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奶牛乳脂代謝關(guān)鍵miRNAs的篩選及鑒定

2023-01-03 02:28劉佳敏禹保軍馮小芳顧亞玲
畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào) 2022年12期
關(guān)鍵詞:荷斯坦乳脂奶牛

劉佳敏,禹保軍,母 童,張 迪,馮小芳,張 娟,王 影,溫 萬(wàn),顧亞玲*

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院,銀川 750021;2. 寧夏回族自治區(qū)反芻動(dòng)物分子細(xì)胞育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,銀川 750021;3.寧夏畜牧工作站,銀川 750002)

牛乳中富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),蛋白質(zhì)、脂肪、微量元素以及多種維生素是人體必不可少的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源,其中脂肪和蛋白質(zhì)含量是評(píng)價(jià)乳品質(zhì)的重要參考因素,產(chǎn)奶性狀亦是奶牛育種的主要目標(biāo)[1]。近年來(lái)在科學(xué)育種及飼喂下,奶牛產(chǎn)奶量已大幅提高,但乳脂率增長(zhǎng)甚微。甘油三酯、膽固醇和游離脂肪酸是構(gòu)成乳脂的主要成分,乳脂是乳的重要組成部分,在乳品質(zhì)評(píng)價(jià)中起到?jīng)Q定性作用。奶牛生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中乳脂合成代謝受多因素的影響,其性狀表現(xiàn)與遺傳因素密切相關(guān),受到多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)[2]。而目前對(duì)于奶牛乳脂代謝分子機(jī)制的相關(guān)研究還十分欠缺,尤其是對(duì)高低乳脂荷斯坦奶牛乳脂合成的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制方面的研究。因此,利用分子遺傳學(xué)理論和技術(shù)方法研究影響奶牛乳脂性狀的調(diào)控因子,以期獲得調(diào)控奶牛乳脂率的關(guān)鍵mRNA和miRNA并驗(yàn)證其生物學(xué)功能,通過(guò)遺傳育種手段提高奶牛的泌乳性能,對(duì)于奶牛的育種工作具有重要意義。

非編碼RNA(ncRNA)作為基因表達(dá)的一種重要調(diào)控因子,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的多個(gè)領(lǐng)域被廣泛研究。其中,microRNAs(miRNAs)是一類長(zhǎng)度約22 nt左右的內(nèi)源性小非編碼RNA,通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)方式與mRNA非編碼區(qū)結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合,調(diào)控靶基因降解或抑制轉(zhuǎn)錄后翻譯過(guò)程,從而調(diào)控基因的表達(dá)[3]。已有研究闡明,乳脂合成的主要方式包括脂肪酸從頭合成和血液中長(zhǎng)鏈脂肪酸的攝取[4]。隨著生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,已挖掘出一系列調(diào)控乳脂合成代謝的主效基因與轉(zhuǎn)錄因子。在調(diào)控乳脂代謝方面,催乳素作為泌乳的關(guān)鍵激素可以促進(jìn)miRNA-23a、miRNA-27b、miRNA-103和miRNA-200a表達(dá),而且miRNA-200a過(guò)表達(dá)后可以抑制脂滴形成相關(guān)基因的表達(dá)[5]。microRNA-193a-5p[6]和bta-miR-34b[7]均會(huì)降低甘油三酯和不飽和脂肪酸含量,證實(shí)在脂質(zhì)代謝中的關(guān)鍵作用。在調(diào)控乳脂合成方面,過(guò)表達(dá)bta-miR-125a[8]和miR-103[9]能夠促進(jìn)乳脂合成相關(guān)基因的表達(dá),增加甘油三酯的積累、脂滴的形成和不飽和脂肪酸的比例。此外,miRNA作為生物性狀功能發(fā)揮重要的轉(zhuǎn)錄因子,可以影響乳腺上皮細(xì)胞中的脂質(zhì)含量[10],也可以通過(guò)多種代謝通路的調(diào)節(jié)促進(jìn)甘油三酯和膽固醇的合成,是闡明乳脂性狀表現(xiàn)的關(guān)鍵特征分子[8,11]。

