宦智群， 徐小蓉， 耿興敏*， 唐 明

(1. 南京林業(yè)大學 風景園林學院， 南京 210037； 2. 貴州師范大學 生命科學學院， 貴陽550001 )

木蘭科(Magnoliaceae)植物作為多心皮類植物的典型代表，是探索被子植物起源與發(fā)展演化的關鍵材料，科學研究價值極高；該科植物大多為春季觀花木本，樹形優(yōu)美，葉、果、花均具較高的園林觀賞價值(楊成華等，2017)，常應用于工礦、居住區(qū)、道路、庭院綠化和公園綠地等方面(宋懷芬和劉會萍，2014)；它們可以作為工業(yè)用材、藥材和香料樹種(孔焱焱，2018)，具有較高的經(jīng)濟價值。由于對木蘭科分類系統(tǒng)和親緣關系的認知分歧，其類群概念至今尚未統(tǒng)一，分類系統(tǒng)眾多，目前國內(nèi)普遍被大家接受且應用最多的是劉玉壺(1997)系統(tǒng)，因此本文也采用該分類系統(tǒng)。據(jù)不同分類系統(tǒng)統(tǒng)計，世界木蘭科種類數(shù)目為240～300種；《中國植物志》 (2004) 中記載中國有木蘭科植物11屬107種，《中國木蘭》 (2004) 記載11屬178種，F(xiàn)loraofChina(2008)記載12屬112種。我國木蘭科的物種豐富度中心在云南、貴州、廣西、湖南、廣東等地，物種豐度由東南、西南地區(qū)向北、東北和西北逐漸減少。

雖然我國的木蘭科植物種類豐富，但野生資源匱乏與繁殖困難，嚴重限制了木蘭科植物的推廣栽培，導致其在園林中應用的種類十分有限(譚秀梅等，2018)。木蘭科中許多植物自然結實率低(向光鋒等，2019)，并且人類活動破壞了原有生境，野生資源保存情況不容樂觀。據(jù)《中國植物紅皮書》(1991)記載，木蘭科中被列為國家重點保護的珍稀瀕危植物有39種之多，是被子植物中受到嚴重威脅種類最多的科；據(jù)《中國生物多樣性紅色名錄·高等植物卷》(2013)記載，木蘭科植物中存在易危(VU)40種、瀕危(EN)27種、極危(CR)9種、近危(NT)6種、地區(qū)滅絕(RE)1種。木蘭科植物的有性繁殖存在發(fā)芽率低、種源欠缺的問題，常規(guī)無性繁殖中嫁接繁殖不適合工廠化育苗，扦插繁殖生根困難(王歡等，2013；張果等，2016)。

組織培養(yǎng)技術是木蘭科植物資源保育及開發(fā)的有效途徑，可通過組織器官離體保存保育植物種質資源，也可通過工廠化育苗為園林綠化提供大量苗木以減少對野生資源的需求。雖然我國木蘭科植物的部分樹種在建立優(yōu)良再生體系方面取得了一定的進展，但研究種類有限，鮮有應用于工廠化生產(chǎn)實踐，并且組培過程中存在褐化、生根困難、愈傷組織再分化困難等技術問題。本文對木蘭科植物不同再生途徑的相關研究進行了論述，總結組培過程中普遍存在的褐化、生根困難等技術難題與解決措施，以期為木蘭科植物高效的再生體系建立提供理論基礎。

1 無菌短枝扦插途徑

木本植物組織培養(yǎng)有無菌短枝扦插、器官發(fā)生、體細胞胚發(fā)生等再生途徑。國內(nèi)木蘭科植物的組織培養(yǎng)中無菌短枝扦插途徑研究較多。雖然木蘭屬(Magnolia)和含笑屬(Michelia)的部分種類已經(jīng)建立了完整的再生體系，但種類有限，增殖系數(shù)低、褐化及生根困難等技術難題仍未得到解決；其他如木蓮屬(Manglietia)、擬單性木蘭屬(Parakmeria)等僅見個別種有研究，且大多處于初步探索階段。

1.1 無菌體系的建立

外植體的選擇、取材時間、處理方式、消毒方式是影響無菌體系建立的幾個關鍵因素。

木蘭科植物的無菌短枝扦插一般選取莖尖、帶腋芽的幼嫩莖段、頂芽或側芽作為外植體(表1)。由于新生組織內(nèi)含有的病菌以及酚類物質比在自然環(huán)境生長時間較長的植物材料少，因此選取靠近枝條頂端的芽和莖段，這些部位污染率和褐化率相對低，存活率相對高(Maria, 2012；唐軍榮等，2014)。

