王禮躍，馮茜茜，蔡為民，劉丹丹，候照峰，康喜龍，張知之，范雪蓮，朱 玉，許金俊，潘志明,4，陶建平*

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；2.江蘇動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009；3.江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009；4.宿遷學(xué)院，宿遷 223800)

雞球蟲病是集約化養(yǎng)雞場(chǎng)最常見的疾病之一，由艾美耳屬(Eimeria)的一種或多種球蟲混合感染引起，其病原有7種，其中毒害艾美耳球蟲(Eimerianecatrix)主要危害8～18周齡的青年雞，可引起雞的急性小腸球蟲病，導(dǎo)致育成雞的大批死亡[1]。艾美耳球蟲的發(fā)育經(jīng)歷裂殖生殖、配子生殖和孢子生殖三個(gè)發(fā)育階段[2]。迄今，對(duì)艾美耳球蟲的發(fā)育過程和蟲體形態(tài)結(jié)構(gòu)的研究已較為清晰，但有關(guān)調(diào)控艾美耳球蟲生長發(fā)育和性別分化的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。AP2(Apetala2)結(jié)構(gòu)域最初發(fā)現(xiàn)于多種植物的轉(zhuǎn)錄因子中，能與含特定基序的DNA序列結(jié)合，在調(diào)控植物發(fā)育進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，參與包括植物生長、發(fā)育、損傷、病菌防御、耐旱等多種生物學(xué)過程[3]。在瘧原蟲(Plasmodiumspp.)、弓形蟲(Toxoplasmagondii)、泰勒蟲(Theileriaspp.)和隱孢子蟲(Cryptosporidiumspp.)等頂復(fù)門原蟲(Apicomplexa)的基因組中也存在含編碼AP2結(jié)構(gòu)域的基因[4-7]，且AP2結(jié)構(gòu)域高度保守，可能是調(diào)控頂復(fù)門原蟲生長發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子[8]，稱為ApiAP2(apicomplexan AP2)轉(zhuǎn)錄因子[9]。雖然含有編碼AP2結(jié)構(gòu)域的假定基因也見于艾美耳球蟲的基因組，但迄今尚未見有艾美耳球蟲ApiAP2蛋白及其功能的報(bào)道。本研究室前期對(duì)毒害艾美耳球蟲第2、3代裂殖子和配子體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析時(shí)，獲得了5個(gè)編碼ApiAP2假定蛋白的mRNA完整序列[10]。為了進(jìn)一步證實(shí)毒害艾美耳球蟲ApiAP2假定蛋白是否真實(shí)存在，本文選取其中一個(gè)ApiAP2基因(ENH_00077450)進(jìn)行克隆與表達(dá)，用重組蛋白rEnApiAP2制備鼠多克隆抗體，再用鼠多克隆抗體檢測(cè)裂殖子中天然EnApiAP2蛋白，用間接免疫熒光技術(shù)分析EnApiAP2蛋白在蟲體中的亞細(xì)胞定位，最后用熒光定量PCR方法分析該基因的表達(dá)特性。研究結(jié)果為進(jìn)一步分析EnApiAP2蛋白在毒害艾美耳球蟲生長發(fā)育與性別分化進(jìn)程中的作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蟲株、菌株、質(zhì)粒與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

毒害艾美耳球蟲揚(yáng)州株，由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室經(jīng)單卵囊分離建株；毒害艾美耳球蟲第2、3代裂殖子，由本實(shí)驗(yàn)室分離保存；感受態(tài)細(xì)胞DH5α和BL21(DE3)，由本實(shí)驗(yàn)室保存；克隆載體pMD18-T購自TaKaRa公司；原核表達(dá)載體pET28a(+)購自Invitrogen公司；6周齡BALB/c雄性小鼠購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。本項(xiàng)研究中所有試驗(yàn)方案符合揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物倫理、福利等相關(guān)條例規(guī)定，符合江蘇省科技廳動(dòng)物福利保護(hù)條例，許可證編號(hào)：SCXK(蘇)2021-0013。

1.2 主要試劑

PrimeSTAR Max DNA Polymerase，TaKaRa Taq，DNA Ligation Kit，MiniBEST Universal RNA Extraction Kit，Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR，MiniBEST DNA Fragment Purification Kit，MiniBEST Plasmid Purification Kit，6×Loading Buffer，BamH Ⅰ限制性內(nèi)切酶和SalⅠ限制性內(nèi)切酶，購自TaKaRa公司；HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit，SYBR Green Master Mix，購自諾唯贊公司；QuickAntibody-Mouse3 W，購自博奧龍免疫技術(shù)有限公司；硝酸纖維素膜，購自默克公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑，購自Tanon公司；Anti-6×His標(biāo)簽小鼠單抗和HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG，購自BBI公司；HRP標(biāo)記的羊抗雞IgG和FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG (H+L)，購自HPL公司；Ni-NTA親和層析介質(zhì)，購自金斯瑞公司；雞抗毒害艾美耳球蟲、抗柔嫩艾美耳球蟲、抗巨型艾美耳球蟲和抗堆型艾美耳球蟲康復(fù)血清，由本實(shí)驗(yàn)室制備保存。