本研究篩選乳脂率具有極端差異的荷斯坦奶牛,基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序鑒定高低乳脂荷斯坦奶牛乳腺上皮細(xì)胞(bovine mammary epithelial cells, BMECs)中乳脂代謝的關(guān)鍵miRNA。通過(guò)miRNA-mRNA關(guān)聯(lián)分析確定互作網(wǎng)絡(luò)中的核心差異表達(dá)miRNA和mRNA,并驗(yàn)證其在高低乳脂荷斯坦奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)量,分析其與乳脂率的相關(guān)性,為從轉(zhuǎn)錄水平探究寧夏地區(qū)荷斯坦奶牛乳脂合成代謝的調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)選取寧夏農(nóng)墾賀蘭山奶業(yè)茂盛牧場(chǎng)的健康中國(guó)荷斯坦奶牛,飼養(yǎng)背景一致(表1),月齡相近,處于泌乳中后期(150~220 d)的第一胎次荷斯坦牛400頭。采集每頭牛早、中、晚班次的乳樣進(jìn)行DHI測(cè)定,篩選體細(xì)胞數(shù)在10萬(wàn)·mL-1以內(nèi),乳脂率具有極端差異的荷斯坦奶牛(表2)[12]各4頭。采集牛奶并裝入50 mL離心管中,將離心管封口并裝入加有溫水的保溫瓶中,保溫瓶溫度始終保持在37 ℃,帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行乳腺上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)[12]。

表1 日糧成分及營(yíng)養(yǎng)成分(以干物質(zhì)為基礎(chǔ))百分比

表2 荷斯坦牛高低乳脂率和SCC

1.2 方法

1.2.1 乳腺上皮細(xì)胞總RNA的提取與質(zhì)量檢測(cè) TRIzol法提取高低乳脂奶牛乳腺上皮細(xì)胞的總RNA。根據(jù)10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳條帶判斷RNA有無(wú)降解和污染(圖1),用分光光度計(jì)和Qubit?RNA分析試劑盒檢測(cè)RNA的濃度和純度,使用RNA Nano 6000檢測(cè)試劑盒在Bioanalyzer 2100系統(tǒng)上檢測(cè)RNA的完整性。乳腺上皮細(xì)胞總RNA的OD值(OD260nm/OD280nm比值)均在1.8~2.2之間,RIN值(完整指數(shù))均大于8.0,說(shuō)明RNA純度和完整性都較好。

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1~8. 依次為樣本H_2190、H_2226、H_2098、H_2137、L_2046、L_2170、L_2034和L_2037M.DL2000 DNA marker; 1-8. The samples H_2190, H_2226, H_2098, H_2137, L_2046, L_2170, L_2034 and L_2037圖1 提取的乳腺上皮細(xì)胞總RNA的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA extracted from mammary epithelial cells

1.2.2 文庫(kù)構(gòu)建與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 乳腺上皮細(xì)胞總RNA提取成功并檢測(cè)合格后,以每個(gè)樣品3 μg總RNA為起始量。由于small RNA的5′端具有完整的磷酸基團(tuán),3′端具有羥基,這個(gè)特殊結(jié)構(gòu)可以直接加接頭,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄cDNA的合成。然后對(duì)cDNA片段純化、PCR擴(kuò)增、PAGE富集篩選目標(biāo)片段、切膠回收獲得cDNA文庫(kù)。庫(kù)檢合格后,通過(guò)Illumina-Hiseq對(duì)不同樣品的cDNA文庫(kù)按照有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求進(jìn)行測(cè)序,由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.2.3 測(cè)序數(shù)據(jù)處理及差異miRNA篩選 測(cè)序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件中包含reads信息及其對(duì)應(yīng)測(cè)序質(zhì)量情況。為了保證數(shù)據(jù)分析的質(zhì)量,需對(duì)Raw data中堿基測(cè)序錯(cuò)誤率(Qphred =-10lg e)、帶接頭、低質(zhì)量的reads進(jìn)行處理,分析Q20,Q30和GC含量,即最后獲得的clean reads質(zhì)量較高。測(cè)序結(jié)果質(zhì)量控制之后,篩選8個(gè)樣品中small RNA(sRNA)的長(zhǎng)度,用bowtie將長(zhǎng)度在18~35 nt的sRNA與牛(Bostaurus)參考基因組進(jìn)行比對(duì)。將比對(duì)上的reads進(jìn)一步匹配miRBase中已有的序列,可得到已知miRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)和長(zhǎng)度等信息。剩下的未匹配的reads借助miRNA前體的發(fā)夾結(jié)構(gòu),使用miREvo和miRdeep2軟件預(yù)測(cè)樣品中novel miRNAs。對(duì)于已知和novel sRNA中的其他各類型RNA,應(yīng)當(dāng)通過(guò)技術(shù)手段注釋并去除。基于高乳脂和低乳脂比較組間有生物學(xué)重復(fù),采用DESeq2分析各差異表達(dá)組合,得到各樣本間基因的表達(dá)水平之后,通過(guò)相關(guān)性分析檢驗(yàn)試驗(yàn)樣本選擇的可靠性及合理性。用TPM歸一化處理已知和新預(yù)測(cè)miRNA的表達(dá)量,以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選比較組間差異表達(dá)miRNA。

