黃 平,洪靜霞,米 杰,張攀學(xué),李 超,楊文鴿
(寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院,浙江省動物蛋白食品精深加工技術(shù)重點實驗室,浙江 寧波 315211)
炎癥是宿主應(yīng)對感染、細胞應(yīng)激或組織損傷的一種防御適應(yīng)性反應(yīng),受多種信號通路調(diào)控,以保證炎癥過程的啟動、維持和消退[1-2]。當(dāng)機體免疫反應(yīng)異?;钴S,可引起過度炎癥,導(dǎo)致細胞和組織損傷[3]。巨噬細胞是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分,通過執(zhí)行多種功能(吞噬、產(chǎn)生和分泌多種細胞因子和生長因子)參與免疫調(diào)節(jié)[4]。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),又稱內(nèi)毒素,為革蘭氏陰性菌細胞壁外壁的組成成分,可作用于膜受體激活多種細胞(巨噬細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞等)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),促進促炎細胞因子和其他炎性介質(zhì)的合成及釋放,引發(fā)炎癥反應(yīng)[5]。LPS激活巨噬細胞的過程主要包括:巨噬細胞膜上Toll樣受體4(toll-like receptor 4,TLR4)識別LPS,使TLR4胞內(nèi)的基團構(gòu)象發(fā)生變化,將信號傳入胞內(nèi),激活細胞中多種蛋白質(zhì)磷酸化級聯(lián)反應(yīng)鏈,最終激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPKs)和核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor,NF)-κB信號通路,促進多種炎癥介質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達,如一氧化氮(NO)和前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)及其上游炎癥酶誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白細胞介素(interleukin,IL)-1β和IL-6等[6-7]。
羊棲菜(Hizikia fusiformis)作為一種可食性褐藻,廣泛分布于我國浙江沿海一帶,富含多種活性物質(zhì),營養(yǎng)價值高[8]。羊棲菜多酚(Hizikia fusiformispolyphenols,HFPs)是羊棲菜中重要活性物質(zhì)之一,約占藻體干質(zhì)量的2%,HFPs主要為間苯三酚衍生物及連苯三酚衍生物,具有抗氧化[9]、抗菌[10]、抗炎[11]及抑制代謝酶[12]等作用。倪立穎等[11]采用LPS刺激胚胎期斑馬魚建立體內(nèi)炎癥模型,評估HFPs提取物的抗炎活性,結(jié)果表明HFPs提取物顯著降低胚胎斑馬魚體內(nèi)NO水平、細胞死亡率和活性氧生成率。Yang等[13]在研究HFPs體外抗炎功效時發(fā)現(xiàn),其減少了巨噬細胞促炎因子(NO、IL-6和TNF-α)的分泌。目前,有關(guān)HFPs抗炎作用的報道主要集中于其對部分炎性介質(zhì)的影響,而缺乏系統(tǒng)而深入的機制研究。本研究采用LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細胞建立體外炎癥模型,基于MAPKs和NF-κB信號通路,從基因、蛋白相對表達水平和細胞吞噬功能等方面評估HFPs的抗炎活性,為其在新型抑炎制劑的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。
羊棲菜干制品(產(chǎn)自浙江洞頭海域) 溫州星貝海藻食品有限公司。
小鼠巨噬細胞RAW264.7 中國科學(xué)院細胞庫。
達爾伯克(氏)改良伊格爾(氏)培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified Eagle medium,DMEM)、DMEM/F12無酚紅培養(yǎng)基、胎牛血清 美國HyClone公司;噻唑藍(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)、LPS、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白濃度測定試劑盒、5×蛋白上樣緩沖液、高效RIPA細胞快速裂解液 北京索萊寶科技有限公司;N-(1-萘基)乙二胺鹽酸鹽、對氨基苯磺酰胺 上海源葉生物科技有限公司;TRIzol試劑 美國Omega公司;綠色熒光微球 北京百靈威科技有限公司;Taq-based聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)試劑盒 日本ToYoBo公司;FastStart Essential DNA Green Master 美國Roche公司;c-Jun N末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)兔單克隆抗體、p-JNK兔單克隆抗體、p38 MAPK兔多克隆抗體、p-p38 MAPK兔多克隆抗體、NF-κB p65兔單克隆抗體、p-NF-κB p65兔單克隆抗體、iNOS兔多克隆抗體 武漢愛博泰克生物科技公司;Tris緩沖鹽溶液+吐溫(Tris buffered saline+tween,TBST)洗膜液 山東思科捷生物技術(shù)有限公司;增強型化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence,ECL)免疫印跡檢測試劑 江蘇新賽美生物科技有限公司;其他試劑均為分析純。