表 1 木蘭科植物組織培養(yǎng)中無菌短枝扦插途徑Table 1 In vitro shoot propagation in tissue culture of Magnoliaceae plants

續(xù)表1

外植體的取材時間極大程度地影響著組培苗的污染率、褐化率與啟動率，需綜合考慮三者來確定取材時期。一般來說，木蘭科植物夏季(7—8月)取材的外植體褐化嚴重(黃樹軍等，2013)，休眠期(12月至翌年1月)取材的外植體污染率、褐化率相對較低(都婷等，2013；Maria, 2012)，而春季蕾期階段(5月)采集的初代外植體形態(tài)發(fā)生能力強，啟動率較高(Konopkova et al., 2020)。

外植體處理方式不同會影響啟動培養(yǎng)的結果。由于托葉會阻礙嫩芽的營養(yǎng)吸收，外層鱗片影響滅菌效果，因此消毒前去除外層鱗片，消毒后去除托葉的頂芽外植體的啟動速度、啟動率、頂芽長勢均好于對照(唐軍榮等，2014)。此外，寧陽等(2015)研究表明切掉葉柄的莖段外植體較之葉柄已自然掉落的莖段，腋芽萌發(fā)受到抑制且更易褐化。

芽、莖段外植體的消毒均以0.1% HgCl2為佳，滅菌時間要根據(jù)外植體的采集時間、幼嫩程度來確定，休眠期取材的外植體消毒時間應高于生長期取材的，幼嫩的外植體消毒時間應低于成熟的(都婷等，2013)。對于滅菌困難的種類，污染嚴重的可以鑒定其相關內(nèi)生細菌，篩選適宜種類和濃度的抑菌劑添加至培養(yǎng)基中。

1.2 啟動培養(yǎng)

基礎培養(yǎng)基、生長調(diào)節(jié)劑是影響啟動培養(yǎng)的關鍵因素。從表1可以看出，MS培養(yǎng)基是木蘭科植物芽和莖段啟動培養(yǎng)的常用基礎培養(yǎng)基。6-BA的用量對芽的誘導及生長的影響極大，外植體的啟動速度往往隨6-BA濃度的增加而增加(都婷等，2013)，最佳6-BA濃度取決于培養(yǎng)基中蔗糖與氮鹽的比例，6-BA、蔗糖和氮鹽水平不適合會導致褐化(Wojtania et al., 2015)。6-BA的適宜濃度一般為0.5～2 mg·L-1，并與少量的NAA(0.05～0.2 mg·L-1)、IBA(0.05～0.2 mg·L-1)等生長素配合使用(表1)。啟動培養(yǎng)中，一些種類可能存在腋芽活性較低的現(xiàn)象，僅添加6-BA不足以使芽生長，此時需要加入適量的赤霉素(GA3)(0.1～2 mg·L-1)來打破休眠，并刺激芽的生長(Wojtania et al., 2019；Cui et al., 2019)，其作用效果依賴于MS培養(yǎng)基中的蔗糖與氮鹽的比例(Wojtania et al., 2015)。

1.3 增殖培養(yǎng)

基礎培養(yǎng)基、生長調(diào)節(jié)劑同樣是影響增殖培養(yǎng)的關鍵因素。MS培養(yǎng)基是最廣泛用于木蘭科植物增殖培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基(表1)。但是，不同木蘭種和品種的增殖階段對基本培養(yǎng)基組成的要求是基因特異性的(Konopkova et al., 2020)。Sokolov等(2014)研究表明常用于葡萄離體繁殖的VM培養(yǎng)基與常用于核桃、白蠟、榆樹等離體繁殖的DKW培養(yǎng)基能提高一些種類的增殖速率和芽的整體質量，與MS具有相似的作用，在木蘭科植物的增殖階段具有應用前景。

