謝晨民，金俊飛②

(1. 桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院廣西肝臟損傷與修復(fù)分子醫(yī)學(xué)重點實驗室；2. 桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽胰外科實驗室，廣西 桂林 541001)

1 肝臟缺血再灌注損傷概述

肝臟缺血再灌注損傷(hepatic ischemia reperfusion injur, HIRI)是一種臨床上多見的病理生理現(xiàn)象，常發(fā)生于缺血性休克、腦卒中、外傷、肝切除尤其是多發(fā)于肝移植術(shù)后，可引起肝臟功能異常，進(jìn)一步導(dǎo)致肝臟功能障礙乃至肝衰竭[1]，威脅生命健康。近年來，隨著外科技術(shù)及設(shè)備日益改進(jìn)，肝臟手術(shù)安全性得到一定的提升，但HIRI仍然是影響肝臟圍手術(shù)期并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展、患者治愈或死亡的重要因素，也使其成為亟待解決的臨床問題[2]。因此，研究HIRI的分子機制，找到新的靶點，開發(fā)出新的藥物或方法顯得尤為迫切。

HIRI是指肝組織缺血一段時間后，缺血的肝組織經(jīng)過血流再灌流而導(dǎo)致缺血肝組織進(jìn)一步損傷的病理現(xiàn)象[3]，大多分為肝臟熱缺血與冷缺血損傷兩大類，涉及局部缺血損傷和炎癥介導(dǎo)的再灌注損傷兩個互相關(guān)聯(lián)的階段[4]。首先，當(dāng)缺血發(fā)生時，隨著血液供氧減少，組織器官內(nèi)的氧逐漸耗盡引發(fā)細(xì)胞功能障礙造成細(xì)胞損傷；其次，再灌注時帶來的氧不但沒有使其功能恢復(fù)，反而進(jìn)一步擴大加劇了組織的損傷[5]。

2 肝臟缺血再灌注損傷的機制研究

目前，對HIRI的機制研究多集中在氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等方面[6-7]。在正常生理情況下，細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species， ROS)的產(chǎn)生和消除保持在一個動態(tài)范圍內(nèi)。然而，當(dāng)ROS含量增加或其清除酶活性降低時，平衡就會遭到破壞，過多的ROS會導(dǎo)致線粒體形態(tài)學(xué)和膜通透性的改變，從而破壞線粒體氧化呼吸鏈，抑制氧化磷酸化，致使系統(tǒng)能量代謝的紊亂，甚至破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，抑制蛋白質(zhì)功能，導(dǎo)致DNA斷裂，核酸破壞。有研究結(jié)果表明，在HIRI中，肝細(xì)胞線粒體氧化磷酸化受到抑制，ATP生成減少，細(xì)胞色素氧化功能失調(diào)，抗氧化酶活性降低和ROS增加[8]。ROS生成增多而抗氧化反應(yīng)減弱所產(chǎn)生的不平衡會進(jìn)一步引起肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。同時，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的黃嘌呤氧化酶不斷增加，致使ROS大量形成[9]。過多的ROS不僅本身對細(xì)胞有損傷作用，且可破壞微血管完整性，改變細(xì)胞膜上跨膜離子梯度異常導(dǎo)致細(xì)胞腫脹和Ca2+過載。在生理狀態(tài)下，細(xì)胞膜上Na+/Ca2+交換以平衡細(xì)胞靜息下的低鈣濃度，而缺血再灌注會導(dǎo)致Na+從細(xì)胞內(nèi)排出，細(xì)胞外大量Ca2+進(jìn)細(xì)胞內(nèi)，Na+/Ca2+異常交換引發(fā)胞內(nèi)鈣離子過載，致使細(xì)胞能量代謝障礙和細(xì)胞膜及結(jié)構(gòu)蛋白的分解，有氧氧化減少，缺氧情況下細(xì)胞進(jìn)行厭氧代謝，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)乳酸和酮體等積累過多，進(jìn)而發(fā)生代謝性酸中毒，致使細(xì)胞損傷。

此外，線粒體裂變、自噬和線粒體膜透性運輸孔(mPTPs)是HIRI形成的重要機制。適度的線粒體分裂可以維持線粒體的數(shù)量，使其能夠發(fā)揮更好的功能，而大量的線粒體分裂會導(dǎo)致線粒體碎片的形成，激活凋亡通路，加重IRI[10-11]。肝臟中有多種不同類型的免疫細(xì)胞，肝臟巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的過度炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是HIRI的重要因素。肝損傷的顯著特征是肝臟中巨噬細(xì)胞數(shù)量增加，這是由于血液中單核細(xì)胞的浸潤，并向單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞分化。肝臟巨噬細(xì)胞根據(jù)其表型和功能的不同可分為促進(jìn)炎癥進(jìn)展的M1巨噬細(xì)胞和抑制炎癥進(jìn)展的M2巨噬細(xì)胞。兩者均可調(diào)節(jié)肝臟無菌性炎癥，在觸發(fā)、維持和改善HIRI中發(fā)揮重要作用[12]，參與HIRI的因素還有很多，比如血紅素加氧酶HO-1、一氧化氮合酶[13]等，在HIRI的具體調(diào)控機制方面還有待深入研究。