1.2.4 差異表達(dá)miRNA靶基因預(yù)測(cè)及功能富集分析 使用miRanda和RNAhybrid預(yù)測(cè)miRNA的靶基因,取其交集即為后續(xù)分析的候選靶基因集合。采用Goseq方法對(duì)差異表達(dá)miRNA的靶基因集合進(jìn)行Gene Ontology分析(http://www.geneontology.org/)。P<0.05的GO條目可認(rèn)為是差異基因顯著富集。基于KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.genome.jp/kegg/)中的Pathway確定候選靶基因參與的主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,以P<0.05為條件確定差異基因顯著富集的KEGG通路。

1.2.5 miRNA-mRNA關(guān)聯(lián)分析 選擇高低乳脂組差異表達(dá)miRNAs靶向的差異表達(dá)mRNAs,使用Cytoscape_v3.7.2軟件構(gòu)建互作網(wǎng)絡(luò)。然后用pearson相關(guān)檢驗(yàn)計(jì)算差異表達(dá)miRNAs及靶mRNAs與乳脂率、乳蛋白率、日產(chǎn)奶量和體細(xì)胞數(shù)之間的相關(guān)性,進(jìn)而確定調(diào)控乳脂率的關(guān)鍵miRNA-mRNA。

1.2.6 差異表達(dá)miRNA和mRNA的RT-qPCR驗(yàn)證 隨機(jī)選擇差異表達(dá)的9個(gè)miRNAs和6個(gè)mRNAs對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。miRNA的引物采用莖環(huán)法設(shè)計(jì),mRNA的引物用Primer6.0軟件設(shè)計(jì)(表3),以U6和GAPDH分別作為miRNA和mRNA的內(nèi)參。使用與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序樣本一致的RNA,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)的說(shuō)明合成cDNA,以cDNA為模板,使用QuantiNovaTMSYBR?Green試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系:上、下游引物各0.5 μL,cDNA 2 μL,2× QuantiNova SYBR Green PCR Master Mix 10 μL,RNAase Free ddH2O補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃變性5 s,退火(退火溫度見(jiàn)表3)30 s,40個(gè)循環(huán),每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。利用 2-ΔΔCt計(jì)算miRNA和mRNA的相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”。

表3 引物信息

2 結(jié) 果

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)評(píng)估及樣品間相關(guān)性分析

荷斯坦奶牛乳腺上皮細(xì)胞樣本8個(gè)small RNA文庫(kù)測(cè)序獲得11 976 914~16 235 680的clean reads,占總raw reads的比例均在97%以上。各個(gè)樣品的測(cè)序錯(cuò)誤率(error rate)均為0.01%,Q20和Q30的比例均在97%和91%以上,堿基GC含量基本相等,堿基組成穩(wěn)定均衡(表4)。高乳脂組和低乳脂組sRNA序列與參考基因組的匹配率均在93%以上。將匹配上的reads與miBase中特定范圍序列進(jìn)行比對(duì)分析,可得到8個(gè)樣本known miRNA共有21 346種、85 152 090個(gè),novel miRNA分別為744、192、316、364、364、245、366和366(表5)。sRNA的序列長(zhǎng)度主要集中在21~24 nt,其中23 nt的sRNA序列比率最高(圖2)。通過(guò)定量分析并用TPM歸一化處理,發(fā)現(xiàn)8個(gè)樣本中只有個(gè)別miRNA表達(dá)量極高,多數(shù)表達(dá)較為集中(圖3A)。為了排除異常樣本帶來(lái)的誤差,計(jì)算評(píng)估樣本間pearson相關(guān)性:R2>0.9(圖3B)。以上結(jié)果表明測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較高,可以用于后續(xù)的差異miRNA分析。