目前，最適合木蘭科植物增殖培養(yǎng)的細胞分裂素是6-BA，對多種木蘭及栽培品種腋芽增殖效果顯著(Parris et al., 2012； Sokolov et al., 2014)，其最佳濃度因基因型的不同而不同，范圍為0.25～5 mg·L-1(Wojtania et al., 2015)。但是，6-BA會導致某些木蘭組培材料玻璃化，降低芽的質量，并抑制生根。MT(meta-Topolin)是一種與6-BA結構相似的細胞分裂素，可以減少木蘭品種‘Ann’玻璃化苗的產(chǎn)生(Parris et al., 2012)。此外，苯基脲類細胞分裂素CPPU是6-BA生物活性的10～100倍且價格低廉，在其他植物的組培中被廣泛用于促進側芽分化與植株生長(孫曉波等，2020)，在木蘭科植物中尚未見應用，可考慮與MT、低劑量的納米碳(馮璐等，2017)等作為6-BA的替代品，應用于木蘭科植物的增殖培養(yǎng)。增殖培養(yǎng)期間，組培苗易褐化，需要注意的是在后期應適當降低6-BA的濃度(Konopkova et al., 2020)且及時轉瓶(周麗華等，2002)。

木蘭科植物外植體的增殖能力具有基因型特異性(Sokolov et al., 2014)，不同基因型的木蘭科植物的增殖分化難易程度不一，在同樣的培養(yǎng)基與生長調(diào)節(jié)劑條件下，二喬玉蘭(Mognolia×sallangiana)的增殖率明顯高于白玉蘭(M.denudata)和紫玉蘭(M.liliflora)(李艷等，2005)，而星花木蘭(M.stellata)腋芽的增殖率高于二喬木蘭(Maria, 2012)。

1.4 生根培養(yǎng)

在木蘭科植物的生根培養(yǎng)過程中，常通過降低無機鹽濃度和調(diào)整基本培養(yǎng)基組成來促進生根，無機鹽含量只需為增殖培養(yǎng)時的一半，即可滿足生根培養(yǎng)所需養(yǎng)分(鄧演文等，2018)。1/2MS 培養(yǎng)基是目前大多數(shù)木蘭科植物選擇的生根培養(yǎng)基。外植體的生根潛力可能受基礎培養(yǎng)基組成的影響較小(Sokolov et al., 2014)，白玉蘭在 1/2MS 培養(yǎng)基以及 1/4MS 培養(yǎng)基中都能生根，兩者的生根率和生根數(shù)差別不大(孟雪，2005)。

生長調(diào)節(jié)劑在根原基形成與生長中起關鍵作用，多數(shù)木蘭科植物需添加生長素才會有較高的生根率，IBA是最常用于木蘭科植物生根培養(yǎng)的生長素(表1)，不同濃度的IBA能夠調(diào)節(jié)產(chǎn)生根系數(shù)量與長度(Kamenicka et al., 2000)。木蘭離體生根明顯依賴于IBA和蔗糖水平，且這兩種水平在不同基因型之間是不同的，玉蘭品種‘Elizabeth’‘Burgundy’‘Spectrum’在含有6 mg·L-1IBA和30 g·L-1蔗糖的1/2MS培養(yǎng)基上生根效果最好(Wojtania et al., 2019)。對于生根困難的種類，則通過改善生根培養(yǎng)的條件和改變生根的方式等技術措施來促進生根(具體方法于文章5.2部分詳述)。

1.5 培養(yǎng)條件

光照、溫度和pH值等培養(yǎng)條件是影響木蘭科植物形態(tài)發(fā)生的重要因素，在木蘭科組織培養(yǎng)中所選擇的蔗糖濃度、pH、培養(yǎng)溫度、光照強度和光照時間相差不大，分別是蔗糖 20～40 g·L-1、pH 5.6 ～ 6.7(木蘭科植物偏好堿性土壤)、培養(yǎng)溫度 23～28 ℃、光照強度 1 000～3 000 lx、光照時間10～16 h·d-1。

相關培養(yǎng)條件在不同培養(yǎng)階段與不同基因型的植物中有所差異，有時需要具體探討。例如，蔗糖是木本植物組織培養(yǎng)中最常用的碳源(Wojtania et al., 2019)，而Kamenicka等(1998)發(fā)現(xiàn)果糖、甘露糖和木糖是二喬玉蘭芽增殖最有效的碳源，其次是蔗糖。培養(yǎng)基中常用的鐵源是硫酸亞鐵(FeSO4)，而Sokolov等(2015)研究表明螯合鐵NaFeEDTA和Fe(III)AC比非螯合鐵FeSO4·7H2O更合適作為廣玉蘭(M.grandiflora)和二喬玉蘭增殖和生根培養(yǎng)基中的鐵源。不同光質可能通過影響相應光受體的活性進而影響激素水平, 從而影響植物的生長發(fā)育。由于紅光可以促進地上部分生長，藍光、遠紅光則可以促進地下部分生長(任桂萍等，2016)，因此可以考慮在啟動和增殖階段使用紅光，在生根階段使用藍光和遠紅光來促進組培苗的生長。

