董人華，滕國新，王曉杰，王秀麗

（1.北京中醫(yī)藥大學，北京 102488；2.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團）股份有限公司，北京 101117；3.北京電子科技職業(yè)學院，北京 101100）

0 引言

牛乳低聚糖(Bovine milk oligosaccharides，BMO)和母乳低聚糖（human milk oligosaccharides，HMO），分別為牛乳和母乳固形物中第三大成分，具有促進腸道內(nèi)有益菌生長繁殖、調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)，阻斷致病菌對腸黏膜侵襲、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，促進新生兒大腦發(fā)育，發(fā)揮抗病毒以及預(yù)防和治療壞死性腸炎（NFC）、嬰幼兒腹瀉、早產(chǎn)兒腸道感染等作用[1-2]。

人初乳和成熟乳分別含有22～24 g/L和12～13 g/L的低聚糖，相比之下，產(chǎn)后立即收集的牛初乳中僅含有約1～2 g/L的寡糖，且該濃度在48 h后迅速降低[3]。哺乳的第一周，BMO豐度下降較快，隨著初乳向成熟乳的過渡，BMO豐度進一步下降，成熟牛乳中約含100 mg/L的BMO[4]。盡管BMO的濃度和豐度較HMO低，BMO仍是HMO模擬物的潛在來源，對BMO的研究具有十分重要的意義。

1 BMO的一般結(jié)構(gòu)

牛乳低聚糖(BMO)和母乳低聚糖（HMO）一般由3～14個單糖通過糖苷鍵連接，通常為直鏈或支鏈結(jié)構(gòu)，在乳腺中組裝而成[5]。組成BMO的單糖有D-葡萄糖（Glucose，Glc）、D-半乳糖（Galactose，Gal）、L-巖藻糖（Fucose,Fuc）、N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetylglucosamine，GlcNAc）和N-乙酰神經(jīng)氨酸（Nacetylneuraminic acid，Neu5Ac）、N-羥乙酰神經(jīng)氨酸（N-glycolylneuraminic acid，Neu5Gc）6種[6]。由于CMPN-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶在人乳中的缺失，HMO不含N-羥乙酰神經(jīng)氨酸（Neu5Gc）單糖基[7]，HMO只有5種單糖基組成[1]。牛乳低聚糖和母乳低聚糖的單糖基組成，如表1所示

表1 BMO和HMO的單糖基構(gòu)成

目前發(fā)現(xiàn)的HMO超過200種結(jié)構(gòu)[2]，而BMO超過60種結(jié)構(gòu)[4]。兩者在其還原端都含有乳糖核心（Gal（β1-4）Glc），而BMO在其還原端還具有N-乙酰乳糖胺（Gal（β1-4）GlcNAc）單元。BMO和HMO可在乳糖核心結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上以α-1,2、α-1,3和α-2,3、α-2,6糖苷鍵分別連接巖藻糖基和N-乙酰神經(jīng)氨酸，組成2’-巖藻糖乳糖（2’-fucosyllactose，2’-FL）、3’-巖藻糖乳糖（3’-fucosyllactose，3’-FL）和3’-唾液酸乳糖（3’-sialyllactose，3’-SL）、6’-唾液酸乳糖（6’-sialyllactose，6’-SL）。BMO又可在N-乙酰乳糖胺核心結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上以α-2,3、α-2,6糖苷鍵分別連接N-乙酰神經(jīng)氨酸，組成3’-唾液酸乳糖胺（3’-sialyllactosamine，3’-SLN）和6’-唾液酸乳糖胺（6’-sialyllactosamine，6’-SLN）。BMO和HMO還可在乳糖核心的基礎(chǔ)上連接半乳糖-β1,3-N-乙酰氨基葡萄糖（Gal(β1-3)GlcNAc，1型鏈結(jié)構(gòu)），形成乳糖-N-四糖（LNT）；或連接半乳糖-β1,4-N-乙酰氨基葡萄糖（Gal（β1-4）GlcNAc，2型鏈結(jié)構(gòu)），形成乳糖-N-新四糖（乳糖-N-新四糖，LNnT）。BMO和HMO中常見結(jié)構(gòu)，如圖1所示。

