姚欣雨，李奉瑾，喬夢茹，張玉萍

先天性心臟病（congenital heart disease，CHD）是指在胚胎發(fā)育時期胎兒心臟及大血管發(fā)育缺陷或停滯導(dǎo)致出生后心血管結(jié)構(gòu)或功能的異常，是胎兒最常見的結(jié)構(gòu)畸形之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，每年約有150 萬CHD 患兒出生[1]，而我國圍生兒CHD 的發(fā)病率為2.9‰[2]。2012 年衛(wèi)生部統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，每年新發(fā)的CHD 對社會造成的經(jīng)濟負擔(dān)可達百億元[3]。CHD類型多樣，包括室間隔缺損、動脈導(dǎo)管未閉、肺動脈狹窄、法洛四聯(lián)癥和二尖瓣閉鎖不全等。其中，部分CHD 可自行閉合或在胎兒出生后進行手術(shù)治療，但超聲發(fā)現(xiàn)的胎兒心臟結(jié)構(gòu)異常往往提示與遺傳性疾病有關(guān)，若其合并染色體或基因異常，出生后可表現(xiàn)為多系統(tǒng)畸形、精神運動異常、生長發(fā)育遲緩、代謝性疾病、智力障礙等，目前臨床上尚無有效的治療措施，即使手術(shù)糾正心臟結(jié)構(gòu)異常也不能獲得正常的生活質(zhì)量。因此，臨床上應(yīng)對產(chǎn)前超聲提示胎兒心臟結(jié)構(gòu)異常的孕婦進行遺傳學(xué)檢測，從而避免遺傳因素所致CHD 患兒的出生。研究表明，染色體異常所致心臟畸形占CHD 患者總數(shù)的30%[4]。現(xiàn)就胎兒CHD 遺傳學(xué)病因的研究進展進行綜述。

1 CHD 與染色體非整倍體異常

21-三體、18-三體和13-三體是與CHD 有關(guān)的常見的染色體非整倍體異常，其中21-三體占52.8%、18-三體占12.8%、13-三體占5.7%[5]。黃杏玲等[6]對181 例CHD 胎兒進行染色體核型分析，檢出11%（20/181）的染色體異常，其中8.3%（15/181）為染色體非整倍體異常，2.2%（4/181）為染色體結(jié)構(gòu)異常，嵌合體占0.5%（1/181）。蔡美英等[7]采用染色體核型分析技術(shù)對325 例產(chǎn)前超聲提示心臟結(jié)構(gòu)畸形的胎兒進行檢測，檢出14.1%（46/325）的染色體異常，其中染色體非整倍體異常占10.1%（33/325），染色體結(jié)構(gòu)異常占2.1%（7/325）。因此，對產(chǎn)前超聲提示心臟畸形的胎兒行染色體核型分析可避免染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)異常所致的CHD 患兒出生。

染色體核型分析技術(shù)是診斷染色體異常的“金標準”，其是通過G 顯帶技術(shù)檢測出染色體的非整倍體異常，不僅可以發(fā)現(xiàn)46 條染色體數(shù)目異常，還可以檢測5 Mb 以上的染色體結(jié)構(gòu)異常，如缺失、倒位、易位、重復(fù)及復(fù)雜多位點變異等。但染色體核型分析技術(shù)依賴細胞培養(yǎng)，實驗周期長，易受實驗技術(shù)條件和制片閱片等影響，不除外細胞培養(yǎng)失敗、顯帶效果不佳等情況而影響結(jié)果，且其分辨率低，5 Mb以下的微缺失、微重復(fù)不能被檢出，從而導(dǎo)致部分染色體微缺失、微重復(fù)的出生缺陷被漏診。