2 器官發(fā)生途徑

木蘭科植物器官發(fā)生途徑的研究目前仍只限于木蘭屬和含笑屬的少量種類，愈傷組織誘導困難及其不定芽分化困難的問題仍沒有得到有效解決。木蘭科植物的器官發(fā)生途徑除個別通過葉片直接分化得到不定芽外(李艷等，2005)，大多通過間接器官再生途徑，先由外植體形成愈傷組織，再由愈傷組織分化為不定芽。

2.1 愈傷組織誘導

木蘭科植物可以通過營養(yǎng)器官(頂芽、莖段、葉片、葉柄)和繁殖器官(花托、花瓣、花藥)等誘導出愈傷組織(表2)。外植體來源不同，愈傷組織的誘導率也會不同。一般來說，頂芽和莖段較易誘導出愈傷組織，且愈傷組織生長狀態(tài)較好。厚樸(M.officinalissubsp.officinalis)不同取材部位的愈傷組織誘導率為莖段>頂芽>葉片(謝燕燕等，2017)；凹葉厚樸(M.officinalissubsp.biloba)外植體脫分化形成愈傷組織的能力大小為頂芽及莖段>雌蕊>花被>雄蕊>托葉>葉柄(劉葉蔓等，2008)。

表 2 木蘭科植物組織培養(yǎng)中器官發(fā)生途徑Table 2 Organogenesis in tissue culture of Magnoliaceae plants

適宜的基本培養(yǎng)基對愈傷組織分化起著關鍵作用。MS培養(yǎng)基和B5培養(yǎng)基最常用于木蘭科植物的愈傷組織誘導(表2)。實驗證明，MS培養(yǎng)基適合大多數(shù)木蘭科植物的多種外植體的愈傷組織誘導。但是，對于個別種類，如厚樸、凹葉厚樸的芽、莖段，以及黃蘭含笑(Micheliachampaca)的葉柄等外植體，MS培養(yǎng)基中NH4+濃度較高，可能會對愈傷組織造成毒害，不利于其分化生長，B5培養(yǎng)基更加適合其愈傷組織誘導(黃樹軍等，2013；Shukla, 2014；謝燕燕等，2017)。

不同生長調(diào)節(jié)劑處理對愈傷組織的誘導率存在明顯差異，并且誘導出愈傷組織的形態(tài)、生長狀態(tài)和色澤等隨生長調(diào)節(jié)劑種類及其配比的不同而不同(何培琦等，2010)。2,4-D(1～5 mg·L-1)和6-BA(1～5 mg·L-1)是木蘭科植物愈傷組織誘導中常用的細胞分裂素(表2)。適宜濃度的2,4-D或6-BA誘導愈傷組織所需時間短且愈傷組織生長良好(黃樹軍等，2013；Shukla，2014)。6-BA與2,4-D或KT同時使用能提高誘導率和愈傷組織的質量。羅在柒等(2010)對紫玉蘭的不同外植體進行愈傷組織誘導，從誘導率和增殖系數(shù)來看，2,4-D 4 mg·L-1+6-BA 1 mg·L-1的組合下誘導效果比較理想；而墨西哥大葉木蘭(Magnoliadealbata)葉片外植體在MS+2,4-D 1.5 mg·L-1+KT 1.5 mg·L-1的培養(yǎng)基上，獲得綠色、致密的愈傷組織(Domínguez et al., 2010)。

在培養(yǎng)條件的選擇中，暗培養(yǎng)比光培養(yǎng)更有利于一些木蘭科植物的愈傷組織的形成和生長。暗培養(yǎng)下的日本厚樸(M.obovata)頂芽外植體比光培養(yǎng)先誘導出愈傷組織，且在相同時間內(nèi)，愈傷組織鮮重增長量大于光培養(yǎng)(付曉云等，2009)。黑暗環(huán)境中厚樸頂芽外植體的愈傷組織誘導率比光照條件下高且產(chǎn)生的愈傷組織形態(tài)結構較好，可能是光照有利于多酚類物質的積累，多酚類物質和酚氧化酶產(chǎn)生的化學反應產(chǎn)生有害的醌類物質，從而導致外植體死亡(何培琦等，2010)。