1.3 EnApiAP2基因的擴(kuò)增與克隆

用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段為1 830 bp左右。上游引物：5′-ATGGCCGGACTAGACGCT-3′，下游引物：5′-TTATTTACTTTTGCACACCATTC-3′，引物由六合華大基因科技股份有限公司合成。參照RNA提取試劑盒步驟，提取毒害艾美耳球蟲第3代裂殖子的總RNA，RT-PCR擴(kuò)增目的基因。PCR產(chǎn)物回收、純化后，克隆至pMD18-T載體中，選取經(jīng)克隆載體通用引物鑒定為陽性的克隆送六合華大公司測(cè)序，并將重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-EnApiAP2。

1.4 核苷酸及其編碼的氨基酸序列、抗原性分析

將測(cè)序得到的EnApiAP2基因序列與GenBank中收錄的毒害艾美耳球蟲Houghton株和柔嫩艾美耳球蟲Houghton株基因序列進(jìn)行比對(duì)，并使用Lasergene軟件對(duì)其編碼的氨基酸進(jìn)行蛋白親水性、抗原性、二級(jí)結(jié)構(gòu)等參數(shù)分析。用網(wǎng)站(http://www.moseslab.csb.utoronto.ca/NLStradamus/)在線軟件預(yù)測(cè)蛋白的核定位信號(hào)序列。

1.5 表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

根據(jù)表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)上具備的酶切位點(diǎn)及EnApiAP2基因序列，設(shè)計(jì)得到特異性引物。上游引物：5′-CGCGGATCCATGGCCGGACTAGACGCT-3′，含BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)(劃線部分)和3個(gè)保護(hù)性堿基；下游引物：5′-ACGCGTCGACTTTACTTTTGCACACCATTC-3′，含SalⅠ酶切位點(diǎn)(劃線部分)和4個(gè)保護(hù)性堿基。以重組質(zhì)粒pMD18-T-EnApiAP2為模板，PCR擴(kuò)增后回收目的條帶，與表達(dá)載體pET28a(+)分別進(jìn)行BamHⅠ和SalⅠ雙酶切；solution I連接酶連接目的片段和表達(dá)載體，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-EnApiAP2并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)；選取經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定為陽性的克隆送至六合華大公司測(cè)序。

1.6 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、鑒定和純化復(fù)性

將重組菌接種于含有卡那霉素(100 μg·mL-1)的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r·min-1震蕩培養(yǎng)3 h。接著加入終濃度1 mmol·L-1的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，37 ℃，180 r·min-1誘導(dǎo)表達(dá)4 h。同時(shí)設(shè)置pET-28a(+)空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌和未轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)作對(duì)照。取1 mL誘導(dǎo)菌，PBS洗滌3次，150 μL PBS重懸菌體，加入50 μL 4×SDS-PAGE上樣緩沖液并煮沸10 min，12 000 r·min-1離心10 min，取上清進(jìn)行12% SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)情況。

為鑒定重組蛋白，將誘導(dǎo)的陽性重組菌蛋白和pET-28a(+)空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌蛋白進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳，并轉(zhuǎn)印至NC膜上。將NC膜置于含3% BSA的封閉液中，37 ℃封閉1 h。以6×HIS標(biāo)簽單克隆抗體(按1∶5 000倍稀釋)為一抗、HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG(按1∶15 000倍稀釋)為二抗進(jìn)行孵育，滴加ECL顯色，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并掃描拍照。

鑒定后取4 mL誘導(dǎo)菌，PBS洗滌3次，500 μL PBS重懸菌體，冰浴超聲裂解，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE分析，確定重組蛋白的存在形式。

將上述陽性菌體進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)500 mL菌液，離心收集洗滌重懸菌體，超聲破碎，收集沉淀獲得大量重組蛋白。用Ni-NTA親和層析柱純化重組蛋白，并分別經(jīng)6、4、2、1 mol·L-1尿素濃度的透析液和0.1 mol·L-1PBS復(fù)性[11]，A280紫外光吸收法測(cè)定蛋白濃度。

1.7 小鼠抗rEnApiAP2多克隆抗體的制備

參照QuickAntibody-Mouse3 W使用說明書，將純化復(fù)性后的重組蛋白用生理鹽水稀釋至2 μg·μL-1，取50 μL佐劑與50 μL稀釋后的重組蛋白混勻，采取小鼠腿部肌肉注射方式，每只小鼠注射量為100 μL。第14天按相同方式和劑量加強(qiáng)免疫1次，第21天對(duì)小鼠摘眼球采血，3 000 r·min-1離心10 min分離血清。陰性對(duì)照為未免疫小鼠血清。間接ELISA方法[12]測(cè)定血清抗體滴度，以陽性血清大于陰性血清2倍的最大稀釋倍數(shù)為血清的效價(jià)。