3 5-羥色胺的生物學(xué)特性概述

5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)，別名血清素，主要由腸嗜鉻細(xì)胞產(chǎn)生[14]。體內(nèi)的5-HT合成主要來自色氨酸，色氨酸通過色氨酸羥化酶(tryptophan hydroxylase，TPH)羥化產(chǎn)生5-羥色氨酸(5-hydroxytryptophan， 5-HTP)，接著在L-芳香族氨基酸脫羧酶的作用下使5-HTP脫羧產(chǎn)生5-HT[15]。5-HT受體家族主要包括5-HT1R、5-HT2R、5-HT3R、5-HT4R、5-HT5R、5-HT6R和5-HT7R，除5-HT3R是陽離子通道，其余的5-HT受體均為G蛋白偶聯(lián)受體超家族的成員[16]。5-HT的7種不同的受體亞型參與調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、增殖，以及細(xì)胞因子的產(chǎn)生和血管舒張。雖然體內(nèi)90%的5-HT由腸道細(xì)胞合成，但是循環(huán)中的5-HT主要儲存于血小板中，因為血小板對5-HT具有高親和力，當(dāng)血液循環(huán)中的血小板通過腸道循環(huán)時會結(jié)合5-HT，導(dǎo)致血小板中存在豐富的5-HT[17]。

4 5-羥色胺在肝細(xì)胞損傷及IRI的作用研究

肝細(xì)胞損傷是所有肝臟疾病的基礎(chǔ)，5-HT通過影響肝細(xì)胞損傷在肝臟疾病過程中發(fā)揮著重要作用。早前研究發(fā)現(xiàn)酒精性肝硬化患者血小板內(nèi)5-HT含量降低。后期研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)5-HT可通過5-HT2R介導(dǎo)肝臟mTOR的激活，加重肝脂肪變性[18]。這可能與5-HT參與代謝酶表達(dá)調(diào)控，影響肝臟能量代謝有關(guān)[19]。另外，5-HT通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激損傷和TGF-β1/Smads信號通路來緩減刀豆蛋白A誘導(dǎo)的肝纖維化[20]。Zhang等[21]研究發(fā)現(xiàn)， 腸道5-HT系統(tǒng)的功能障礙可以導(dǎo)致腸道屏障損傷，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)毒素易位到肝臟，從而促進(jìn)非酒精性脂肪性肝病的發(fā)展。同時，調(diào)節(jié)腸肝神經(jīng)軸和5-HT拮抗劑可改善非酒精性脂肪肝的脂肪和纖維化改變[22]?？傊诙喾N肝細(xì)胞損傷模型中均發(fā)現(xiàn)5-HT在其中發(fā)揮著重要的作用。

IRI本質(zhì)上是一種由細(xì)胞損傷而導(dǎo)致的疾病。近年來，關(guān)于5-HT及其受體在心臟、腦、腸等不同組織的IRI修復(fù)方面有頗多研究。有研究發(fā)現(xiàn)，2、3、5、4′-四羥基二苯乙烯-2-O-beta-D-葡萄糖苷治療大鼠腦IR損傷有效，推測其機制可能是通過激活5-HT/5-HTR途徑，增加5-HT釋放[23]。心經(jīng)穴位電針預(yù)處理可有效減輕急性心肌缺血再灌注損傷(MIRI)大鼠心肌損傷，其中下丘腦外側(cè)區(qū)和小腦頂核中的多巴胺和5-HT可能是重要的物質(zhì)基礎(chǔ)[24]。5-HT1B/1D受體通過抑制谷氨酸(Glu)釋放間接激活了α7煙酸乙酰膽堿(α7-nACh)受體及其對炎癥和氧化應(yīng)激的保護(hù)作用。α7-nACh受體對腸道IR損傷的保護(hù)作用通過5-HT1B/1D受體對Glu釋放的調(diào)節(jié)作用間接激活[25]。還有研究推測舒馬曲坦可能通過激活5-HT1B/1D受體調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，抑制IR誘導(dǎo)的腸道損傷[26]。另外，有研究報告，使用血小板減少癥或血小板藥理學(xué)受損的小鼠建立70%肝切除模型后，肝臟的再生能力受損，說明血小板衍生的5-HT在肝臟切除和再生中起著重要作用[27]。提示5-HT與細(xì)胞損傷修復(fù)有著密切的關(guān)聯(lián)，深入研究5-HT及其受體及其作用機制可能是今后研究IRI的重要突破口。