2.2 愈傷組織的再分化

木蘭科植物的愈傷組織再分化較困難(表2)，很多外植體誘導出的愈傷組織質地松軟或褐化嚴重，最終未能分化成芽。木蘭科植物愈傷組織能否分化出芽器官，與所用的基本培養(yǎng)基有關。吳月燕和袁東明(2001)比較了MS、MS’、1/2MS、GS培養(yǎng)基對樂昌含笑(Micheliachapensis)葉片愈傷組織再分化的影響，結果表明MS’培養(yǎng)基是愈傷組織再分化的最佳培養(yǎng)基。

愈傷組織的再分化受細胞分裂素與生長素的濃度與配比影響。GA3是促使愈傷組織分化為芽的有效途徑，常與分裂素6-BA、2,4-D、KT等配合使用。在MS+6-BA 0.6 mg·L-1+GA30.5 mg·L-1培養(yǎng)基上，天女木蘭(Magnoliasieboldii)嫩莖愈傷組織成功分化成芽(孫銘鴻等，2012)；在MS’+6-BA 1mg·L-1+ GA32 mg·L-1培養(yǎng)基上，樂昌含笑葉片愈傷組織再分化成芽的比率最高(吳月燕和袁東明，2001)。

未來對于木蘭科植物愈傷組織再分化困難的問題，應當探索更多用于誘導愈傷組織的外植體種類，同時致力于抑制愈傷組織的褐化，確保得到的愈傷組織顏色良好，質地緊密；此外，還應進一步探索基本培養(yǎng)基與生長調(diào)節(jié)劑對愈傷組織分化的影響。

3 體細胞胚培養(yǎng)

國內(nèi)對體細胞胚誘導培養(yǎng)的相關研究較少，僅有雜交鵝掌楸(Liriodendron×sinoamericanum)的體細胞胚培養(yǎng)的研究見于報道。陳金慧(2003)以雜交鵝掌楸幼胚為外植體，以蔗糖為滲透劑提高滲透壓，在MS+1～4 mg·L-1培養(yǎng)基上有效誘導出體細胞胚。體胚發(fā)生初期添加 0.1 mg·L-1的磺肽素(PSK)可以提高未成熟胚的脫分化率并能有效改善培養(yǎng)細胞的狀態(tài)；0.5 mg·L-1的PSK能夠促進胚性愈傷組織的形成和增殖(陳金慧等，2013)。1 μmol·L-1的茉莉酸甲酯(MeJA)可以提高雜交鵝掌楸的體胚發(fā)生率和成熟率、降低畸形胚發(fā)生率，2 mg·L-1ABA能夠增強 MeJA 的上述效應(成鐵龍等，2017)。

國外對木蘭科中木蘭屬植物胚狀體的培養(yǎng)研究相對較多。幼胚是木蘭科植物適宜的體胚發(fā)生外植體，弗吉尼亞木蘭 (Magnoliavirginiana)、福來氏木蘭(M.fraseri)、尖頭木蘭(M.acuminata)、金字塔玉蘭(M.pyramata)和北美大葉木蘭(M.macrophylla)、墨西哥大葉木蘭、日本厚樸、黃蘭含笑(Micheliachampaca)都通過未成熟種子成功誘導出體細胞胚(Merkle & Wiecko, 1990; Merkle & Watson, 1993, 1994; Rosas et al., 2006; Kim et al., 2007; Armiyanti, 2012; Park et al., 2012; Cortazar et al., 2020)。

基因型、培養(yǎng)基和發(fā)育時期等是影響體細胞胚發(fā)生的關鍵因素。體細胞胚誘導培養(yǎng)一般選擇在添加一定濃度2,4-D(0.01～1 mg·L-1)的WPM培養(yǎng)基上進行(Armiyanti, 2012; Cortazar et al., 2020)。有機附加物是木蘭科體胚誘導所必需的營養(yǎng)物質，酪蛋白水解物、谷氨酰胺常被添加至誘導培養(yǎng)基中。未成熟種子最佳采集時間為花后3～4周；培養(yǎng)基中添加蔗糖比添加葡萄糖更利于體細胞胚的形成，蔗糖的最適添加量為3%(Kim et al., 2007)。

成功誘導出的體細胞胚往往轉移到無激素的培養(yǎng)基上繼續(xù)萌發(fā)成苗，黃蘭含笑體細胞胚在MS培養(yǎng)基上萌發(fā)率為34%(Armiyanti, 2012)，日本厚樸體細胞胚在1/2MS培養(yǎng)基上萌發(fā)率在80%以上，并形成正常的初生葉和根(Park et al., 2012)。