1300系列A2型生物安全柜、梯度PCR儀、恒溫恒濕培養(yǎng)箱 美國Thermo Fisher Scientific公司;SpectraMax i3多功能酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司;CFX 96 Touch實時熒光定量PCR儀 美國Bio-Rad公司;Gallios流式細胞儀 美國Beckman公司;DYCZ-24DN型電泳儀、DYCZ-40D轉(zhuǎn)印槽 北京六一儀器廠;ChemiScope 4300 pro化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng) 上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。
1.3.1 羊棲菜多酚的制備
參照Wang Chen[14]、李亞嫻[15]等的方法并略作修改。取干燥羊棲菜粉末,加入體積分數(shù)60%乙醇溶液超聲輔助浸提(料液比1∶20(m/V)、50 ℃、60 min),抽濾后真空減壓蒸餾去除乙醇,獲羊棲菜粗多酚溶液,依次采用等體積石油醚、乙酸乙酯分級萃取,真空減壓蒸餾后凍干,獲得HFPs粉末。測得HFPs粉末總酚含量為(23.67±0.24)mg/g。利用無菌水配制成多酚母液,再以細胞培養(yǎng)液稀釋至不同濃度,用于后續(xù)實驗。
1.3.2 細胞培養(yǎng)
完全培養(yǎng)基(含10%(體積分數(shù),下同)胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗DMEM培養(yǎng)基)培養(yǎng)RAW264.7細胞,37 ℃、5% CO2培養(yǎng),細胞融合度約80%時進行傳代。
1.3.3 RAW264.7細胞活力測定
取對數(shù)生長期細胞,以3×105個/mL接種于96 孔板,每孔100 μL。待細胞貼壁后,更換為含不同質(zhì)量濃度(0(即對照組)、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、250、300、350 μg/mL)HFPs的新鮮完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h。棄去上清液,加入100 μL含0.5 mg/mL MTT的DMEM/F12無酚紅培養(yǎng)基,37 ℃避光孵育4 h。再次棄去上清液,每孔加入200 μL二甲基亞砜,37 ℃振蕩30 min,測定540 nm處OD540nm值。按公式(1)計算細胞活力。
1.3.4 RAW264.7細胞NO相對含量測定
參照1.3.3節(jié)方法進行細胞接種,培養(yǎng)24 h細胞貼壁后,將細胞分為3 組:陰性對照組、LPS陽性對照組、HFPs+LPS組。陰性對照組加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基;LPS陽性對照組加入含LPS(1 μg/mL)和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基刺激24 h;HFPs+LPS組經(jīng)含不同質(zhì)量濃度(10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、250、300、350 μg/mL)HFPs和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后,以含LPS(1 μg/mL)和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基刺激24 h。采用Griess法測定各組在540 nm處OD540nm值,按公式(2)計算NO相對含量。
1.3.5 RAW264.7細胞炎癥相關(guān)基因相對表達量的測定
取對數(shù)生長期細胞,以4×105個/mL接種于6 孔板,每孔2.5 mL。細胞分為3 組:陰性對照組,LPS陽性對照組、HFPs+LPS組。LPS陽性對照組在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后,以含LPS(1 μg/mL)和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基刺激3、6、12、24 h;HFPs+LPS組經(jīng)含不同質(zhì)量濃度(30、60、90、120 μg/mL)HFPs和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后,以含LPS(1 μg/mL)和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基刺激3、6、12、24 h;陰性對照組用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基孵育24 h后吸棄培養(yǎng)液,用含不同質(zhì)量濃度(0、30、60、90、120 μg/mL)HFPs和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后棄去培養(yǎng)液,用0.01 mol/L、pH 7.2(后同)的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)清洗細胞2 次,每孔加入500 μL TRIzol試劑提取總RNA,并將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板,采用SYBR Green嵌合熒光法與引物(表1)進行實時熒光定量PCR。