2 CHD 與染色體拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNV）

隨著遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展，諸多研究表明，染色體微缺失、微重復(fù)是引起CHD 為首的多種出生缺陷的主要原因之一。CNV 主要是指基因組中1 kb～3 Mb的DNA 片段的插入、重復(fù)、缺失和倒位等導(dǎo)致的亞顯微水平的結(jié)構(gòu)變異[8]。人類基因組通過非同源末端連接和非等位基因同源重組導(dǎo)致CNV 的發(fā)生。CNV具有遺傳性和高度異質(zhì)性等特點，其通過基因斷裂、基因位置、基因融合和基因劑量等分子機制，導(dǎo)致孟德爾遺傳性疾病或其他復(fù)雜疾病的發(fā)生[9]。

研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)前超聲提示心臟結(jié)構(gòu)畸形、核型分析正常的胎兒中，有3%～10%存在明確致病或可能致病的CNV[10]。吳莉等[11]對65 例染色體核型分析未見異常的心血管畸形胎兒進行檢測，7.69%（5/65）發(fā)現(xiàn)了可能致病或致病性拷貝數(shù)變異（pathogenic copy number variations，pCNV）。Wang 等[12]對602 例CHD胎兒行產(chǎn)前檢測，在517 例染色體核型分析正常的CHD 胎兒中，7.7%（40/517）可檢出pCNV。隨著產(chǎn)前檢測技術(shù)的發(fā)展，染色體微陣列分析技術(shù)（chromosome microarray analysis，CMA）與低深度全基因組測序技術(shù)（copy number variation sequencing，CNV-seq）實現(xiàn)了對產(chǎn)前微缺失、微重復(fù)的檢測。

CMA 又稱為分子核型分析，其基本原理是將正常組與待測組的DNA 分別用不同顏色的熒光標記，并與探針競爭性雜交來獲得定量的拷貝數(shù)測序結(jié)果。CMA 可在全基因組范圍內(nèi)進行染色體檢測，與染色體核型分析相比，其分辨率更高、無需培養(yǎng)細胞，快速準確，可檢測出染色體非整倍體異常，同時，還可以檢出染色體核型分析無法檢測出的微缺失、微重復(fù)[13-14]。2013 年美國婦產(chǎn)科醫(yī)師協(xié)會提出CMA適用于超聲提示胎兒異常并需要進行侵入性產(chǎn)前診斷的情況[15]。2014 年我國發(fā)布《染色體微陣列分析技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用專家共識》提出產(chǎn)前超聲發(fā)現(xiàn)胎兒結(jié)構(gòu)異常可進一步行CMA 檢測[16]。Jansen等[17]的Meta 分析納入了1 131 例產(chǎn)前超聲提示心臟結(jié)構(gòu)畸形并進行遺傳學(xué)檢測的胎兒，結(jié)果顯示在染色體核型分析正常的胎兒中，CMA 可檢出12%的pCNV。Shaffer 等[18]應(yīng)用CMA 對染色體核型分析正常的580 例CHD 胎兒進行檢測，結(jié)果顯示pCNV 的檢出率為7.9%（45/580）。以上結(jié)果均表明，超聲提示心臟異常的胎兒中，即便是在核型分析正常的情況下，CMA 可額外檢測出更多的pCNV。然而，CMA 應(yīng)用于臨床也存在局限性，該技術(shù)費用較高、通量低使其在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用十分受限，且其所使用的芯片探針覆蓋不全面，可能會漏診部分pCNV[19]。

CNV-seq 采用高通量測序技術(shù)（high throughput sequencing，HTS）對DNA 樣本進行低覆蓋度的全基因組測序，并通過比對及分析以檢測出樣本中的CNV[20]。其無需培養(yǎng)細胞、操作簡便、成本低且高通量，可在短時間內(nèi)完成染色體檢測，降低人為的誤差。與經(jīng)典的染色體核型分析對比，CNV-seq 在檢出染色體非整倍體異常的基礎(chǔ)上，還能額外檢測出100 kb 以上的微缺失、微重復(fù)，包括大多數(shù)已知的pCNV。2019 年我國發(fā)布的《低深度全基因組測序技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用專家共識》指出，CNV-seq 可作為首選技術(shù)應(yīng)用于具有產(chǎn)前診斷指征的孕婦[20]。黃杏玲等[6]對181 例CHD 胎兒分別行染色體核型分析及CNV-seq 檢測，核型異常占11%（20/181），核型正常的CHD 胎兒中5.0%（8/161）CNV-seq 可檢出pCNV。鄧新娥等[21]對87 例CHD 胎兒進行檢測，其中染色體核型分析檢出的染色體異常占12.6%（11/87），染色體核型分析正常的胎兒中10.5%（8/76）CNV-seq 額外檢出了pCNV。Richards 等[22]對20 例染色體核型分析正常的CHD 胎兒行CNV-seq 檢測25%（5/20）發(fā)現(xiàn)了pCNV。以上研究均表明超聲提示心臟異常、核型分析正常的胎兒中，CNV-seq 可檢出額外的pCNV。