體細胞胚培養(yǎng)存在的問題是體胚誘導率和分化成苗率都很低，并且成功誘導出的體細胞胚中還有相當一部分是不能發(fā)育成苗的畸形胚(Merkle & Wiecko, 1990; Merkle & Watson, 1993, 1994; Kim et al., 2007)，在今后的研究中還需進一步探索。

4 胚培養(yǎng)

木蘭科植物的胚培養(yǎng)大多是幼胚培養(yǎng)。由于帶種皮的種胚消毒不易徹底，因此接種前必須剝?nèi)シN皮。幼胚滅菌時，相較于帶外種皮與中種皮的種子，只帶內(nèi)種皮的種子污染率更低(徐石等，2008)。0.1% HgCl2消毒醉香含笑(M.macclurei)種胚 6～9 min，能獲得60%～65%無菌且可萌發(fā)的外植體(劉英， 2021)。天女木蘭種子采用75%酒精30 s+NaClO 10 min滅菌效果最佳，存活率達48%(于新杰，2016)。

在基本培養(yǎng)基的選擇方面，B5培養(yǎng)基較為適宜，其含有幼胚生長所需的Ca2+、K+等大量元素和微量元素(杜鳳國等，2006；于新杰，2016)。在植物生長調(diào)節(jié)劑的選擇方面，6-BA顯著影響芽的增殖，6-BA 和 NAA 較 ZT、KT、IBA、2,4-D、IAA更適合白玉蘭幼胚離體培養(yǎng)中的增殖培養(yǎng)。天女木蘭幼胚離體培養(yǎng)的最適增殖培養(yǎng)基是B5+6-BA 2 mg·L-1+NAA 0.04 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1+AC 1 g·L-1，增殖系數(shù)超過3.6(陸秀君等，2008)。適合凹葉厚樸增殖的培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1，增殖系數(shù)可達 6.2(馬英姿等，2014)。由于木蘭科植物種子中酚類物質含量較多且易出現(xiàn)褐化，因此在培養(yǎng)基中往往加入AC(陸秀君等，2008)或 4～8 g·L-1的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)來抑制其褐化(劉英，2021)。

由于木蘭科植物成熟種子休眠期較長，休眠延長了種子的萌發(fā)進程，因此直接利用木蘭科植物成熟種子啟動離體培養(yǎng)的研究相對較少。目前僅見的報道是Sokolov等(2014)對廣玉蘭和二喬玉蘭的研究，具體的做法是先對種子層積處理30 d和90 d后再進行離體培養(yǎng)，其種子萌發(fā)培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg·L-1，萌發(fā)植株生長良好，層積處理后的種子在離體條件下的發(fā)芽率和成活率均好于直接播種。

5 技術難點

5.1 褐化

褐化在木蘭科植物的組培過程中普遍存在，外植體的褐化影響了多種木蘭科植物芽的萌發(fā)、愈傷組織的增殖與分化(劉均利和馬明東，2007；劉葉蔓等，2008)，導致組培效率不高，從而限制了組培苗大規(guī)模的生產(chǎn)(周麗艷等，2008；王歡等，2012)。對于木蘭科植物易褐化的問題，前人通過外植體類型選擇、采條季節(jié)選擇、外植體預處理方式、添加抗氧化劑、暗培養(yǎng)等多種方法加以抑制，并取得了較好的效果。

(1)外植體類型選擇：由于不同外植體中多酚氧化酶(PPO)與酚類物質各異，因此選擇低PPO活性或低酚類含量的外植體可有效降低褐化程度，如天女木蘭的側芽作為外植體，褐化程度較之其他部位要低(徐石等，2008；王歡等，2012)。

(2)采條季節(jié)選擇：植物在不同季節(jié)的代謝活動有強弱，PPO的活性有所不同，如白玉蘭外植體在春、冬兩季取材PPO活性較低且褐化率較低(周麗艷等，2008；王歡等，2012)。

(3)外植體的預處理方式：接種前的預處理包括浸泡外植體與低溫預處理，如在清水中浸泡12 h以上(王奇等，2009)、在1 g·L-1維生素C(VC)或PVP溶液中浸泡4～6 h(王歡等，2012；王倩穎等，2017)、4 ℃低溫預處理5～7 d(朱碧華等，2009)、8 ℃低溫暗培養(yǎng)4 d(劉均利和馬明東，2007)都可以有效減輕褐化。

(4)暗培養(yǎng)：黑暗環(huán)境可以抑制PPO的活性，培養(yǎng)初期一定時間的暗培養(yǎng)可以降低褐化率(周麗艷等，2008；王歡等，2012)。