2.2 高低乳脂組奶牛乳腺上皮細(xì)胞差異表達(dá)miRNA篩選

為了探究調(diào)節(jié)奶牛乳脂率的關(guān)鍵因子,在高乳脂組和低乳脂組之間共鑒定了34個(gè)差異表達(dá)miRNAs(上調(diào)16個(gè),下調(diào)18個(gè))(表6,圖4A),其中33個(gè)是已知 miRNAs,1個(gè)新 miRNA。通過(guò)層次聚類分析,進(jìn)一步確定高乳脂組和低乳脂組間差異表達(dá)miRNAs的表達(dá)水平有顯著差異(圖4B)。

表4 原始數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估

表5 sRNA與參考基因組比對(duì)情況

圖2 sRNA片段的長(zhǎng)度分布Fig.2 Length distribution of sRNA fragments

A. miRNAs的TPM分布;B. 樣品間miRNA表達(dá)量相關(guān)性A. TPM distribution of miRNAs; B. Correlation of miRNA expression between samples圖3 miRNA測(cè)序數(shù)據(jù)評(píng)估Fig.3 miRNA sequencing data evaluation

A.差異表達(dá)miRNAs火山圖; B.差異miRNAs表達(dá)譜聚類熱圖A. Volcano map of differentially expressed miRNAs; B. Heat map of clustering of differential miRNAs expression profiles圖4 差異表達(dá)miRNAs鑒定及聚類分析Fig.4 Identification and clustering analysis of differentially expressed miRNAs

2.3 差異表達(dá)miRNAs的 GO和KEGG富集分析

采用miRanda和RNAhybrid兩個(gè)軟件預(yù)測(cè)得到已知miRNA和新miRNA的靶基因,取其交集進(jìn)行GO功能和KEGG通路注釋分析。結(jié)果顯示,靶基因集合顯著富集的GO條目有241個(gè)。在生物學(xué)過(guò)程(biological process,BP)中富集的203個(gè)條目包括細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、單一生物體過(guò)程和細(xì)胞死亡等,分子功能(molecular function,MF)中富集的17個(gè)條目包括激酶結(jié)合、磷酸轉(zhuǎn)移酶活性和腎上腺素受體結(jié)合等,細(xì)胞組分(cellular component,CC)中富集的21個(gè)條目包括細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)等(圖5A)。KEGG通路富集結(jié)果顯示,差異表達(dá)miRNAs的靶基因共富集到272條通路,在15條通路顯著富集。其中TNF信號(hào)傳導(dǎo)途徑、MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑、Ras信號(hào)傳導(dǎo)途徑、Rap1信號(hào)通路、催產(chǎn)素信號(hào)傳導(dǎo)途徑和GnRH信號(hào)傳導(dǎo)途徑等通路(圖5B)與乳脂代謝密切相關(guān)。結(jié)合GO和KEGG分析可發(fā)現(xiàn),奶牛乳脂代謝可能受到多種機(jī)制的調(diào)節(jié),包括信號(hào)分子傳導(dǎo)、能量代謝和激酶活性調(diào)節(jié)。

表6 差異表達(dá)miRNAs

2.4 miRNA-mRNA關(guān)聯(lián)分析

為了確定與乳脂代謝相關(guān)的關(guān)鍵miRNA-mRNA,構(gòu)建差異表達(dá)miRNA與差異表達(dá)靶mRNA的互作網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果共鑒定出16個(gè)miRNA-mRNA互作對(duì)(9個(gè)miRNAs和9個(gè)mRNAs),其中有8個(gè)互作對(duì)具有負(fù)調(diào)控關(guān)系(圖6A)。對(duì)9個(gè)差異靶標(biāo)基因進(jìn)行功能分析發(fā)現(xiàn),主要富集于蛋白激酶A結(jié)合、磷脂酰肌醇磷酸酯酶活性、mRNA分解代謝和胰島素分泌的正向調(diào)節(jié)等多個(gè)生物學(xué)功能(圖6B)。只有一個(gè)基因MTM1顯著富集到磷酸肌醇的代謝和磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng),與甘油三酯和乳脂合成密切相關(guān)。此外,將差異表達(dá)miRNA及靶標(biāo)mRNA與乳脂率進(jìn)行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)miR-1343-3p和MTM1與乳脂率顯著負(fù)相關(guān),miR-370、miR-2285cb和SRRM2與乳脂率顯著正相關(guān)(圖6C)。綜上,可推測(cè)miR-370-MTM1、miR-1343-3p-DIS3L2、miR-2285cb-XLOC-122799和miR-2387-SRRM2是調(diào)控乳脂代謝的關(guān)鍵因子。