測定目的基因(IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2、iNOS)和內(nèi)參基因次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶1(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase,hprt1)Ct值,采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。
表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for qPCR
1.3.6 RAW264.7細胞吞噬能力的測定
參照李煜等[16]的方法并略作修改。按照1.3.5節(jié)方法分組進行藥物處理,陰性對照組為無LPS和HFPs處理,LPS組和HFPs+LPS組LPS刺激3 h后,去除培養(yǎng)基,加入1 mL熒光微球工作液(1×107個/mL)避光孵育2 h。收集細胞,1 000 r/min離心5 min,PBS洗2 次,加入1 mL PBS重懸細胞,經(jīng)75 μm尼龍膜過濾后立即采用流式細胞儀測定細胞熒光強度。以實驗組與陰性對照組熒光強度的比值百分數(shù)表征細胞吞噬能力。
1.3.7 MAPKs、NF-κB信號通路關(guān)鍵蛋白相對表達量測定
按照1.3.5節(jié)方法進行分組和處理,陰性對照組為無LPS和HFPs處理,LPS組和HFPs+LPS組LPS刺激誘導(dǎo)24 h后,收集細胞。加入200 μL RIPA細胞裂解液于冰上裂解30 min,離心(12 000 r/min、4 ℃)10 min取上清液。采用BCA蛋白質(zhì)量濃度測定試劑盒測定各組蛋白濃度,用蛋白上樣緩沖液調(diào)整蛋白質(zhì)量濃度為2 mg/mL,95 ℃加熱10 min使蛋白變性然后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離;濕轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜;5%(質(zhì)量分數(shù))脫脂奶粉(TBST溶液配制)封閉1 h;一抗4 ℃孵育12 h;二抗室溫孵育2 h;加入ECL試劑進行顯色反應(yīng),測定蛋白條帶灰度值。以β-actin為內(nèi)參,目的蛋白包括iNOS、p65、p-p65、p38、p-p38、JNK和p-JNK,分別以p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-p65/p65表示相應(yīng)蛋白磷酸化水平。
每個實驗重復(fù)3 次,結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用Prism 8.3軟件進行單因素方差分析。采用t檢驗進行顯著性分析,P<0.05表示差異顯著。
如圖1所示,與對照組相比,當(dāng)HFPs質(zhì)量濃度不高于160 μg/mL時,其對細胞活力無明顯作用;進一步提高多酚質(zhì)量濃度后,HFPs顯著抑制細胞增殖(P<0.05),并呈劑量依賴性,當(dāng)HFPs質(zhì)量濃度達到350 μg/mL,細胞活力顯著降為對照組的50%(P<0.05)。
圖1 HFPs對RAW264.7細胞活力的影響Fig. 1 Effects of HFPs on the viability of RAW264.7 cells
巨噬細胞經(jīng)LPS刺激后,可產(chǎn)生多種炎性介質(zhì)包括促炎細胞因子、前列腺素和NO等。如圖2所示,與陰性對照組相比,細胞經(jīng)LPS刺激24 h后,其NO相對含量顯著升高(P<0.05)。與陽性對照相比,采用HFPs預(yù)處理可劑量依賴性緩解LPS刺激導(dǎo)致的NO產(chǎn)生,且當(dāng)HFPs質(zhì)量濃度為100 μg/mL以上時,抑制效果顯著(P<0.05)。
圖2 HFPs對RAW264.7細胞NO生成量的影響Fig. 2 Effect of HFPs on NO production in RAW264.7 cells
如圖3A所示,LPS顯著刺激細胞iNOS基因轉(zhuǎn)錄(P<0.05),且iNOSmRNA表達水平隨LPS誘導(dǎo)時間延長而增加。HFPs預(yù)處理24 h后再經(jīng)LPS誘導(dǎo)細胞,HFPs對iNOSmRNA表達水平的影響與LPS刺激時間有關(guān),短期LPS刺激(0~12 h)后HFPs對iNOSmRNA表達水平無明顯作用,而當(dāng)LPS誘導(dǎo)時間延長至24 h時,HFPs(60~120 μg/mL)處理顯著降低了iNOSmRNA相對表達量(P<0.05)。蛋白免疫印跡實驗進一步印證了該結(jié)果,60~120 μg/mL HFPs預(yù)處理顯著降低了LPS誘導(dǎo)24 h巨噬細胞iNOS蛋白水平(P<0.05)(圖3B、C)。
