蒲晗旭，張 露，李茂淋,3，陶 烽，王 靜，羅 鵬*，王國(guó)澤*

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與健康學(xué)院，環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550025；2.貴州省食品營(yíng)養(yǎng)與健康工程研究中心，貴陽(yáng) 550025；3.成都大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川成都 610106）

冬蓀，又稱白鬼筆（Phallus impudicus），屬于鬼筆目（Phallales）、鬼筆科（Phllaceae）、鬼筆屬（Phallus），屬于珍稀食藥用真菌[1]，在夏季和秋季主要生長(zhǎng)于樹(shù)林里的腐爛樹(shù)葉堆中，具有獨(dú)特的外觀且達(dá)到成熟期時(shí)會(huì)散發(fā)臭味[2]。Li 等[3]從形態(tài)學(xué)與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)證實(shí)了其是一個(gè)新種，并命名為“冬蓀”。貴州大方冬蓀，是貴州省畢節(jié)市大方縣特產(chǎn)，2016 年11 月04 日，大方冬蓀被批準(zhǔn)為中國(guó)國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品[4]。冬蓀具有極高的藥食兩用價(jià)值[5]。在藥用方面，冬蓀子實(shí)體可入藥，有祛風(fēng)除濕和活血止痛的功效；冬蓀多糖具有保濕、增強(qiáng)免疫等作用[6-7]。而作為食品，冬蓀味道鮮美、口感嫩滑，有著極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。食用菌多糖作為一類分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜的糖類物質(zhì)，由10 個(gè)以上的單糖通過(guò)糖苷鍵等連接構(gòu)成，目前研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)肥胖[8]、血脂異常和二型糖尿病[9]等多種慢性代謝疾病有一定的改善作用。食用菌多糖作為益生元，具有減少體內(nèi)脂肪積累、降低體質(zhì)量、保護(hù)肝臟的功能[10]。此外，大量研究發(fā)現(xiàn)食用菌多糖具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等多種生物活性，如杏鮑菇多糖可促進(jìn)免疫因子的分泌，進(jìn)而加強(qiáng)宿主免疫[11]等。

目前多糖的提取方法很多，有水提醇沉、微波輔助提取、超聲輔助提取、煎煮法、回流提取與膜分離技術(shù)等[12-13]。微波輔助提取選擇性高、操作時(shí)間短、溶劑消耗量少，但設(shè)備泄漏的微波輻射會(huì)給人體造成慢性損傷。煎煮法簡(jiǎn)便易行，能煎出大部分有效成分。尤其適用有效成分能溶于水，對(duì)溫、熱均穩(wěn)定的藥材；但對(duì)有效成分的選擇性差，且雜質(zhì)較多，精制較困難，樣品容易霉變、腐敗變質(zhì)，不易保存。一些不耐熱及揮發(fā)性成分在煎煮過(guò)程中易被破壞，揮發(fā)而損失?；亓魈崛》ㄏ娜軇┥?，回流法由于連續(xù)加熱，浸出液在蒸發(fā)鍋中受熱時(shí)間較長(zhǎng)，故不適用于受熱易破壞的樣品成分浸出。膜分離技術(shù)有效成分損失極少，特別適用于熱敏性物質(zhì)，如抗生素等醫(yī)藥、果汁、酶、蛋白的分離與濃縮；適應(yīng)性強(qiáng)，處理規(guī)模可大可小，可以連續(xù)也可以間隙進(jìn)行，工藝簡(jiǎn)單，操作方便，易于自動(dòng)化；缺點(diǎn)為不能將產(chǎn)品濃縮成干物質(zhì)。水提醇沉法是目前較為常見(jiàn)的食用菌多糖提取方法，試驗(yàn)設(shè)備簡(jiǎn)單，操作容易，準(zhǔn)確度高，成本低廉，一次性投入較小，缺點(diǎn)為耗時(shí)長(zhǎng)，勞動(dòng)強(qiáng)度大，提取效率低，提取過(guò)程中醇使用量大，但多糖是熱敏性物質(zhì)，長(zhǎng)時(shí)間在高溫下會(huì)影響其生物活性。近年來(lái)，超聲技術(shù)提取植物活性成分的研究方法日益興起[14-15]，該提取技術(shù)作為一種物理粉碎過(guò)程，借助超聲波強(qiáng)烈的“空穴作用”，通過(guò)破碎植物細(xì)胞壁、提高細(xì)胞內(nèi)容物穿透性，進(jìn)而釋放更多植物內(nèi)部的有效成分，具有易操作、提取快捷、提取率高等特點(diǎn)[16]。超聲的物理性質(zhì)，可促使植物組織破裂或變形，使中藥有效成分的提取更加充分，與傳統(tǒng)工藝相比，提取率提高50%～500%。與傳統(tǒng)工藝相比，超聲強(qiáng)化提取一般能在24～40min內(nèi)得到理想的提取率，比傳統(tǒng)的中藥提取法縮短2/3 以上，從而提高了原料的處理效率。超聲波提取藥液雜質(zhì)少，有效成分容易分離純化。基于此，本研究擬采用超聲輔助熱水浸提法優(yōu)化冬蓀多糖的提取工藝。

