吳思友，何斌，祝紫蘭，梁寧唐小勇

1遵義醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院（遵義市第一人民醫(yī)院）骨科，貴州 遵義 563000；2遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院整形燒傷科；3遵義市紅花崗區(qū)人民醫(yī)院骨科

骨質(zhì)疏松癥（OP）是由多種原因致使骨密度和骨量降低，骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨脆性增加，從而導致骨折的全身退行性骨?。?］。OP發(fā)病的主要機制是成骨細胞的骨形成和破骨細胞骨吸收之間的不平衡；另外，骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）的數(shù)量減少和功能衰退亦是導致OP形成機制之一［2］。目前，治療OP藥物主要分為抗吸收、成骨和同時具備雙重藥理作用的藥物，但因藥物不良反應而治療效果欠佳［3］。BMSCs是一種具有自我更新、多向分化潛能的細胞，其多能性成為干細胞治療的基礎(chǔ)；在特定條件下具有向成骨細胞分化的能力，并進一步有益于誘導骨形成［4］。研究表明，BMSCs具有治療與年齡進展相關(guān)退行性疾病的潛力，BMSCs的衰老過程在OP發(fā)生、發(fā)展中起重要作用［5］。細胞外囊泡（EVs）是細胞分泌組成的一部分，通過介導細胞間信使通信傳遞和細胞生物學效應發(fā)揮功能作用。來源于BMSCs的EVs（BMSCs-EVs）生物學特征、功能與BMSCs類似，其中包括組織修復、誘導成骨、促進血管新生和骨礦化聚集作用［6］。因此，BMSCs衍生的EVs在治療OP中發(fā)揮重要作用。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）是骨形成關(guān)鍵信號調(diào)控通路之一，激活PI3K/Akt具有抵抗骨吸收、促進成骨的作用，其在破骨細胞的分化中起重要作用［7］。研究表明，PI3K/Akt信號通路在骨再生、骨重建、骨代謝調(diào)節(jié)中起重要作用［8］。PI3K/Akt信號通路不僅在調(diào)控間充質(zhì)干細胞成骨分化中發(fā)揮作用，而且還是間充質(zhì)干細胞誘導向成骨細胞生長、增殖分化和生存周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)信號。從蛋白質(zhì)表達組學分析方面來說，源自于細胞不同類型EV中可呈現(xiàn)出不同的蛋白質(zhì)表達譜，它們通過調(diào)節(jié)信號通路的效應機制，從而誘導骨形成能力、激活PI3K/Akt信號通路［9］。另有研究表明，源自BMSCs的EVs可能通過IL-1β下調(diào)來激活PI3K/Akt信號通路，從而影響成骨細胞分化。由此，BMSCs釋放的EVs可能被認為是在骨再生醫(yī)學中充當干細胞療法。從微小核糖核酸（microRNA）分析，富含microRNA的BMSCs-EVs被HUVECs內(nèi)吞，從而抑制PTEN表達并激活PI3K/Akt通路，促進HUVEC增殖分化、遷移歸巢和血管新生，最終誘導新骨生成，促進骨再生，因而來自BMSCs衍生EVs的microRNA通過激活PI3K/Akt信號通路在骨再生、血管生成中發(fā)揮重要功能［11］。現(xiàn)就OP中EVs通過PI3K/Akt信號通路促進成骨分化的研究進展綜述如下。

1 BMSCs-EVs的結(jié)構(gòu)特性及功能

1.1 BMSCs-EVs的特征EVs是幾乎所有活細胞分泌的納米級膜囊泡，質(zhì)膜通過出芽或細胞內(nèi)吞作用運輸途徑形成，EVs通常分為多個類別，最常見的分類據(jù)直徑大小分為三類：外泌體（40～100 nm）、微泡（MV；100～1 000 nm）和凋亡小體（50～5 000 nm）［12］，EVs富含大量蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸（mRNA、ncRNA和DNA）等生物活性分子，能快速將細胞間信使傳遞到鄰近細胞或?qū)⑵鋽y帶轉(zhuǎn)移到遠處的靶細胞，從而調(diào)節(jié)受體細胞的各種生理和病理過程。EVs通過在細胞之間相互轉(zhuǎn)移生物活性內(nèi)容物，通過細胞間通信信息表達聯(lián)合EVs的骨代謝和骨再生作用，在OP發(fā)病機制數(shù)量和功能代謝中發(fā)揮重要作用［13］，EVs一旦與成骨細胞膜上表達的RANKL相結(jié)合，激發(fā)骨形成相關(guān)信號通路，誘導成骨樣細胞和骨鈣結(jié)節(jié)沉積能在間充質(zhì)干細胞上刺激成骨分化。