圖3 HFPs對RAW264.7細胞iNOS mRNA和蛋白表達的影響Fig. 3 Effect of HFPs on the expression of iNOS mRNA and protein in RAW264.7 cells
采用實時熒光定量PCR測定HFPs對LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞中重要促炎細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α基因相對表達量,以及炎癥相關(guān)酶COX-2基因相對表達量的影響。如圖4所示,LPS刺激不同時間后,所有炎癥介質(zhì)的mRNA表達水平均顯著提高(P<0.05)。HFPs對促炎細胞因子的抑制作用與其劑量、LPS誘導(dǎo)時間及細胞因子種類相關(guān)。與LPS組相比,靜息狀態(tài)細胞經(jīng)HFPs處理再經(jīng)LPS誘導(dǎo)12、24 h后,IL-1β和IL-6的基因相對表達量顯著下降;HFPs顯著抑制LPS誘導(dǎo)3 h后TNF-α基因的相對表達,而在LPS誘導(dǎo)6~24 h的抑制作用總體不明顯。在LPS誘導(dǎo)24 h,較低劑量HFPs(30、60 μg/mL)預(yù)處理對COX-2基因表達具有顯著抑制作用,但提高劑量后該抑制效果消失,甚至出現(xiàn)反向促進作用,120 μg/mL HFPs預(yù)處理促使COX-2相對表達量較LPS組顯著上升(P<0.05)。
圖4 HFPs對RAW264.7細胞炎癥介質(zhì)基因相對表達量的影響Fig. 4 Effect of HFPs on gene expression of inflammatory mediators in RAW264.7 cells
如圖5所示,與陰性對照組相比,LPS刺激3 h顯著促進了細胞吞噬熒光微球的能力(P<0.05)。經(jīng)60、90、120 μg/mL HFPs預(yù)處理后,LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細胞吞噬能力受到顯著抑制(P<0.05)。
圖5 HFPs對RAW264.7細胞吞噬能力的影響Fig. 5 Effect of HFPs on phagocytic capacity of RAW264.7 cells
采用蛋白免疫印跡法測定巨噬細胞中MAPKs和NF-κB信號通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平。如圖6所示,與陰性對照組相比,LPS刺激3 h后細胞中p38、JNK和p65蛋白的磷酸化水平顯著升高(P<0.05)。90、120 μg/mL HFPs預(yù)處理對LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞中p38和p65的磷酸化產(chǎn)生顯著抑制作用(P<0.05),且呈一定的劑量依賴性,但對JNK的磷酸化沒有顯著影響,表明HFPs的抗炎作用可能與其靶向作用于p38 MAPK和NF-κB p65有關(guān)。
圖6 HFPs對RAW264.7細胞MAPKs和NF-κB信號通路關(guān)鍵蛋白磷酸化水平的影響Fig. 6 Effect of HFPs on the expression of key proteins involved in MAPKs and NF-κB signaling pathways in RAW264.7 cells
巨噬細胞是機體免疫應(yīng)答的第一道防線,具有識別、吞噬、清除細菌及外來異物等功能[17]。然而,當(dāng)巨噬細胞被異常激活,可分泌大量促炎細胞因子進而引發(fā)炎癥風(fēng)暴,導(dǎo)致機體組織損傷,故其靜息-激活的動態(tài)平衡在維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)中起重要作用[18]。針對過度免疫反應(yīng),一般可通過阻斷或抑制炎癥相關(guān)因子的表達達到緩解炎癥及其引起的機體損傷。
細胞增殖能力是機體的重要生命特征和體現(xiàn)細胞活力的重要指標(biāo)。MTT法是一種簡單、快捷、無放射性污染測定細胞活力的方法[19],在本研究中用于評估HFPs對小鼠巨噬細胞的潛在細胞毒性。結(jié)果顯示,HFPs的最大安全質(zhì)量濃度為160 μg/mL,即不高于該劑量時HFPs對RAW264.7細胞活力無影響。
LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁外壁的組成成分,又名內(nèi)毒素,是引起機體炎癥損傷的重要誘因,可激活巨噬細胞產(chǎn)生NO、iNOS、COX-2等多種炎癥介質(zhì)和IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎細胞因子[20-22]。IL-1β大量產(chǎn)生于炎癥初期,其局部激活是介導(dǎo)促炎反應(yīng)的中心環(huán)節(jié),可導(dǎo)致繼發(fā)性炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生[20];TNF-α具有多效性,能增加血管內(nèi)皮細胞通透性,激活中性粒細胞和淋巴細胞,促進其他細胞因子的合成和釋放[23];IL-6作為重要促炎細胞因子,可誘導(dǎo)B細胞分化和產(chǎn)生抗體,誘導(dǎo)T細胞活化、增殖及分化,參與機體免疫應(yīng)答[24]。