(5)培養(yǎng)基類型：培養(yǎng)基中NH4+濃度過高可能會導致褐化，如相較于高濃度NH4+的MS培養(yǎng)基，B5培養(yǎng)基降低了天女木蘭外植體的褐化率(王歡等，2012)。

(6)植物生長調(diào)節(jié)劑：6-BA、KT等細胞分裂素既能促進酚類化合物的合成，又能刺激PPO的活性。6-BA對二喬玉蘭的芽中酚類物質的產(chǎn)生具有調(diào)節(jié)作用，隨著6-BA濃度的升高(0.2～1 mg·L-1)，酚類物質含量呈上升趨勢(Wojtania et al., 2015)。

(7)添加抗氧化劑、吸附劑：向培養(yǎng)基中添加適宜濃度的抗氧化劑[如檸檬酸(CA)、VC、硝酸銀(AgNO3)]或吸附劑(如PVP、AC)能有效抑制褐化。CA 通過降低 POD 活性或結合培養(yǎng)基中的金屬離子抑制PPO的活性，防止酶促褐變；AgNO3通過降低MS培養(yǎng)基中易引起酚類物質產(chǎn)生的NH4+來抑制褐變，而AC、PVP則是通過吸附外植體產(chǎn)生的醌類物質來抑制褐變。適宜的抗褐化劑因基因型與外植體種類的不同而異(王倩穎等，2017)，如Na2S2O3、CA對白玉蘭外植體的抑褐效果好于PVP、VC(周麗艷等，2008)，而PVP、VC對天女木蘭外植體抗褐化效果卻更好(王歡等，2012；高紅兵等，2017)。景寧木蘭(Magnoliasinostellata)葉片最佳抗褐化劑為AgNO3，而帶芽莖段和根部的最優(yōu)抗褐化劑為CA(王倩穎等，2017)。由于過高濃度的 PVP和AC會抑制芽的增殖和根的形成(Parris et al., 2012)，因此需要探索抗褐化劑的適宜濃度。一般VC使用的最適濃度為500 mg·L-1，PVP最適濃度為1 000～1 500 mg·L-1，CA最適濃度為300 mg·L-1(高紅兵等，2017)，AC濃度以0.5%為佳(曾宋君等，2000；陸秀君等，2008)。

目前，木蘭科植物組培的褐化問題主要通過在培養(yǎng)基中添加抗褐化劑來抑制，除了上述提到的抗褐化劑外，抗氧化劑一類中的植酸、L-半胱氨酸、甘露醇、血清白蛋白等未見應用于木蘭科植物的組培，可在未來的實驗中嘗試。此外，螯合劑乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)可替代蛋白質與多酚氧化酶類進行螯合，減少酚的氧化作用；PAL抑制劑2-氨基茚滿-2-膦酸(2-aminoindane-2-phosphonic acid，AIP)可以通過抑制苯丙氨酸生物合成來減少褐變(Jones & Saxena, 2013)；表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)可以通過抑制PPO以抑制褐變(Saeleaw et al., 2017)；高劑量的納米碳可以防止褐化現(xiàn)象(馮璐等，2017)。這些不同抗褐化劑對褐化的抑制效果，都將成為未來研究的內(nèi)容。

5.2 生根困難

木本植物組織培養(yǎng)普遍存在生根困難問題，如紫花含笑(Micheliacrassipes)組培苗生根率僅有33%(朱碧華等，2009)，紫玉蘭帶芽莖段組培苗生根率僅有35%(陸秀君等，2009)，玉蘭品種‘Ann’的生根率只有16%(Parris et al., 2012)，而有些種類甚至無法生根，只能進行到增殖培養(yǎng)階段(鄭珂媛，2017；楊梅等，2017；尤潤等，2019)。

基因型、樹種產(chǎn)地、培養(yǎng)條件等都可能是影響生根的因素，前人通過改善生根培養(yǎng)的條件、改變生根的方式等技術措施來促進生根。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度等可以促進生根，如對難以生根的木蘭品種‘黃鳥’可以通過降低其生根培養(yǎng)基中的蔗糖濃度(20 g·L-1)來促進有效生根(Wojtania et al., 2019)；添加低濃度的AC可優(yōu)化生根效果(陳金慧和施季森，2002；Parris et al., 2012)；添加適宜的生根劑如新型植物活性劑DA-6有利于天女木蘭組培苗生根(孫銘鴻等，2012)。對生根類型為誘導生根型的一些木蘭科植物如紫花含笑(宋曉琛等，2014)，可以適當調(diào)整培養(yǎng)基成分，誘導出愈傷組織，從而促進其不定根的形成。改變生根方式，如試管外生根、浸泡生根法是提高生根率的途徑，郭治友等(2008)利用試管外生根將雜交鵝掌楸組培苗的生根率提高至83.3%。此外，間歇浸沒式培養(yǎng)系統(tǒng)是近年來發(fā)展起來的一種植物組織培養(yǎng)系統(tǒng)，較之傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)，具有培養(yǎng)周期短、增殖率高、自動化程度高、培養(yǎng)通量大等特點(張杰等，2020)，利用此系統(tǒng)或可促進生根。