圖1 BMO和HMO中常見結(jié)構(gòu)

BMO和HMO所含單糖基可在1、2型鏈結(jié)構(gòu)及乳糖核心上通過不同的糖苷鍵組成不同的直鏈或支鏈結(jié)構(gòu)的低聚糖，BMO所具的N-乙酰乳糖胺單元核心上也可連接單糖基。兩者至少有10種以上的共同低聚糖成分，但HMO有更多樣化的結(jié)構(gòu)[5]。在足月母乳中，35%～50%的HMO為巖藻糖基化，12%～14%為唾液酸化，42%～55%為非巖藻糖基化中性HMO。與HMO相反，BMO中具有的酸性低聚糖含量較中性低聚糖多:在BMO中，唾液酸基化低聚糖較豐富，巖藻糖基化低聚糖極少；而HMO中巖藻糖基化低聚糖較豐富[3]。但由于BMO和HMO部分成分的重疊，使得從BMO中提取部分結(jié)構(gòu)的低聚糖添加至母乳代替物如配方奶粉中提供了可能。

2 BMO的功能活性

2.1 對腸道健康及免疫系統(tǒng)發(fā)育的影響

2.1.1 腸道有益菌的益生元作用，維系腸道健康

BMO作為益生元，主要促進母乳喂養(yǎng)嬰兒腸道中常見的優(yōu)勢菌益生菌，如雙歧桿菌等在嬰兒腸道內(nèi)的生長，改善嬰兒健康狀況。同時，BMO的聚合度一般較小，更易于雙歧桿菌的代謝，促進益生菌增殖作用較HMO更優(yōu)[8]。此外，雙歧桿菌在腸道內(nèi)的代謝產(chǎn)物有短鏈脂肪酸（SCFA）、B族維生素、葉酸等，可改善嬰兒的生長發(fā)育如提高腸道細胞能量供應(yīng)、增強免疫、預(yù)防炎癥和過敏等[4]。

短鏈脂肪酸（SCFA），是胃腸道厭氧細菌微生物群如雙歧桿菌屬、類桿菌屬[9]等發(fā)酵的產(chǎn)物，產(chǎn)生的SCFA主要為乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽，通常存在于結(jié)腸中，濃度相對較高，并被腸上皮細胞吸收。這些細菌代謝產(chǎn)物可在結(jié)腸中形成低pH環(huán)境，抑制潛在病原體并利于有益細菌的生長。如雙歧桿菌在體外厭氧發(fā)酵期間有效地消耗2’-FL和3’-FL，顯著增加了乳酸和SCFA的濃度，抑制了難以使用巖藻糖基化低聚糖的大腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長[10]。在一項隨機雙盲對照多中心臨床試驗中[11]，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過3個月的干預(yù)后，含有2′-FL和LNnT的嬰兒配方奶粉顯著增加了雙歧桿菌和鏈球菌的豐度，并將0～6個月大的剖腹產(chǎn)嬰兒組的微生物群改變?yōu)轭愃脐幍婪置鋴雰旱奈⑸锶篬12]。

2.1.2 影響免疫系統(tǒng)功能，預(yù)防炎癥和過敏

一般來說，腸道健康和屏障功能被認為是先天免疫的第一道防線，BMO通過嬰兒腸道微生物群和上皮屏障等可影響先天免疫功能,預(yù)防炎癥及過敏等免疫疾病。

在腸道細菌的持續(xù)接觸、定植和刺激黏膜上皮表面的過程中，嬰兒小腸黏膜免疫系統(tǒng)逐漸成熟，某些益生菌可通過直接刺激腸黏膜固有層的免疫細胞來誘導免疫系統(tǒng)成熟。例如，雙歧桿菌可刺激免疫細胞分泌更多的IL-1和IL-6，從而直接誘導T淋巴細胞的增殖，促進輔助性T細胞分泌IL-2以及促進B淋巴細胞的分化、成熟和分泌抗體[13]。