研究表明,這些細胞因子及其他炎性介質(zhì)的大量釋放,與炎癥相關(guān)性疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[25-26]。本研究結(jié)果表明,RAW264.7細胞經(jīng)LPS刺激后,其炎癥介質(zhì)基因(IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2、iNOS)表達顯著增加,而這一現(xiàn)象在HFPs預(yù)處理后得到緩解,并呈劑量和時間依賴性。Kim等發(fā)現(xiàn)間苯三酚可降低LPS刺激的RAW264.7細胞中TNF-α、IL-1β和IL-6基因表達水平,抑制巨噬細胞炎癥反應(yīng)[27]。Kang等則研究發(fā)現(xiàn)褐藻Eisenia bicyclis提取物抑制LPS激活的HepG2細胞中iNOS和COX-2的表達[28]。結(jié)合本研究結(jié)果,表明HFPs及其他褐藻多酚可通過調(diào)節(jié)多種炎性介質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄水平來抑制炎癥的發(fā)生。
巨噬細胞的吞噬功能在機體防御病原體感染中發(fā)揮重要作用。需要注意的是,過多的免疫細胞(包括巨噬細胞)被激活,將增加炎癥風(fēng)暴風(fēng)險[18]。流式細胞術(shù)結(jié)合熒光標(biāo)記廣泛應(yīng)用于巨噬細胞吞噬功能評估[16]。本研究利用該技術(shù)檢測了HFPs對RAW264.7細胞吞噬功能的影響。結(jié)果顯示,RAW264.7細胞經(jīng)LPS刺激后,其吞噬熒光微球的能力顯著提升,這與Wen Li等[29]的發(fā)現(xiàn)一致。采用HFPs預(yù)處理后,LPS誘導(dǎo)的細胞吞噬能力受到抑制,表明HFPs通過調(diào)節(jié)細胞吞噬功能緩解了炎癥反應(yīng)。
NF-κB是具有多種生物活性的核轉(zhuǎn)錄因子,能通過快速調(diào)節(jié)細胞內(nèi)基因的表達,調(diào)控細胞增殖、凋亡、突變和炎癥反應(yīng)等生理病理過程[30]。細胞經(jīng)內(nèi)毒素刺激可誘發(fā)信號級聯(lián)反應(yīng),激活NF-κB并核轉(zhuǎn)位,啟動下游基因的轉(zhuǎn)錄與蛋白的表達,促進炎癥相關(guān)因子的合成與分泌[18]。Yoon等發(fā)現(xiàn)馬尾藻(Sargassum micracanthum)提取物通過NF-κB信號通路抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細胞中iNOS、COX-2、TNF-α、IL-1β、IL-6等mRNA水平的上調(diào)[31]。Yayeh等研究表明,在LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞中,褐藻Eisenia bicyclis多酚提取物通過抑制NF-κB p65及其上游激酶的磷酸化降低NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性[32]。除NF-κB外,MAPK也是巨噬細胞炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要因子,其磷酸化可進一步導(dǎo)致NF-κB的激活[33]。Jung等[34-35]研究發(fā)現(xiàn),苷苔(Ecklonia cava)提取物能夠降低LPS誘導(dǎo)的小鼠BV2小膠質(zhì)細胞中NF-κB的核轉(zhuǎn)位及其DNA結(jié)合能力,而這一現(xiàn)象與抑制MAPKs的激活有關(guān)。目前,NF-κB/MAPKs信號通路的激活水平,即相關(guān)蛋白的表達和磷酸化水平,被廣泛應(yīng)用于評估和篩選抗炎活性物質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn),LPS刺激可顯著促進關(guān)鍵蛋白的磷酸化(p-p65、p-p38、p-JNK),而HFPs預(yù)處理可劑量依賴性抑制p-p65和p-p38的表達,表明HFPs的抗炎活性與調(diào)控p38 MAPK和NF-κB p65信號通路有關(guān)。不同抗炎藥物的抗炎機制不同,但主要通過阻斷或遏制炎癥相關(guān)通路,或直接中和機體中促炎介質(zhì)以達到抗炎效果[36]。本實驗結(jié)果表明,HFPs可選擇性抑制LPS激活的p38/NF-κB信號通路,減少了IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS和COX-2等的表達,從而緩解炎癥。
綜上所述,HFPs可通過抑制NF-κB/MAPKs信號通路蛋白p65和p38的磷酸化水平,減少促炎細胞因子和其他炎性介質(zhì)的合成與分泌,降低巨噬細胞吞噬作用,從而發(fā)揮抗炎活性。值得注意的是,許多報道證實了體內(nèi)外試驗結(jié)果具有良好的相關(guān)性[37],但生物體內(nèi)情況復(fù)雜,化合物在體內(nèi)外的作用效果可能出現(xiàn)差異,如多酚進入體內(nèi)后可能會被胃液分解成小分子酚類物質(zhì),導(dǎo)致效果減弱[38]。因此,在體外實驗的基礎(chǔ)上還需結(jié)合體內(nèi)實驗,以確定HFPs在完整生物體中產(chǎn)生的抗炎作用,為其開發(fā)新的抗炎藥物提供重要依據(jù)。