6 研究展望

在我國木蘭科植物的組織培養(yǎng)研究中，無菌短枝扦插途徑的再生體系已相對完善，從滅菌到啟動、增殖、生根的培養(yǎng)基與生長調(diào)節(jié)劑的選擇雖有大量研究，但研究的植物種類有限。頂芽、莖段相較于其他外植體易于獲得且誘導率高，無菌短枝扦插途徑作為木蘭科植物組織培養(yǎng)的主要再生途徑，應考慮將更多具有優(yōu)良特性的野生種質資源納入研究范圍。

器官發(fā)生途徑、體細胞胚發(fā)生途徑研究相對尚淺，器官發(fā)生途徑中選擇的外植體類型有限，其他植物中最常用于誘導愈傷組織的葉片卻因為褐化而難以誘導愈傷，并且僅有極少的種類能誘導愈傷組織再分化為芽。體細胞胚發(fā)生途徑在國內(nèi)鮮有研究，并且存在體胚誘導率和分化成苗率低的問題。此外，木蘭科植物組培中普遍存在褐化與生根困難的技術難題，目前尚未從根源上得到解決，這也限制了組培苗的大批量繁殖。

針對上述問題，未來木蘭科植物的組織培養(yǎng)需圍繞以下幾個方面重點展開研究。(1)全面探索木蘭科不同植物種類的組織培養(yǎng)，特別是木蘭屬、含笑屬以外的種類，通過組培的技術手段，保存更多珍稀瀕危的野生種質資源；對于已經(jīng)建立再生體系的品種，可進一步優(yōu)化再生培養(yǎng)條件，提高再生效率，以備工廠化育苗之需。(2)探索更多種類的外植體的離體再生，嘗試雄蕊、雌蕊、花被、花柱、花托、子房、葉柄、根等不常見的外植體種類。(3)針對增殖系數(shù)普遍較低的問題，可以通過研究增殖期間內(nèi)源激素的變化來確定適宜的外源激素濃度與配比，并考慮環(huán)境因子如溫度和光照對增殖的影響。(4)對于褐化問題，除探討外植體類型與取材時期、預處理方式、不同種類的抗氧化劑、吸附劑對于褐化的抑制效果外，應結合酚類物質、PPO等相關酶的活性測定，鑒定褐化反應的底物，并研究組培褐化的分子調(diào)控機制，進一步揭示褐化機理，從而通過改變相關基因的表達從根源上減少褐化。(5)對于生根困難問題，可以通過改善生根培養(yǎng)的條件、改變生根的方式和添加適宜的生根劑來促進生根，并對生根的組培苗生理生化指標進行分析，在此基礎上進行解剖學觀察，判斷生根類型、研究生根機理。(6)體細胞胚胎培養(yǎng)作為再生途徑之一，可以克服生根困難的問題，但在國內(nèi)卻鮮有研究，應作為未來探索的重點。

在組培技術的應用方面，木蘭科植物中珍稀瀕危的種類眾多，少數(shù)種如景寧木蘭(Magnoliasinostellata)、華木蓮(Manglietiadecidua)等的組織培養(yǎng)雖有初步研究(王倩穎等，2017；尤潤等，2019)，以及結合液滴玻璃化技術低溫保存‘Ashei’木蘭 (Magnoliamacrophyllavar.ashei)離體莖尖的例子(Folgado & Panis, 2019)，但木蘭科更多的瀕危物種的種質資源有待利用組培技術保存。木蘭科中一些種類如厚樸和凹葉厚樸等具有重要的藥用價值，其組織培養(yǎng)和高產(chǎn)細胞系的建立能夠為批量生產(chǎn)中藥材原料藥和厚樸酚類藥物奠定基礎。此外，組培技術還是基因工程技術的基礎，將在木蘭科植物基因功能驗證、品種改良及優(yōu)良新品種選育等方面發(fā)揮更大作用。