同時，雙歧桿菌發(fā)酵的產(chǎn)物SCFA被用作多種宿主代謝過程的底物，每種SCFA對嬰兒健康都有其特殊的功能:乙酸和丙酸被認為可以降低嬰兒哮喘的風險[12]；丁酸可以刺激腸上皮代謝，穩(wěn)定缺氧誘導因子（HIF），增強腸上皮的屏障功能，降低便秘和腹瀉的風險[14]。同時，丁酸還是結(jié)腸細胞的首選能源[15]，在肝臟和結(jié)腸中起到抗炎作用[16]：丁酸可增強調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）的活性和增殖，抑制多種免疫細胞的促炎癥活性[16-17]。

BMO和HMO所含部分組分低聚糖具有抗炎作用：如巖藻糖基化低聚糖，可作用細胞信號通路，影響炎癥因子表達，從而減少新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎（NEC）等炎癥發(fā)生[18]。又如唾液酸化的低聚糖，可以通過降低白細胞對內(nèi)皮細胞的黏附，從而減輕炎癥反應(yīng)[19]。

對過敏小鼠模型的實驗表明，口服2'-FL可減少炎性細胞因子TNF-α、IL-4、IL-6的產(chǎn)生，促進miR-146a的表達，并減少β-乳球蛋白(β-LG)誘導的血清特異性IgE分泌和肥大細胞脫顆粒。2'-FL降低β-LG過敏的免疫調(diào)節(jié)作用可能與調(diào)控miR-146a抑制TLR4/NF-κB信號通路有關(guān)[20]。新生兒攝入2’-FL的含量較高時，可降低成長期間IgE相關(guān)過敏表現(xiàn)，如濕疹的風險[21]。

2.2 抗細菌和病毒黏附的誘導受體

BMO可作為誘導受體，直接抑制致病菌、病毒對正常細胞的吸附、結(jié)合，從而減少疾病如呼吸道感染、急性腸胃炎等的發(fā)生[22-23]。

呼吸道感染（RTI）為嬰幼兒常見疾病，最常見的感染包括肺炎、急性中耳炎、鼻竇炎和支氣管炎等，通常由病毒和/或細菌病原體引起的。超過30%的肺炎相關(guān)死亡是由革蘭氏陽性病原體肺炎鏈球菌引起的，負責將肺炎鏈球菌附著到人類鼻咽上皮細胞的受體之一是GlcNAc（β1-3）Gal。該受體與低聚糖乳糖-N-新 四 糖（Gal（β1-4）GlcNAc（β1-3）Gal（β1-4）Glc，LNnT）等唾液酸化低聚糖具有相似性，LNnT、3’-SL、6’-SL可以作為肺炎鏈球菌天然受體的誘餌，競爭性抑制肺炎鏈球菌對呼吸道上皮細胞的黏附[24]。3’-SL、6’-SL還能抑制銅綠假單胞菌與人肺細胞的黏附[25]。

人類諾如病毒（Norovirus），通常是急性腸胃炎爆發(fā)的主要原因。諾如病毒與組織血型抗原(HBGA)的相互作用對感染很重要。2'-巖藻糖基乳糖(2'FL)可模擬HBGA,充當受體誘餌,抑制諾如病毒與HBGA的結(jié)合[26]。

2.3 促進大腦發(fā)育

BMO和HMO可促進大腦發(fā)育水平，如學習、記憶認知和情緒、行為反應(yīng)的改善[27]。攝入BMO和HMO的幼豬，區(qū)域腦容量和海馬mRNA表達改變，識別記憶等大腦功能得到改善，但BMO和HMO兩者可能通過不同的機制對大腦結(jié)構(gòu)和認知能力有不同的影響[28]。