目前貴州省大方縣冬蓀得到了大量的推廣種植，冬蓀采摘過(guò)程中，僅采摘其菌柄以上部分，而大量冬蓀菌托被直接遺留在田間地頭，造成大量的資源損失，而且加重環(huán)境負(fù)擔(dān)。已有研究表明冬蓀菌托中多糖含量很高[17]，因此可將其作為提取多糖的良好來(lái)源。目前對(duì)冬蓀多糖的成分研究多集中在多糖的組成、結(jié)構(gòu)和分子量等方面，而研究對(duì)象多集中在其子實(shí)體（干品、鮮品、菌蓋、菌托、菌柄）和菌絲體[18-20]。本文以冬蓀菌托為研究對(duì)象，采用響應(yīng)面法優(yōu)化冬蓀菌托多糖的提取工藝，以期為冬蓀菌托的產(chǎn)業(yè)鏈開(kāi)發(fā)，冬蓀菌托多糖生物活性研究提供理論基礎(chǔ)?；诖?，本研究擬采用響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化冬蓀菌托多糖的提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冬蓀菌托購(gòu)買(mǎi)于貴州省畢節(jié)市大方縣，經(jīng)反復(fù)清洗，用60 ℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī)烘干至恒質(zhì)量，粉碎后備用。

葡萄糖，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；正丁醇，純度≥99.5%，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；苯酚，純度≥99.0%，重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司；三氯甲烷，純度≥99.0%，重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司；無(wú)水乙醇，純度≥99.7%，重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司；濃硫酸，純度95.0%～98.0%等。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

400A 多功能打粉機(jī)，永市紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司；RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；DZ-3BCⅡ真空干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；SCIENTZ-ⅡD超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技有限公司；multiskan 酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 冬蓀菌托多糖的制備

選擇新鮮冬蓀菌托，洗凈、冷凍烘干，用粉碎機(jī)粉碎，按照液料比27∶1（mL/g）加水溶解，535 W 超聲32 min，熱水浸提，3 500 r/min 離心10 min，去掉沉淀，濃縮上清液，最終使得濃縮后的多糖溶液40 mL 左右，采用Sevag法脫蛋白按照比例（試劑∶濃縮液）=1∶1 進(jìn)行配比，試劑組成為正丁醇∶三氯甲烷=1∶4，加入試劑，快速攪拌10 min 左右，在通風(fēng)櫥里操作，再放到空氣浴振蕩器中震蕩30 min，轉(zhuǎn)速200 r/min，取出樣品，分裝到50 mL 離心管，4 000 r/min、15 min。離心結(jié)束后取出，去除中間蛋白質(zhì)，將多糖溶液與有機(jī)試劑繼續(xù)攪拌混勻，再次振蕩30min，然后離心，去蛋白，重復(fù)3 次，直至中間無(wú)蛋白質(zhì)層出現(xiàn)。加入95%乙醇，置于冰箱4 ℃沉淀過(guò)夜，用80 目的過(guò)濾篩過(guò)濾棄去乙醇溶液，將各樣品放入真空干燥箱，關(guān)閉箱門(mén)用真空干燥箱烘干沉淀物，獲得冬蓀菌托多糖。

1.3.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

本試驗(yàn)采用苯酚-硫酸法檢測(cè)多糖的含量[21-23]。購(gòu)買(mǎi)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，用真空干燥箱將其干燥至恒質(zhì)量，精確稱量200 mg，加入去離子水使其溶解，用100 mL 容量瓶定容，得到2.0 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。使用2.0 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成濃度分別為0、20、40、60、80、100 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別用移液槍吸取200μL，置于2 mL 連蓋圓底離心管中，再各自加入200 μL 5%的苯酚溶液，快速搖勻，緊接著緩慢滴加700 μL 濃硫酸，快速搖勻，80 ℃水浴加熱10 min；冷水浴5 min 使之冷卻至室溫，在490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度值，葡萄糖的吸光度值與濃度之間的回歸方程為y=0.006 9x-0.003，R2=0.999 3，即葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品在0～100 μg/mL 濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