研究表明，BMSCs-EVs中含有許多蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、信使RNA和microRNA等生物活性分子，在不同的生物學過程中發(fā)揮重要作用。還可穩(wěn)定表達識別EVs蛋白的特異性表面標志物，即CD9、CD63、CD81，BMSCs-EVs具有獨特優(yōu)點［14］，如快速傳遞性、無免疫原性、內(nèi)在歸巢效應、無致癌性、無倫理爭議、易獲取和儲藏等，其在多種骨骼肌肉系統(tǒng)疾病中具有巨大治療潛力。BMSCs-EVs具有誘導成骨、促進骨再生、血管生成和骨礦化作用，BMSCs-EVs的無細胞療法是一種有前景的骨再生方式。然而，BMSCs-EVs的骨代謝研究仍處于早期階段。據(jù)報道，MSC-EVs可通過增強成骨細胞的活性和促進血管生成來誘導新骨形成，尤其是在OP治療方面的潛力，從RNA或蛋白質(zhì)角度分析，有未經(jīng)修飾的RNA及蛋白表達的MSC-EVs僅顯現(xiàn)出中等治療效果，修飾的RNA及蛋白表達的MSC-EVs顯現(xiàn)出較好治療效果，由此可見，富含RNA或蛋白質(zhì)的基因治療技術(shù)工程MSCs可能會增強MSC-EVs的成骨能力來誘導新骨形成［15］。因此，應用含有RNA或蛋白質(zhì)的BMSCs-EVs具有明顯促進成骨的特性。

1.2 BMSCs-EVs的功能MSCs能分泌多種EVs以保持組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)維持正常的功能，MSC-EVs攜帶大量核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，以及豐富的miRNA，可將這些生物活性分子快速輸送到受體細胞中，從而使MSC-EVs在無細胞治療中得到合理應用［16］。從BMSCs-EVs的miRNA方面分析，蘊含BMSCs-EVs的多種miRNA（如miR-27a）可能通過Wnt/β-catenin信號通路傳導修飾BMSCs-EVs中的特定miRNA來調(diào)節(jié)成骨細胞分化，有效激活Wnt/β-catenin以促進骨形成［17］。由于BMSC-EVs富含多種miRNAs，不同miRNAs之間可能存在復雜的相互調(diào)節(jié)影響。據(jù)報道，MSC-EVs可通過增加骨形成、減少骨髓脂肪堆積和骨吸收來防止OP的骨丟失并維持骨強度，同時BMSCs-EVs含有更多的促分化和趨化蛋白，它們能促進骨和軟骨組織的生長，為靶向治療應用選擇合適的EVs種屬和供體的重要性，從蛋白質(zhì)含量和功能作用方面呈現(xiàn)出不同的特征［18］。OP病理機制改變細胞的EVs不同地影響B(tài)MSC衰老代謝和骨形成方面的成骨標志物表達。因此，不應忽略組織或細胞微環(huán)境，因為它們可能會抵抗EVs治療的預期效果。此外，我們認為細胞的種屬和供體的年齡是重要因素，應用MSC衍生的EVs可能有利于治療年齡相關(guān)的骨代謝性疾?。?9］。近年來，BMSCs-EVs已被作為納米載體用于慢性骨病研究中，BMSCs-EVs的蛋白表達譜分析顯示，適當修飾BMSCs中的功能蛋白，使其富含內(nèi)源性活性分子的BMSCs-EVs蛋白表達，從而促進成骨或抑制破骨細胞生成［20］。盡管BMSCs-EVs在治療骨代謝疾病中具有巨大潛力，但仍有不足之處，如BMSCs-EVs的純化、質(zhì)量、鑒定、運輸、半衰期和長期安全性等。

1.3 BMSCs-EVs的作用

1.3.1 促進成骨分化、骨重建、骨礦化BMSCs和破骨細胞在內(nèi)的多種細胞分泌的EVs以及向成骨細胞運輸microRNAs可調(diào)節(jié)骨形成，BMSCs衍生的EVs可以修復、改善BMSCs功能，其中外泌體和微泡是最常用的EVs類別，它們通過將包括核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)在內(nèi)的生物活性分子轉(zhuǎn)移到靶細胞中，進一步調(diào)節(jié)其細胞旁分泌作用，由于MSCs對骨再生的促進作用，MSCs的EVs亦具有促進骨形成的作用［21］。另BMSCs-EVs已被證明可攜帶成骨相關(guān)的基因，從而調(diào)節(jié)BMSCs的成骨分化和礦化功能，BMSC-EV-miRNAs（miR-29b-3p、miR-20a）通過靶向調(diào)節(jié)促進BMSCs的成骨分化，BMSCs-EVs可能通過多個關(guān)鍵的miRNA調(diào)節(jié)BMP/Smad信號傳導來影響成骨分化。從蛋白組學方面分析，BMSCs-EVs可上調(diào)影響Wnt1和β-catenin的蛋白表達，從而促進BMSCs的成骨分化［6］。

