張曉麗 張曉紅 劉宇 沈方臻

據(jù)統(tǒng)計,2020 年全球肺癌新增病例數(shù)達220 萬例,約占癌癥確診病例的11.4%,目前是癌癥死亡的主要原因［1］。小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)約占肺癌的15%,惡性程度高,預(yù)后差［2］。目前研究發(fā)現(xiàn),SCLC 是上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)樣癌癥,可表現(xiàn)為癌細胞中E-鈣黏蛋白表達減少［3］。E-鈣黏蛋白是連接上皮細胞的重要標志蛋白,能夠維持細胞之間的極性狀態(tài),被稱為典型的腫瘤抑制因子［4］。其與N-鈣黏蛋白以及波狀蛋白作為EMT 過程中主要的蛋白標志物,可介入到多種惡性腫瘤的侵襲、擴散、轉(zhuǎn)移的過程中。2003 年Zeller 等［5］研究乳腺癌細胞雜交性丟失時,發(fā)現(xiàn)一種新的抑癌基因——SASH1 基因。隨著近年來對SASH1 蛋白的深入研究發(fā)現(xiàn),SASH1 蛋白參與多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程,其表達的減少或缺失與晚期惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),如肝癌［6］、卵巢癌［7］等。同時,在多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn),SASH1 蛋白與EMT 之間有一定的關(guān)聯(lián)性,如結(jié)腸癌［8］及肝癌［6］等。但在SCLC 中研究較少,本研究選取E-鈣黏蛋白作為EMT 的標志物,就SCLC 中SASH1 蛋白的表達情況及其與E-鈣黏蛋白表達的相關(guān)性展開探討。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2009 年1 月～2018 年12 月在臨沂市腫瘤醫(yī)院經(jīng)過術(shù)后組織病理診斷為SCLC 的石蠟標本50 例?；颊咝g(shù)前均未進行抗腫瘤治療(如放化療),未合并其他惡性腫瘤,不伴有嚴重的基礎(chǔ)疾病。其中男40 例,女10 例；年齡43～77 歲,平均年齡(56.42±9.47)歲；32 例＜60 歲,18 例≥60 歲；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38 例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12 例；術(shù)后病理TNM 分期：Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期分別為10、21、19 例。此研究獲得本院倫理委員會同意。病例信息在本院聯(lián)眾病案數(shù)據(jù)系統(tǒng)中收集。

1.2免疫組化方法 所有手術(shù)標本固定在福爾馬林中,石蠟包埋,將蠟塊進行切片(厚度4 μm),之后經(jīng)過脫蠟、水化處理,檸檬酸鹽溶液進行抗原修復(fù),冷卻至室溫,之后內(nèi)源性過氧化物酶活性應(yīng)用3% H2O2阻斷,并采用10%山羊血清封閉,抗SASH1 多克隆抗體(abcam,ab111901)、E-鈣黏蛋白(中杉金橋,ZM0092)孵育,4℃過夜。之后用辣根過氧化物酶標記山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G 抗體(中杉金橋,ZB2301)孵育,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。細胞核采用蘇木精-伊紅(HE)染色,持續(xù)1 min,然后開始脫水、透明、封片、風(fēng)干過程。實驗過程中選擇PBS 緩沖液取代一抗作為空白對照。

1.3染色結(jié)果判定標準 由兩名經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師進行評估,采用雙盲法,并在100、200、400 倍顯微鏡下觀察圖像,做出評判。SASH1 蛋白、E-鈣黏蛋白表達的判定標準主要分為以下2 個部分：①染色強度水平的測定。染色強度分級：0 分：無明顯染色；1 分：淺黃色；2 分：棕黃色；3 分：棕褐色。②陽性細胞百分比計分。SASH1 蛋白判定標準：0 分：陰性；1 分：＜10%；2 分：10%～50%；3 分：51%～74%；4 分：≥75%。E-鈣黏蛋白判定標準：0 分：＜5%；1 分：5～25%；2 分：26%～50%；3 分：51%～75%；4 分：＞75%。每張切片都經(jīng)過以上兩項評定后,兩數(shù)值相乘。SASH1 蛋白：陰性：＜3 分；陽性：≥3 分。E-鈣黏蛋白：陰性：≤3 分；陽性：＞3 分。

1.4觀察指標 ①SCLC 癌及癌旁組織中SASH1 蛋白和E-鈣黏蛋白的表達情況；②SCLC 癌組織中SASH1蛋白表達的影響因素；③SCLC 癌組織中SASH1 蛋白、E-鈣黏蛋白表達的相關(guān)性。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗；相關(guān)性檢驗采用Spearman 相關(guān)分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1SCLC 癌及癌旁組織中SASH1 蛋白、E-鈣黏蛋白表達情況 ①SCLC 癌及癌旁組織HE 染色結(jié)果。見圖1。②在光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),SASH1 蛋白主要在SCLC 癌及癌旁組織的細胞質(zhì)中表達,在部分細胞核中亦可見表達；E-鈣黏蛋白主要在SCLC 癌及癌旁組織的細胞膜中表達。見圖2。③SCLC 癌組織中SASH1蛋白、E-鈣黏蛋白的陽性表達率分別為44.00%、48.00%,均低于癌旁組織的74.00%、80.00%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.301、11.111,P=0.002、0.001＜0.05)。見表1。