與CMA 相比，CNV-seq 最低僅需要10～50 ng DNA 樣本，遠低于CMA（200 ng）；CNV-seq 不僅可檢出已知的pCNV，還可發(fā)現(xiàn)CMA 未覆蓋區(qū)域的罕見和新發(fā)的pCNV，具有更高的分辨率。Liang 等[23]通過對72 例臨床樣本檢測發(fā)現(xiàn)，CNV-seq 對于已知pCNV 與CMA 的檢出率一致，還檢測出CMA 未檢出的次級CNV（0.2～0.66 Mb）。Zhu 等[24]對115 例CHD 胎兒羊水分別進行CMA 和CNV-seq 檢測，發(fā)現(xiàn)18.3%的胎兒CHD 與CNV 有關(guān)，結(jié)果顯示CMA與CNV-seq 對CHD 胎兒常見的pCNV 檢出率一致，但CNV-seq 額外檢出4 例存在罕見pCNV。以上研究表明CNV-seq 可檢出CMA 無法檢出的微缺失、微重復(fù)。

與CHD 有關(guān)的常見CNV 有22q11.2、7q11.23、15q11.2、3p25.1、8p23.1、4q22.1、1q21.1 和16p13.11等。其中，最常見的微缺失綜合征為22q11.2 微缺失綜合征（22q11.2 microdeletion syndrome，22q11.2DS），也稱為顎心面綜合征、DiGeorge 綜合征，在人群中的發(fā)病率約為1/4 000～1/2 000，產(chǎn)前超聲提示胎兒心臟結(jié)構(gòu)異常時，其發(fā)生率可達1/100，是由于染色體22q11.2 區(qū)域有0.7～3 Mb 的小片段缺失所致，其臨床表型多樣，且變異程度大，常見的臨床表現(xiàn)是上顎異常、先天性心臟畸形、獨特的顱面特征、學(xué)習(xí)困難、認知缺陷及精神病發(fā)生[25]。據(jù)報道22q11.2DS 患者中約60%～75%患有先天性心臟缺陷[26]，主要表現(xiàn)為圓錐動脈干型或主動脈弓缺損。7q11.23 微缺失綜合征即威廉姆斯綜合征（Williams syndrome），也是與CHD 相關(guān)的常見微缺失綜合征，是由于1.5～1.8 Mb的小片段在染色體7q11.23 區(qū)域缺失所致，其臨床表型多樣，常見表現(xiàn)為生長遲緩、智力缺陷、心臟缺陷、面部畸形、高鈣血癥及多動癥等[27]。因此，當產(chǎn)前超聲提示胎兒心臟畸形，染色體核型分析正常，往往可能患有某種遺傳綜合征，應(yīng)對其行CNV-seq 檢測，以避免pCNV 的CHD 患兒出生。

3 CHD 與單基因遺傳病

雖然染色體核型分析技術(shù)聯(lián)合CNV-seq 或CMA 大大提高了染色體異常所致CHD 的檢出率，但仍有部分CHD 病因未明。隨著產(chǎn)前檢測技術(shù)的發(fā)展，產(chǎn)前全外顯子測序（whole exome sequencing，WES）技術(shù)帶來了新的思考。WES 是利用探針捕獲或擴增技術(shù)對全基因組外顯子區(qū)域進行高通量測序的方法。外顯子是指在表達過程中能編碼蛋白質(zhì)的真核生物的核苷酸序列，約占基因組DNA 的1.5%[28]，包含約22 000 個基因，但卻包含約85%的已知疾病的相關(guān)變異[29]，外顯子突變被證明是大多數(shù)單基因遺傳病的致病原因[30]。