攝入2'-巖藻糖基乳糖（2′-FL）會影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)功能，例如增加海馬長時程(LTP)及增強大鼠的學習和記憶[29]，與對照組相比，哺乳期口服2'-FL的大鼠在新物體識別和Y迷宮中的表現(xiàn)明顯更好[30]。2′-FL對CNS功能的影響之一是通過腸腦軸(GBA)介導的，這種影響依賴于迷走神經(jīng)的完整性[29]。

唾液酸參與多種分子糖基化的過程，可被腦細胞利用以形成神經(jīng)節(jié)苷脂和唾液酸化蛋白，例如神經(jīng)細胞粘附分子(NCAM)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)[31]。故唾液酸基化的低聚糖，可以通過促進神經(jīng)系統(tǒng)細胞的增殖和發(fā)育等，來維持嬰兒大腦的正常發(fā)育。例如，用3'-唾液乳糖（3'-SL）或6'-唾液乳糖（6'-SL）喂養(yǎng)小鼠有助于維持正常的結(jié)腸微生物群落結(jié)構(gòu)和非焦慮行為[32]。

3 BMO的生產(chǎn)應(yīng)用

3.1 生產(chǎn)概況

多年來，分離或合成具有特定分子結(jié)構(gòu)的BMO和HMO應(yīng)用于嬰兒配方奶粉一直比較困難。較常見的是，使用植物源性低聚糖如低聚半乳糖（GOS）和低聚果糖（FOS）等來模擬BMO和HMO，添加到嬰兒配方奶粉中。然而，這些低聚糖不能完全模擬結(jié)構(gòu)特異性BMO和HMO的效應(yīng)和生物功能[33]。例如，與FOS相比，2′-FL在降低腸道pH值和SCFA生成方面具有優(yōu)勢，雙歧桿菌和乳酸桿菌會優(yōu)先利用2′-FL在嬰兒腸道定植并形成優(yōu)勢菌。GOS可被包括致病菌在內(nèi)的各種細菌非選擇性地利用[34]。

BMO和HMO在嬰兒健康和發(fā)育中的重要性，刺激了全世界對BMO、HMO或其活性類似物合成和制造的研究及商業(yè)關(guān)注。目前，用于合成BMO和HMO的方法包括化學酶、細胞工程和化學合成工藝等取得了重大進展，如使用糖苷酶、糖基轉(zhuǎn)移酶[35]或微生物發(fā)酵[36]的策略合成部分BMO和HMO，包括2′-FL、3′-SL、6′-SL、LNT、LNnT、DFL（二巖藻糖乳糖）等。

為了實用且經(jīng)濟可行地獲得多樣結(jié)構(gòu)性的BMO和HMO，更好地了解它們的結(jié)構(gòu)并進一步探索生物學功能與生產(chǎn)應(yīng)用，現(xiàn)也有使用大規(guī)模的膜過濾操作將它們與乳制品流分離的技術(shù)：牛初乳是豐富的BMO的來源，但目前牛初乳的主要工業(yè)用途是生產(chǎn)富含免疫球蛋白的高價值濃縮物，如奶酪。奶酪生產(chǎn)過程中，非酶蛋白和極性分子（如鹽、乳糖和BMO）會作為乳清被去除，乳清蛋白純化產(chǎn)生的液體副產(chǎn)品，稱為奶酪乳清滲透液，通常被視為廢物流和環(huán)境污染物。BMO在乳清蛋白制造的副產(chǎn)品乳清滲透液中的含量和濃度較高，因此可以從中提取營養(yǎng)價值高的BMO[36]，增加乳清滲透液流的價值，提高乳品業(yè)的持續(xù)利用。