1.3.3 冬蓀菌托多糖含量測(cè)定

按上述方法進(jìn)行樣品溶液多糖含量的測(cè)定，根據(jù)所測(cè)樣品溶液的吸光度值得出冬蓀菌托多糖的含量，按照公式（1）計(jì)算冬蓀菌托多糖的提取得率。

式中，y為多糖提取得率，%；c為溶液中多糖濃度，mg/mL；V為多糖溶液體積，mL；N為多糖溶液稀釋倍數(shù)；m為冬蓀菌托干粉質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

水浴溫度分別設(shè)置為75、80、85、90、95 ℃，超聲功率設(shè)置為350、400、450、500、550 W，超聲時(shí)間設(shè)置為20、25、30、35、40 min，液料比設(shè)置為18∶1、23∶1、28∶1、33∶1、38∶1 mL/g，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

基于單因素試驗(yàn)的結(jié)果，確定冬蓀菌托多糖提取得率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平的中心組合響應(yīng)面試驗(yàn)，對(duì)冬蓀菌托多糖提取方案進(jìn)行優(yōu)化（表1）。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface design

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Design-expert 8.0.6 軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 水浴溫度對(duì)冬蓀菌托多糖提取得率的影響

固定超聲功率550 W、超聲時(shí)間為30 min、液料比為33∶1（mL/g），調(diào)整水浴溫度進(jìn)行冬蓀菌托多糖提取試驗(yàn)。由圖1 可知，隨水浴溫度升高，多糖提取得率先升高后降低，當(dāng)水浴溫度為90 ℃時(shí)，達(dá)最大值（6.321%）。有研究發(fā)現(xiàn)較高溫度會(huì)破壞多糖結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致多糖發(fā)生降解[24]。因此，最佳水浴溫度選擇90 ℃。

圖1 水浴溫度對(duì)冬蓀菌托多糖提取得率的影響Fig.1 Effects of extraction temperatures on the extraction rate of polysaccharide

2.1.2 超聲功率對(duì)冬蓀菌托多糖提取得率的影響

固定水浴溫度為90 ℃、超聲時(shí)間為30 min、液料比為33∶1（mL/g），調(diào)整超聲功率進(jìn)行冬蓀菌托多糖提取試驗(yàn)。由圖2 可知，隨超聲功率的逐漸增大，多糖提取得率先升高后降低，當(dāng)超聲功率達(dá)500 W 時(shí)，多糖提取得率達(dá)最大值，為6.997%。出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能在于超聲功率增大到一定程度后，體系空化作用過(guò)于強(qiáng)烈，分子快速聚積使局部產(chǎn)生高溫，多糖分子因長(zhǎng)時(shí)間受高溫作用而失活，因此多糖提取得率反而減少[26]。故超聲功率選擇500 W。

圖2 超聲功率對(duì)冬蓀菌托多糖提取得率的影響Fig.2 Effects of ultrasonic power on the extraction rate of polysaccharide

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)冬蓀菌托多糖提取得率的影響

固定水浴溫度為90 ℃、超聲功率為500 W、液料比為33∶1（mL/g），改變超聲時(shí)間進(jìn)行冬蓀菌托多糖提取試驗(yàn)。由圖3 可知，隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖提取得率先升高后降低，當(dāng)超聲時(shí)間為30 min 時(shí)達(dá)最大值（6.807%）。超聲波促進(jìn)多糖分子溶出的原理是通過(guò)物理作用破碎細(xì)胞壁，當(dāng)超聲時(shí)間延長(zhǎng)后，因儲(chǔ)蓄了超負(fù)荷的超聲能量，多糖分子的化學(xué)鍵容易斷開(kāi)，多糖失活并析出，致使出現(xiàn)多糖提取得率減少的現(xiàn)象[25]。故確定超聲時(shí)間為30 min。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)冬蓀菌托多糖提取得率的影響Fig.3 Effects of ultrasonic time on the extraction rate of polysaccharide

2.1.4 液料比對(duì)冬蓀菌托多糖提取得率的影響

固定多糖提取條件為水浴溫度90 ℃、超聲功率500 W、超聲時(shí)間30 min，改變液料比進(jìn)行冬蓀菌托多糖提取試驗(yàn)。由圖4 可知，隨液料比的增大，多糖提取得率先升高后降低，當(dāng)液料比為28∶1 時(shí)達(dá)最大值（7.228%）?？赡芤蛉軇┰龆嗪笫钩暡ㄆ扑榧?xì)胞的阻力隨之增大，導(dǎo)致細(xì)胞破碎程度降低[26]，且溶劑過(guò)多，大量雜質(zhì)隨之析出，多糖溶出空間被搶占，致使多糖提取得率反而下降。因此，液料比選擇28∶1。