5 5-羥色胺在肝細(xì)胞損傷與修復(fù)中的機制研究

隨著實驗技術(shù)、基因敲除模式動物發(fā)展，對5-HT與肝組織缺血再灌注損傷也陸續(xù)有些報道。Nocito等[28]證實5-HT可通過調(diào)控細(xì)胞增殖來促進(jìn)缺血后肝臟組織再生及在缺血后組織修復(fù)。同樣，在靶向敲除色胺酸羥化酶-1(tryptophan hydroxylase-1，TPH-1)基因的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，建立肝臟缺血再灌注模型時發(fā)現(xiàn)小鼠的肝再生和組織修復(fù)能力受到一定程度的損傷[27]。通過注射5-HTP，發(fā)現(xiàn)TPH-1-/-小鼠體內(nèi)5-HT濃度上升，肝細(xì)胞再生能力明顯增加，這表明5-HTP可經(jīng)體內(nèi)的氨基酸脫羧酶脫羧產(chǎn)生5-HT，從而促進(jìn)損傷的肝臟細(xì)胞增殖和修復(fù)[29]。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)5-HTP可通過大腦、神經(jīng)調(diào)控參與肝臟再生[14]。另外，5-HT可以影響細(xì)胞周期刺激細(xì)胞有絲分裂。研究證實，在培養(yǎng)的肝細(xì)胞中添加5-HT可以促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，通過胸腺嘧啶核苷標(biāo)記檢測細(xì)胞增殖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)胸腺嘧啶核苷摻入肝細(xì)胞DNA的量隨5-HT劑量依賴性增加，這說明5-HT是有效的促分裂原，可刺激細(xì)胞的有絲分裂，在接近G1/S轉(zhuǎn)變點時可促進(jìn)肝細(xì)胞再生，5-HT可能是DNA合成的輔助因子[29]。Fang等[30]研究報告，5-HT可以通過上調(diào)YAP在L-O2細(xì)胞中的表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞增殖。在YAP-siRNA后可顯著降低5-HT介導(dǎo)的增殖能力，暗示5-HT-pERK-YAP軸在肝臟再生中的作用可能是一個潛在的促進(jìn)再生和損傷修復(fù)的靶點。

5-HT除了影響細(xì)胞周期影響細(xì)胞增殖外，還通過調(diào)控細(xì)胞凋亡通路、細(xì)胞線粒體穩(wěn)態(tài)以減輕IRI。在缺血缺氧條件下，細(xì)胞色素C(cytochrome C， Cyt-C)發(fā)揮著重要作用，細(xì)胞通過線粒體依賴性凋亡途徑，促進(jìn)線粒體釋放凋亡蛋白激活因子-1與Cyt-C，活化下游半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3致使線粒體的形態(tài)學(xué)和生化改變[32]。5-HT通過調(diào)節(jié)線粒體靶標(biāo)Bax和腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)運蛋白-1(ANT-1)的表達(dá)，抑制血清剝奪誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。5-HT通過與磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/Akt和ERK1/2信號通路之間的相互作用，在血清剝奪后阻止Cyt-C釋放和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9和-3激活[33]。并且5-HT在激活A(yù)kt時，觸發(fā)IkB-α的磷酸化從而降解NF-kB核因子，NF-kB抑制劑的激活可以抑制血清剝奪產(chǎn)生的腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)，以維持線粒體通透性[34]。另一方面，5-HT可以減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的活化以及減少ROS的增加，降低JNK磷酸化對線粒體的破壞，降低過氧化應(yīng)激對炎癥因子和HIF-1α的誘導(dǎo)[35]，提示5-HT可能通過多種途徑調(diào)控凋亡等通路，減少缺血再灌注引起的細(xì)胞損傷。這些研究為將來進(jìn)一步闡明5-HT在HIRI中的機制提供依據(jù)。

6 結(jié)語

目前，醫(yī)學(xué)上已經(jīng)使用多種方法來調(diào)控HIRI，包括藥物治療和肝臟調(diào)理、機械灌注等技術(shù)方法，來預(yù)防和緩解HIRI。但HIRI仍然被認(rèn)為是影響術(shù)后死亡率和發(fā)病率的重要因素。當(dāng)前對HIRI機制尚未明確，研發(fā)預(yù)防和治療HIRI的藥物是有效解決該難題的途徑之一。而發(fā)現(xiàn)5-HT可減少IRI后細(xì)胞線粒體損傷，調(diào)控細(xì)胞周期促進(jìn)肝細(xì)胞再生，有望成為緩解HIRI的突破口。但5-HT促進(jìn)肝臟或肝細(xì)胞修復(fù)的具體分子機制仍需進(jìn)一步研究。