例如，開發(fā)了從乳品流中利用膜過濾分離寡糖的中試優(yōu)化技術(shù)，從初乳中完成乳糖水解和單糖發(fā)酵后，對發(fā)酵乳清滲透液進行納濾，可減少不需要的單糖和雙糖的含量，高純度回收95%的低聚糖[37]。另外，膜過濾技術(shù)和酶促系統(tǒng)添加巖藻糖和唾液酸的聯(lián)合應(yīng)用新策略可使BMO合成類HMO的產(chǎn)品，成為改善嬰兒配方奶粉功能的高價值成分[35]。

3.2 商業(yè)應(yīng)用

2015年，歐洲食品安全管理局批準使用含2′-FL和LNtin的嬰兒配方奶粉和其他嬰兒食品，規(guī)定在嬰兒食品中以2∶1的比例，最大劑量為2′-FL（1.2 g/L）和LNnT（0.6 g/L）添加2′-FL和LNnT對1歲以下或1歲以上的嬰兒是安全的。2019年，美國食品和藥物管理局（FDA）規(guī)定，0至12個月大的嬰兒配方奶粉中2′-FL的最大劑量為2.4 g/L，LNnT的最大劑量為0.6 g/L。同年，澳大利亞和新西蘭食品標準局（FSANZ）建議添加2′-FL和LNnT時，LNnT的最大劑量為24 mg/100 kJ，2′-FL和LNnT的最大總劑量為96 mg/100 kJ。

監(jiān)管和專業(yè)機構(gòu)制定的有效官方標準保障了嬰兒配方奶粉和其他嬰兒食品的安全性和營養(yǎng)質(zhì)量，同時也開拓了BMO和HMO的商業(yè)應(yīng)用道路。例如：2018年，Glycosyn公司在收到FDA的GRAS監(jiān)管批準通知后生產(chǎn)了2′-FL、LNT和DFL，Genechem生產(chǎn)了3′-SL等。一些嬰兒乳品行業(yè)公司已獲得大規(guī)模生產(chǎn)低聚糖的能力，并補充添加入嬰兒配方奶粉中，帶來革命性的變化。

2016年第一批相關(guān)嬰兒配方產(chǎn)品出現(xiàn)，其后更多的產(chǎn)品不斷涌現(xiàn)：如，雅培將2′-FL應(yīng)用于嬰兒配方奶粉（SimilacRProAdvance）；Aptamil將2′-FL和3′-GL與FOS和GOS組合應(yīng)用添加;惠氏將0.25 g/L的2′-FL添加入S-26R嬰兒配方奶粉，2′-FL和LNnT添加入lluma系列的嬰兒配方奶粉1-4段中。此外，美贊臣、雀巢等嬰兒乳品公司也將低聚糖應(yīng)用于其嬰兒配方奶粉產(chǎn)品[37]。

4 前景與展望

在國外，牛乳低聚糖(BMO)和母乳低聚糖（HMO）在嬰兒營養(yǎng)與健康中的功能和應(yīng)用取得了重大的研究進展和技術(shù)突破，向功能食品和母乳替代品如嬰幼兒配方奶粉中添加具有自然非特異性免疫調(diào)節(jié)作用的低聚糖來調(diào)節(jié)腸道微生物群、增強免疫力，已經(jīng)成為保護兒童健康的成長發(fā)育以及調(diào)整成人身體功能的全新概念的添加劑的選擇。

目前，國內(nèi)關(guān)于牛乳低聚糖的研究和生產(chǎn)還處于初步階段，對牛乳低聚糖的深入研究、開發(fā)，以及低成本的大量生產(chǎn)和廣泛的應(yīng)用還需要我們的努力。同時，BMO和HMO的抗菌、抗病毒功能以及通過調(diào)節(jié)腸道微生物群來預(yù)防肥胖、抑郁等疾病的作用或可進一步深入研究，以期開發(fā)成具有相關(guān)保健、治療作用的輔助性食品或新型藥物，故牛乳低聚糖有著非常重要的研究意義和廣闊的應(yīng)用前景。