表1 SCLC 癌組織及癌旁組織中SASH1 蛋白、E-鈣黏蛋白的表達情況比較［n(%)］

圖1 SCLC 癌組織及癌旁組織HE 染色結(jié)果

圖2 SCLC 癌旁組織及癌組織中SASH1 蛋白、E-鈣黏蛋白的表達

2.2SCLC 癌組織中SASH1 蛋白表達的影響因素SCLC 伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的SASH1 蛋白陽性表達率為34.21%,不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的SASH1 蛋白陽性表達率為75.00%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；SASH1 蛋白在SCLC 不同TNM 分期(Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期)中的陽性表達率比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 SCLC 癌組織中SASH1 蛋白表達的影響因素［n(%)］

2.3SCLC 癌組織中SASH1 蛋白、E-鈣黏蛋白表達的相關(guān)性分析 經(jīng)Spearman 相關(guān)性分析,SCLC 癌組織中SASH1 蛋白表達水平與E-鈣黏蛋白表達水平呈正相關(guān)(r=0.519,P＜0.05)。見表3。

表3 SCLC 癌組織中SASH1 蛋白、E-鈣黏蛋白表達的相關(guān)性分析

3 討論

SCLC 初診時＞70%的患者已出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移,使得近20 多年來SCLC 患者的5 年生存率未能發(fā)生明顯變化［9］。SASH1 蛋白在多種惡性腫瘤中已有研究,并發(fā)現(xiàn)其可能通過EMT 過程來調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但在SCLC 中研究較少,本研究對此進行探討。

SASH1 基因包含不育-α-基序(SAM)結(jié)構(gòu)域和雞肉瘤病毒同源3(SH3) 結(jié)構(gòu)域［5］。近年來研究發(fā)現(xiàn),SASH1 介入多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,調(diào)控腫瘤細胞的增殖、侵襲及凋亡等過程。本研究觀察到SCLC 患者SASH1蛋白在癌組織中表達較正常組織呈現(xiàn)減弱現(xiàn)象,并且腫瘤分期越晚、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的,其表達水平越趨減低,提示SASH1 蛋白表達水平高低可能與惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移情況有關(guān),這與SASH1 基因可能為抑癌基因的推論相吻合。Martini 等［10］發(fā)現(xiàn)SASH1 可以與肌動蛋白細胞骨架相互作用,刺激細胞基質(zhì)粘附,當SASH1 蛋白表達減少時,勢必會導(dǎo)致細胞基質(zhì)粘附減少,促進遷移的發(fā)生。EMT 是指在惡性腫瘤轉(zhuǎn)移開始時,腫瘤細胞激活原發(fā)腫瘤內(nèi)潛在的胚胎程序,上皮細胞失去粘附連接和上皮極性,并獲得具有侵襲性的間充質(zhì)表型,是癌癥死亡的主要原因。在EMT 過程中,一小部分癌細胞獲得了干細胞特性(CSCs),這促進了腫瘤的長期增殖、耐藥性和轉(zhuǎn)移［11,12］。間充質(zhì)細胞標志物 N-鈣黏蛋白(N-cadherin) 和波形蛋白(vimentin)表達增加,而上皮細胞的特色標志物E-鈣黏蛋白減少,這是EMT 的最具代表性的檢測手段［13-15］。本研究中,SCLC 癌組織中E-鈣黏蛋白的表達較癌旁組織相比呈現(xiàn)減弱趨勢,這符合E-鈣黏蛋白的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。張宇靖等［16］發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌癌組織中E-鈣黏蛋白呈現(xiàn)低表達狀態(tài),其表達水平較正常子宮內(nèi)膜組織中明顯降低,并提出E-鈣黏蛋白表達下調(diào)能夠減弱腫瘤細胞間的粘附作用。本研究發(fā)現(xiàn),SASH1 蛋白、E-鈣黏蛋白在SCLC 中表達呈現(xiàn)正相關(guān)。目前多項研究證明,SASH1 基因可通過影響EMT 的過程來調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。He 等［6］在肝癌研究中發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SASH1 后的HepG2 和HCCLM3 細胞中E-鈣黏蛋白的表達水平較對照組呈現(xiàn)升高趨勢,而在HepG2 中過表達SASH1 后,波狀蛋白和N-鈣黏蛋白的表達水平較對照組明顯減低趨勢?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果,SASH1參與肝細胞癌(HCC)細胞的增殖和侵襲,而這主要通過EMT 過程來調(diào)節(jié)。Franke 等［8］在結(jié)直腸癌中研究發(fā)現(xiàn),SASH1 與信號適配器CRKL 之間存在一定的關(guān)聯(lián)性,可抑制結(jié)直腸癌EMT 過程,進而抑制腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。

SCLC T1～2N0M0者手術(shù)能明顯獲益。本研究所選定病例中,存在Ⅱ期及Ⅲ期的患者,分析原因有：①一些病例沒有明確的術(shù)前病理診斷,屬于非計劃外科手術(shù),術(shù)后病理確定為SCLC；②臨床分期T1～2N0M0的SCLC患者,術(shù)后病理存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。本研究的優(yōu)點是選用了手術(shù)大標本,降低了因活檢小標本導(dǎo)致的腫瘤異質(zhì)性所引起的誤差。缺點是SCLC 早期發(fā)現(xiàn)能手術(shù)切除的病例較少,導(dǎo)致樣本量偏少。在后期的研究中,將進行體外細胞實驗,從基因?qū)用娣治鯯ASH1 在SCLC發(fā)生發(fā)展中的作用,深入探索與SASH1 基因相互作用的分子及作用機制,為SCLC 的診斷與精準治療提供新的思路。