逐漸增大，即澀味程度增加(去除“增高點”、“翹尾點”)。但是，D1對數(shù)曲線斜率的絕對值在30 μL處得到最低值，隨后又逐漸增大。當樣品加樣體積為10、20、30、40 μL時，所得對數(shù)曲線斜率的絕對值與感官評審結(jié)果不符。只有當加樣體積高于50 μL時，對數(shù)曲線斜率的絕對值才表現(xiàn)為G1>Z1>D1，與感官評審結(jié)果相符。

實際樣品測定時，加樣體積定為60 μL。隨著BSA質(zhì)量濃度增加，樣品的吸光值均在0.2 mg/mL BSA質(zhì)量濃度處達到最高值，其中G3和Z2吸光值最高，分別為2.068和2.046。去除“增高”點前的數(shù)據(jù)，得到不同樣品的對數(shù)曲線斜率絕對值，如表3所示。其中，感評審官高澀味程度的G1、G2、G3樣品的斜率絕對值分別為0.423、0.222、0.461，感官評審澀味程度的Z1、Z2、Z3樣品的斜率絕對值分別為0.357、0.373、0.308，感官評審低澀味程度的D1、D2、D3樣品的斜率絕對值分別為0.224、0.269、0.141。結(jié)果表明，對數(shù)曲線斜率的絕對值僅能大致將樣品分為高、中、低澀味程度三個區(qū)間，而無法進一步區(qū)分感官評分相近的樣品。

圖1 紫外-可見分光光度法的非競爭體系-樣品加樣體積確定Fig.1 The determination of sample volume in non-competitive system of UV-vis

表3 紫外法的非競爭體系-樣品斜率絕對值Table 3 The absorbance values and the slope of the logarithmic curve of walnut in non-competitive system of UV

2.1.3 競爭體系中樣品澀味程度定量評定

在競爭反應體系中，如圖4所示，隨著加樣體積增多，純樣液梯度、實際競爭體系吸光值、理論競爭體系吸光值均呈線性增加，但樣品的競爭力并未隨著加樣體積的增加而增加，且二者之間線性關系不明顯(R2=0.126)。

圖2 紫外-可見分光光度法的競爭體系-G1樣品競爭力Fig.2 The competitiveness of G1 in competitive system of UV-vis

2.2 HPLC法在樣品澀味程度定量評定中的應用

2.2.1 非競爭體系中樣品澀味程度定量評定

如圖3所示，同一樣品中，峰面積下降率隨著加樣體積的增加而增加，但二者之間不呈線性。當G1、Z1的加樣體積為30 μL時，峰面積下降率均為50%左右，隨著加樣體積增多，其峰面積下降率逐漸趨于飽和(100%)；而對D1而言，加樣體積為60 μL時，峰面積下降率僅為44.28%。此外，在各加樣體積下，樣品峰面積下降率與感官評審結(jié)果不相符(30 μL除外)。結(jié)果表明，非競爭體系中，由于HPLC法靈敏度較高，很難確定不同樣品的加樣體積；加樣體積梯度與峰面積下降率之間不呈線性增加，無法擬合線性方程。

圖3 HPLC法的非競爭體系-樣品加樣體積確定Fig.3 The determination of sample volume in non-competitive system of HPLC

2.2.1 競爭體系中樣品澀味程度定量評定

經(jīng)計算，樣品加樣體積梯度和樣品競爭力之間呈線性關系，進而根據(jù)樣品加樣體積梯度與其所對應的峰面積下降率進行線性擬合，得到線性方程，G1、Z1、D1樣品的分別為y=0.001 8x+0.021 7、y=0.001 6x+0.002、y=0.001 3x-0.032 2，R2分別為0.993、0.994、0.981。再根據(jù)線性方程計算50%峰面積下降率所需樣品加樣體積(IC50)，IC50值越大，樣品澀味程度越弱。G1、Z1、D1其IC50值分別為274.57、302.47，406.55。結(jié)果表明，采用HPLC法-競爭體系能夠?qū)⒏泄僭u審區(qū)別較大的樣品區(qū)分開。為了進一步驗證此法的可行性，對已有的9個樣品進行了澀味程度評定，如表4所示，發(fā)現(xiàn)感官評分越低，樣品IC50值越大。

表4 HPLC法的競爭體系中樣品的IC50值Table 4 The IC50values of walnut samples in competitive system of HPLC

3 討論

3.1 紫外-可見分光光度法-非競爭體系在固態(tài)核桃樣品中的適應性

已有研究表明，固定單寧酸質(zhì)量濃度，隨著BSA質(zhì)量溶液濃度升高，BSA-單寧酸結(jié)合反應生成的沉淀量也逐漸增加[19]，同時吸光值降低。本研究中，測定單寧酸標準曲線時，當單寧酸質(zhì)量濃度較低時，會在BSA溶液質(zhì)量濃度較高點出現(xiàn)吸光值驟然升高的“翹尾”現(xiàn)象。一般而言，蛋白質(zhì)和單寧酸可以通過氫鍵、疏水作用力和分子間作用力等相互結(jié)合，二者最初結(jié)合會形成可溶性的聚集物，而較高質(zhì)量濃度的單寧酸會促使這些可溶性聚集物進一步結(jié)合形成沉淀，要形成最大沉淀量，單寧酸/BSA兩者需達到最佳比例[20]。而當BSA質(zhì)量濃度過高時，蛋白質(zhì)可能會由于暴露在單寧酸中變性，致使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[21]，從而對紫外分光光度計所測結(jié)果造成干擾，造成“翹尾”現(xiàn)象。