圖4 液料比對(duì)冬蓀菌托多糖提取得率的影響Fig.4 Effects of liquid-solid ratio on the extraction rate of polysaccharide

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化竹蓀菌托多糖提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

如表2 所示，本試驗(yàn)的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果利用Design-expert 8.0.6 軟件進(jìn)行回歸分析，建立了如下響應(yīng)面回歸方程：冬蓀菌托多糖提取得率Y=7.25+0.47A+0.60B+0.28C+0.24D-0.041AB+0.41AC+0.34AD+0.27BC-0.678D-0.25CD-0.84A2-0.59B2-0.83C2-0.53D2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Arrangement and experimental results of response surface test

由表3 可知，此模型R2=0.951 5，模擬顯著性P＜0.01，失擬項(xiàng)（0.091 9）＞0.01，表明該模型具有較好的穩(wěn)定性，可用該模型對(duì)真實(shí)情況進(jìn)行預(yù)測(cè)。本試驗(yàn)設(shè)置的4個(gè)單因素對(duì)多糖提取得率均有極顯著影響，AC、BD 交互作用對(duì)冬蓀菌托多糖提取得率的影響是極顯著的，AD交互作用對(duì)多糖提取得率影響為顯著，而AB、BC、CD 交互作用對(duì)菌托多糖提取率無(wú)顯著影響。Design-expert 8.0.6 軟件分析表明冬蓀菌托多糖最優(yōu)提取工藝為水浴溫度91.6 ℃，超聲功率535.43 W，超聲時(shí)間31.97 min，液料比26.94∶1（mL/g），多糖提取得率預(yù)測(cè)最高理論值為7.568%。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis results for regression model

2.2.2 因素交互作用分析

圖5（見(jiàn)下頁(yè)）反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響。由圖5a可知，當(dāng)水浴溫度升高及超聲時(shí)間延長(zhǎng)時(shí)，冬蓀菌托多糖提取得率出現(xiàn)先增大后減小的情況，且等高線為橢圓形，表明兩因素的交互作用顯著。而對(duì)于多糖提取得率的影響程度來(lái)說(shuō)，水浴溫度發(fā)生變化導(dǎo)致的影響更為明顯，超聲時(shí)間對(duì)其影響程度相對(duì)較小，即冬蓀菌托多糖提取得率受水浴溫度的影響更大。由圖5b 可知，多糖提取得率隨水浴溫度和液料比升高，出現(xiàn)先增后減的情況，但多糖提取得率在水浴溫度方向的變化較液料比方向的變化更明顯，也表示多糖提取得率受水浴溫度的影響更突出。從圖5c 可知，隨著超聲功率增大和超聲時(shí)間延長(zhǎng)，冬蓀菌托多糖提取得率先提高后減小，但多糖提取得率在超聲功率方向增加程度比在超聲時(shí)間方向增加程度更明顯，說(shuō)明超聲功率對(duì)多糖提取得率的影響比超聲時(shí)間更大。圖e、d、f 依次按此法進(jìn)行分析。由響應(yīng)面圖分析可得出結(jié)論：超聲功率對(duì)多糖提取得率影響最顯著，其次是水浴溫度，而超聲時(shí)間、液料比影響較小。

圖5 兩因素交互作用對(duì)冬蓀菌托多糖提取得率的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface diagram of the interaction of two factors on the extraction yield of polysaccharide from volva of P. impudicus

2.2.3 最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

為便于實(shí)際操作，調(diào)整最佳提取條件為水浴溫度92 ℃、超聲功率535 W、超聲時(shí)間32 min、液料比27∶1（mL/g），經(jīng)進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)，得出多糖提取得率為7.442%，與模擬預(yù)測(cè)值接近。因此利用響應(yīng)面法優(yōu)化冬蓀菌托多糖的提取方法是較為可靠的。

3 討論與結(jié)論

有研究表明冬蓀菌托的多糖含量是冬蓀菌蓋和菌柄的3 倍多，從冬蓀菌托中提取多糖并將其開(kāi)發(fā)為具有生物活性的健康食品不僅解決了冬蓀菌托對(duì)環(huán)境的影響，還實(shí)現(xiàn)了冬蓀的綜合利用，延長(zhǎng)了冬蓀產(chǎn)業(yè)鏈。

本試驗(yàn)采用響應(yīng)面分析方法，得出冬蓀菌托多糖提取的最佳工藝條件為水浴溫度92 ℃、超聲功率535 W、超聲時(shí)間32 min、液料比27∶1（mL/g），此工藝條件下所得冬蓀菌托多糖提取得率為7.442%，與模型理論最大值相近。此工藝可為冬蓀菌托多糖的開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。