1.3.2 促進新生血管生成EVs在體外和體內(nèi)均具有增強促血管生成的作用，進而誘導成骨，針對EVs的促血管生成作用的機制以及調(diào)節(jié)EV在供體細胞中的機制及其不清，然而MSCs分泌的EVs在體外對HUVECs具有強烈的促血管生成作用［22］，BMSCs衍生的EVs通過加速促進血管生成作用，從而促進骨再生。

2 BMSCs-EVs通過PI3K/Akt信號通路調(diào)節(jié)骨形成的機制

PI3K/Akt信號通路傳導關(guān)鍵核心是絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt，是運輸細胞表面受體生長和存活信號的通道，PI3Ks是PI3K/Akt信號通路上游的關(guān)鍵元件。Akt活化中的膜易位由PH結(jié)構(gòu)域介導，催化結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)包括一個ATP結(jié)合位點和一個蘇氨酸殘基Thr308位點，這是Akt活化所必需的磷酸化位點。C端調(diào)控區(qū)域由40個氨基酸組成，包含一個疏水區(qū)，其中包含激活Akt的第二個磷酸化位點，即絲氨酸殘基Ser473。主要參與細胞增殖、存活、血管生成和腫瘤細胞侵襲的作用［23］。因此，PKB/Akt信號通路是調(diào)節(jié)細胞生長、增殖、代謝和存活的核心信號通路之一，PI3K/Akt信號通路通過激活參與細胞周期轉(zhuǎn)換和細胞增殖的下游效應器在許多生理過程中發(fā)揮重要作用。在細胞受到不同外界刺激，如生長因子、細胞因子和激素可以誘導PI3K的活性［24］，另外，G蛋白偶聯(lián)受體也可激活PI3K。PI3K及其下游靶標蛋白激酶B或Akt在細胞存活、增殖、分化、遷移和代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

2.1 PI3K/Akt信號通路調(diào)控骨形成許多骨骼肌肉系統(tǒng)中調(diào)節(jié)骨再生、骨重建、骨代謝過程的關(guān)鍵信號通路之一是PI3K/Akt通路，該通路被證明與成骨細胞的生長、增殖和分化有關(guān)。其中PI3K是一種異二聚酶，是骨吸收和骨形成的關(guān)鍵因素；一旦PI3K被磷酸化，就會激活Akt，PI3K/Akt亦參與成骨細胞生長分化功能和骨骼發(fā)育，如Akt1的全身丟失會導致骨量減少，這可能與加速細胞凋亡和成骨細胞分化功能減退有關(guān)［25］，PI3K/Akt信號傳導涉及多種細胞類型的生長、增殖、分化過程。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號通路在成骨細胞分化和骨組織代謝中起重要作用，當激活PI3K/Akt信號通路可引起骨組織相關(guān)信號分子的一系列變化，如促進成骨分化標志物堿性磷酸酶（ALP）的表達［26］。

2.2 PI3K/Akt信號通路調(diào)控BMSC分泌的EVs促進成骨分化PI3K/Akt作為骨骼肌肉系統(tǒng)疾病重要的骨代謝調(diào)節(jié)劑，能從根本上誘導骨形成。miRNA在MSC衍生的EV中對B淋巴細胞的免疫調(diào)節(jié)特性的功能，運用這些特異性miRNA可以調(diào)節(jié)激活PI3K-Akt信號通路，其也是MSC衍生的EV攜帶miRNA治療后常見受損的信號通路之一［27］。從BMSCs-EVs的RNA測序?qū)用嫔戏治?，可見相關(guān)成骨基因表達上調(diào)，這可能與激活PI3K/Akt信號通路相關(guān)，與microRNA分析結(jié)果達成一致。上述研究表明，miR-21、miR-29、miR-221和let-7a在MSC-EVs與BMP和PI3K/Akt信號通路相關(guān)，RNA生物信息測序證明了PI3K/Akt信號通路可能是骨重塑調(diào)控分子靶點，僅限于發(fā)生在骨骼和肌肉系統(tǒng)疾病中［28］。由此可知，PI3K/Akt信號通路與BMSCs-EVs的相關(guān)性，在OP治療中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，BMSCs-EVs通過PI3K/Akt信號通路促進成骨分化，BMSCs-EVs目前仍處于早期研究階段，尤其在骨科方向研究相對較少，其在骨代謝疾病OP的作用與機制的研究仍較少，且與PI3K/Akt信號通路通過促進成骨影響發(fā)病機制的研究較少。BMSCs-EVs的治療研究僅局限于基礎(chǔ)研究實驗上，雖已證明其能促進骨再生，但如何將其有效地應用于臨床中OP患者的治療仍面臨許多困擾，需進一步開展更多臨床試驗。研究雖證實在促進成骨分化過程中，BMSCs-EVs與PI3K/Akt信號通路間存在相互聯(lián)系，但目前具體機制仍不明確。