在核桃樣品的澀味定量評定時，無論樣品加樣體積多少，隨著BSA質(zhì)量濃度增加，吸光值會在0.2 mg/mL BSA質(zhì)量濃度處先達到一個最高值，隨后再逐漸下降。此現(xiàn)象可能與提取液中溶劑殘留物質(zhì)有關系。早有學者利用紫外-可見分光光度法對葡萄酒的澀味進行評定，其澀味程度評定結(jié)果與感官評審結(jié)果基本一致，相關性高達0.91[17]。葡萄酒本身作為一種混合均勻的溶液，無論是感官評審還是儀器評定澀味，都具有優(yōu)勢。本研究中的樣品均為固體，非競爭體系僅能將核桃樣品按澀味程度大致分為高、中、低三類，而無法準確評定澀味感官評分相近的樣品。由此可見，紫外-可見分光光度雖然能夠克服主觀因素、個體差異、感官疲勞等影響因素，并對核桃樣品澀味程度進行大致定量評定。但是在進行大批核桃樣品澀味的定量評價時，此法仍存在穩(wěn)定性差、受外界影響較大等缺陷。

3.2 HPLC法-非競爭體系在固態(tài)核桃樣品中的適應性

HPLC法能夠定量的反映出蛋白質(zhì)與酚類物質(zhì)的結(jié)合能力，但現(xiàn)有研究多集中于唾液蛋白與單體酚(兒茶素、表兒茶素等)之間的反應[22-23]，并未將其用至實際樣品的澀味程度定量評定中。因此，本研究選擇固定BSA質(zhì)量濃度，加入不同體積樣品進行反應。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同樣品對應的BSA峰面積下降率與加樣體積間不呈線性關系，并且不同品種核桃的BSA峰面積下降率達到飽和狀態(tài)時加樣體積差距較大。事實上，與純單寧酸溶液不同，核桃樣品提取液是一個相對復雜的混合酚體系，不同品種會造成酚類物質(zhì)含量及種類差異[10]。而這個混合樣品體系中的某2種，甚至多種酚之間可能存在協(xié)同效應，促進了與蛋白的相互作用，促使形成更高的不溶性聚集物[24]，從而出現(xiàn)峰面積下降率“驟變”點。此外，蛋白質(zhì)、酚類物質(zhì)間相互作用的締合強度還會隨著酚結(jié)構(gòu)的變化而變化[25]。正是不同核桃品種間的差異，會使得峰面積下降率的“驟變點”大不相同，在實際操作過程中不同品種核桃加樣體積的確定也更為困難。因此，HPLC法-非競爭體系無法準確且定量評定核桃樣品的澀味程度。

3.3 紫外-可見分光光度和HPLC法的競爭體系在固態(tài)核桃樣品中的適應性比較

多酚類物質(zhì)與蛋白結(jié)合產(chǎn)生澀感的屬性十分復雜，不僅易受到自身化學結(jié)構(gòu)和含量的影響，還與二者結(jié)合時外部環(huán)境條件(溫度、pH等因素)密切相關[25]。因此，紫外法和HPLC法的非競爭體系均難以準確測定核桃樣品的澀味程度，且HPLC法難以確定樣品的加樣體積。因此，本實驗采用BSA-單寧酸-樣品提取液競爭反應體系對樣品的澀味程度進行評定。

在競爭體系中，理論上隨著樣品加樣體積增加，樣品的競爭力也應增強。但在紫外-可見分光光度法中樣品的競爭力并未隨著加樣體積的增加而增加。因此，用紫外光度計法不能區(qū)分競爭體系中不同澀味程度的樣品。用HPLC法時，對核桃樣品感官評分和IC50值進行線性擬合，如圖4所示，得到線性方程：y=-20.089x+357.49，R2=0.935 2。因此，可利用IC50值表示核桃澀味程度，IC50值越大，樣品澀味程度越大。結(jié)果表明，通過競爭反應體系，能夠放大BSA與樣品中酚類物質(zhì)的結(jié)合程度，使得峰面積下降率“驟變”現(xiàn)象消失，從而能消除因品種間酚類物質(zhì)含量、種類不同造成的澀味定量評定結(jié)果偏差。

圖4 HPLC法的競爭體系中感官評分與IC50值的關系Fig.4 The linear relationship between sensory astringency score of walnut and IC50in competitive system of HPLC

4 結(jié)論

本實驗通過紫外法、HPLC法對不同澀味程度的固態(tài)核桃樣品進行了澀味定量評定。在非競爭體系中，紫外法在測定中會出現(xiàn)吸光值“增高點”和“翹尾點”等現(xiàn)象，并僅能根據(jù)定量評定結(jié)果將其大致分為高、中、低三類，無法進一步對樣品進行詳細、準確的定量評定；HPLC法在測定中會出現(xiàn)BSA峰面積下降率飽和的現(xiàn)象，大批樣品測定時很難確定具體的加樣體積，因此增加了樣品澀味定量評定的難度，降低了評定的準確度。而在競爭體系中，紫外法中樣品的競爭力與加樣體積之間不呈線性，因此不適宜用于澀味程度的評定；HPLC法測定時，樣品的競爭力與加樣體積間不僅呈線性，而且樣品感官評分和IC50值呈良好線性(R2=0.935 2)，即IC50值越大，樣品澀味程度越大。因此，在HPLC法的競爭反應體系能夠克服吸光值“增高點”、“翹尾點”、峰面積下降率驟然飽和等現(xiàn)象，可用于大批量的對核桃樣品的澀味定量評定。