A.差異表達(dá)miRNAs與差異靶mRNAs互作網(wǎng)絡(luò);B.差異靶mRNAs功能分析; C.差異miRNA-mRNA與乳成分之間的相關(guān)性A. Interaction network between differentially expressed miRNAs and differential target mRNAs; B. Functional analysis of differential target mRNAs; C. Correlation between differential miRNA-mRNA and milk components圖6 miRNA-mRNA關(guān)聯(lián)分析Fig.6 miRNA-mRNA association analysis

2.5 差異miRNAs與mRNAs的實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

選擇組間差異表達(dá)的9個(gè)miRNAs和6個(gè)mRNAs驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果的可靠性。結(jié)果如圖6所示,miR-20a、miR-18a、miR-2285f、miR-106b和miR-19a在高乳脂組乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)高于低乳脂組,表現(xiàn)為上調(diào),miR-445-3p、miR-1343-3p、miR-224和miR-182表現(xiàn)為下調(diào)。DIS3L2、AKAP13、MTM1、ANO1、CBY1和AKIP1在高乳脂組的乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)低于低乳脂組,均表現(xiàn)為下調(diào)。RT-qPCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果相對(duì)表達(dá)量存在差異,但其調(diào)控方向和表達(dá)模式均一致(圖7、圖8),說(shuō)明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果可靠,可用于后續(xù)功能試驗(yàn)研究。

3 討 論

乳腺上皮細(xì)胞是主要的產(chǎn)乳細(xì)胞,是研究乳脂的重要材料[13-15]。乳是由乳腺上皮細(xì)胞合成并分泌的。乳脂是乳中的重要成分之一,其合成與代謝受到嚴(yán)格的程序性調(diào)控,在生產(chǎn)上受到飼養(yǎng)管理、營(yíng)養(yǎng)、疾病以及遺傳等多個(gè)因素的影響[16]。miRNA作為表觀遺傳調(diào)控研究的熱點(diǎn),在細(xì)胞生長(zhǎng)[17]、增殖[18]、分化[19]和凋亡[18]等多種生物學(xué)過(guò)程中廣泛研究。在產(chǎn)乳性狀方面,miRNA能夠調(diào)控乳腺的發(fā)育[20]、乳腺細(xì)胞的增殖和分化、乳脂代謝[21]及泌乳過(guò)程[22]。因此,本研究選擇乳脂率極端差異的荷斯坦奶牛,從牛奶中分離培養(yǎng)原代乳腺上皮細(xì)胞并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,以miRNA與mRNA的靶向關(guān)系為基礎(chǔ)進(jìn)行分析,進(jìn)而確定寧夏地區(qū)荷斯坦奶牛乳脂的遺傳特性及機(jī)理。

圖7 差異表達(dá)miRNAs的RT-qPCR和RNA-seq定量分析比較Fig.7 Comparison of quantitative analysis of differentially expressed miRNAs by RT-qPCR and RNA-seq

圖8 差異表達(dá)mRNAs的RT-qPCR和RNA-seq定量分析比較Fig.8 Comparison of quantitative analysis of differentially expressed mRNAs by RT-qPCR and RNA-seq