CHD 是最常見的單基因遺傳病之一，經(jīng)各類研究證實，WES 發(fā)現(xiàn)NKX2.5、TBX5、GATA4 和ZIC3基因與CHD 有關(guān)[31-33]。WES 技術(shù)最早應(yīng)用于兒科，在核型分析及CMA 均正常的CHD 患兒中，WES 可檢出額外的致病基因。McElhinney 等[34]對608 例CHD患兒行WES 發(fā)現(xiàn)18 例患兒NKX2-5 突變。王珊珊等[35]對62 例房間隔缺損患兒行WES 發(fā)現(xiàn)1 例患兒存在TBX5 基因突變。WES 可通過對大多數(shù)樣本編碼區(qū)信息進行研究，檢出易感病基因位點、致病基因及影響人類發(fā)育的新的候選基因。隨后，WES 逐漸應(yīng)用于超聲提示結(jié)構(gòu)異常的胎兒產(chǎn)前遺傳學(xué)診斷。Best 等[36]對1 例復(fù)雜心臟畸形的胎兒行WES 發(fā)現(xiàn)MAP4K4 基因突變。有研究報道，WES 對出生缺陷的診斷率為30%，遠高于核型分析聯(lián)合CMA 的診斷率（10%）[37]。因此，應(yīng)對超聲提示心臟結(jié)構(gòu)異常且染色體核型分析與CNV 均正常的胎兒行WES，避免致病基因所致CHD 患兒的出生。

然而，將WES 應(yīng)用于產(chǎn)前診斷也有一定的挑戰(zhàn)：產(chǎn)前標本大多來源于羊水，不除外母源性污染；WES 對致病性的判別需依據(jù)臨床表型、先證者和家系，而產(chǎn)前胎兒表型獲取受限，可能造成誤判；WES數(shù)據(jù)庫大多來源于患兒與成人，缺乏產(chǎn)前胎兒的表型與有效信息的數(shù)據(jù)庫；其檢測時間較長，可能會延誤妊娠中晚期孕婦終止妊娠的時間。此外，WES 還可檢出臨床意義不明的基因突變，當檢測出的基因沒有臨床報道時，很難預(yù)估其臨床表型與預(yù)后，給臨床咨詢帶來了困難。

4 結(jié)語與展望

CHD 為各類出生缺陷患兒疾病之首，其發(fā)病率呈逐年遞增趨勢，隨著染色體核型分析技術(shù)、CMA及CNV-seq 逐步應(yīng)用于產(chǎn)前診斷，CHD 中染色體異常的檢出率大大提高，但仍有部分CHD 病因未明，產(chǎn)前WES 可檢出與CHD 有關(guān)的致病基因?！短和怙@子組檢測技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用指南》于2020年由美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會（ACMG）發(fā)布，它提出對于超聲提示胎兒結(jié)構(gòu)異常但核型分析及CNV 檢測均為陰性時，WES 技術(shù)可作為補充檢測。國際婦產(chǎn)科超聲協(xié)會（ISUOG）指出孕15～18 周可明顯觀察到胎兒的心臟畸形，因此，可以推薦孕婦在孕15～18 周行胎兒超聲心動圖，為產(chǎn)前診斷爭取足夠的時間。對于超聲提示胎兒心臟畸形的孕婦，將染色體核型分析、CNV-seq 或CMA 及WES 技術(shù)合理聯(lián)用，優(yōu)勢互補。隨著基因組學(xué)的快速發(fā)展，WES可發(fā)現(xiàn)與CHD 有關(guān)的新的致病基因，從而為產(chǎn)婦提供更詳細的咨詢，擬定妊娠及治療方案。同時，WES檢測還有利于進一步完善基因型及表型數(shù)據(jù)庫，為產(chǎn)前診斷胎兒CHD 提供更好的服務(wù)。