miRNA作為重要的小非編碼調(diào)控因子,可以靶向靶基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)節(jié)其表達(dá),從而影響個(gè)體性狀表現(xiàn)。miR-370作為新型的脂肪生成調(diào)節(jié)劑,在脂質(zhì)代謝中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)miR-370可以顯著抑制脂肪的形成和分化,導(dǎo)致與脂肪形成相關(guān)的基因PPARγ和aP2表達(dá)下調(diào),進(jìn)而使甘油三酯的積累量降低[23]。miR-370-3p通過(guò)靶向Mknk1對(duì)脂肪生成和脂肪酸代謝起著重要調(diào)控作用[24]。miR-197與脂肪也具有調(diào)控關(guān)系,miR-197-3p會(huì)使甘油三酯和膽固醇的水平下降,但lncRNA HCG18-miR-197-3p軸會(huì)增加脂肪積累[25]。根據(jù)miRNA-mRNA互作關(guān)系,確定可能導(dǎo)致相關(guān)基因表達(dá)變化的功能性miRNA[26]。本研究通過(guò)miRNA-mRNA互作分析發(fā)現(xiàn),bta-miR-370、bta-miR-197與ANO1、MTM1、XLOC-122799有調(diào)控關(guān)系,可視化網(wǎng)絡(luò)圖中以上基因與bta-miR-331-3p、bta-miR-2387、bta-miR-1343-3p、bta-miR-2285 s和bta-miR-2285cb互作。因此,推測(cè)以上miRNAs可能通過(guò)靶向靶標(biāo)基因ANO1、MTM1、XLOC-122799、DIS3L2、SRRM2、NDRG1、CBY1和AKIP1調(diào)控乳脂代謝過(guò)程。同時(shí),結(jié)合miRNA-mRNA與乳成分相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)bta-miR-1343-3p、bta-miR-2285cb、bta-miR-370、MTM1、SRRM2與乳脂率顯著相關(guān)。因此,可推測(cè)miR-370-MTM1、miR-1343-3p-DIS3L2、miR-2285cb- XLOC-122799和miR-2387-SRRM2是調(diào)控乳脂代謝的關(guān)鍵因子。

mRNA作為重要的調(diào)控因子直接或間接的參與乳腺的生長(zhǎng)發(fā)育[27]、泌乳的啟動(dòng)、乳脂的合成[28-29]。磷酸肌醇是脂質(zhì)信號(hào)分子,其在脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)中具有重要作用[30]。本研究通過(guò)靶基因富集篩選出兩條關(guān)鍵通路磷酸肌醇代謝和磷脂酰肌醇信號(hào)通路,有研究證實(shí),磷酸肌醇代謝和磷脂酰肌醇信號(hào)通路可調(diào)節(jié)乳脂合成中的關(guān)鍵酶,參與脂類生物合成過(guò)程[31]。通過(guò)功能注釋篩選出差異表達(dá)顯著的基因共6個(gè),A激酶錨定蛋白13(A-kinase anchor protein 13,AKAP13)、A 激酶相互作用蛋白1(A-kinase-interacting protein 1 isoform X1,AKIP1)、Anoctamin 1(ANO1)、chibby同源蛋白1(protein chibby homolog 1,CBY1)、DIS3 樣核酸外切酶 2(DIS3-like exonuclease 2,DIS3L2)和肌管蛋白(myotubularin,MTM1)在高乳脂和低乳脂荷斯坦奶牛乳腺上皮細(xì)胞中表達(dá)量較高。通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分析,MTM1參與磷酸肌醇代謝和磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)等多個(gè)通路,具有磷脂酰肌醇代謝過(guò)程、磷酸酶活性和脂質(zhì)修飾等功能;CBY1通過(guò)與CTNNB1/β-catenin結(jié)合并通過(guò)與 TCF/LEF 轉(zhuǎn)錄因子的競(jìng)爭(zhēng)抑制β-catenin介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活來(lái)抑制 Wnt/Wingless 通路,有促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化的能力。AKAP13參與MAPK、cAMP、Rap1和Wnt信號(hào)通路等多個(gè)經(jīng)典通路;ANO1參與MAPK、cAMP、Rap1、PI3K-Akt 和AMPK信號(hào)通路等多個(gè)經(jīng)典通路。有研究證明,PI3K-Akt、MAPK、TNF和Wnt等都是與脂代謝相關(guān)的通路[32-34],在奶牛的乳脂代謝與合成中起重要調(diào)控作用。以上結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明,MTM1、CBY1、AKAP13和ANO1可能參與調(diào)節(jié)乳脂合成代謝過(guò)程,具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)RNA-seq技術(shù)描述了中國(guó)荷斯坦牛奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的miRNA表達(dá)譜,從高乳脂和低乳脂組篩選出34個(gè)差異表達(dá)miRNAs,其中16個(gè)上調(diào),18個(gè)下調(diào)。通過(guò)功能分析確定MAPK信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路、催產(chǎn)素信號(hào)通路和磷酸肌醇代謝等通路是乳脂代謝所必需的。通過(guò)miRNA-mRNA聯(lián)合以及乳脂率相關(guān)性分析,鑒定到miR-370-MTM1、miR-1343-3p-DIS3L2、miR-2285cb- XLOC-122799和miR-2387-SRRM2可能直接或間接參與乳脂合成代謝過(guò)程,其可作為奶牛泌乳性狀分子調(diào)控功能研究的候選基因。

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