1.8 重組蛋白的抗原性與交叉反應(yīng)原性分析

Western blot檢測(cè)重組蛋白的抗原性，取誘導(dǎo)的陽性重組菌蛋白和pET28a(+)空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌蛋白進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳，并轉(zhuǎn)移到NC膜上。一抗分別為鼠抗rEnApiAP2多克隆抗體和雞抗毒害艾美耳球蟲康復(fù)血清，二抗分別為HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG和羊抗雞IgG。

同樣的方法進(jìn)行Western blot，檢測(cè)重組蛋白分別對(duì)柔嫩艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲和堆型艾美耳球蟲的交叉反應(yīng)原性，一抗分別為3種雞抗艾美耳球蟲康復(fù)血清，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗雞IgG。

1.9 天然蟲體EnApiAP2蛋白檢測(cè)

取毒害艾美耳球蟲第2代和第3代裂殖子，3 000 r·min-1離心6 min，300 μL PBS重懸，分別冰浴超聲裂解；分別加入100 μL 4×SDS-PAGE上樣緩沖液并煮沸10 min，8 000 r·min-1離心1 min，取上清進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳，并轉(zhuǎn)移到NC膜上；將NC膜置于含3% BSA的封閉液中，37 ℃封閉1 h。以鼠抗rEnApiAP2多克隆抗體(按1∶200倍稀釋)為一抗、HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG(按1∶10 000倍稀釋)為二抗進(jìn)行孵育，滴加ECL顯色，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并掃描拍照。

1.10 EnApiAP2蛋白在蟲體中的定位

取毒害艾美耳球蟲第2代和第3代裂殖子分別均勻涂布于載玻片上，在涂布處滴加適量甲醇，置于-20 ℃作用10 min，PBST洗滌3次，每次5 min；滴加適量0.1%的Triton X-100，室溫作用10 min，PBST洗滌3次，每次5 min；置于含3% BSA的封閉液中，37 ℃封閉1 h；以鼠抗rEnApiAP2多克隆抗體(按1∶200倍稀釋)為一抗，濕盒內(nèi)37 ℃作用1 h，PBST洗滌3次，每次5 min；以FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG (H+L)(按1∶1 000倍稀釋)為二抗，濕盒內(nèi)37 ℃作用1 h，PBST洗滌3次，每次5 min；待載玻片自然晾干后，滴加抗熒光淬滅封片液(含DAPI)，蓋玻片封片，超高分辨率激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果并拍照。同時(shí)，設(shè)置陰性小鼠血清對(duì)照組。

1.11 EnApiAP2基因的轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)

用熒光定量PCR方法對(duì)EnApiAP2基因在第2代和第3代裂殖子發(fā)育階段轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè)。使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，上游引物：5′-CAAGATTGCTGTGCGAGTGGT-3′，下游引物：5′-TCCATTGCCTTGTGCTTAGTG-3′。將毒害艾美耳球蟲5.8S rRNA作為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)特異性引物，上游引物：5′-TTCATACTGCGTCTAATGCACC-3′；下游引物：5′-CGAGTCCCTACCGCAGTACTA-3′。采用SYBR Green Master Mix熒光定量試劑盒進(jìn)行定量。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，記錄每個(gè)基因在不同樣品中表達(dá)的Ct值，運(yùn)用近似值法2-ΔΔCt計(jì)算各組樣品的相對(duì)表達(dá)量[13]。用GraphPad Prism軟件對(duì)相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析，用t檢驗(yàn)分析兩組間差異性(P<0.01，表示差異極顯著)。

2 結(jié) 果

2.1 EnApiAP2基因的克隆及序列分析

通過RT-PCR擴(kuò)增，獲得片段大小為1 830 bp左右，與預(yù)期相符(圖1)。測(cè)序與序列分析顯示，EnApiAP2基因全長1 830 bp，編碼610個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為67.69 ku，等電點(diǎn)(PI)為9.20。將此序列提交至GenBank，獲取的蛋白質(zhì)登錄號(hào)為OM909016。與收錄在GenBank中的7種雞艾美耳球蟲ApiAP2蛋白全長及其AP2結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)此序列與毒害艾美耳球蟲豪頓株(XP_0134438482.1)、柔嫩艾美耳球蟲(XP_013232114.1)的相似性較高，分別為99.7%、100%和90.4%、100%，而與其他5種雞球蟲的相似性在19.8%～30.3%、64.1%～82.1%。BepiPred軟件預(yù)測(cè)該基因編碼蛋白含有25個(gè)抗原決定簇；NCBI網(wǎng)站預(yù)測(cè)第119—157位氨基酸含有一個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域；NLStradamus網(wǎng)站預(yù)測(cè)第361—372位氨基酸為核定位信號(hào)序列。用Lasergene軟件比較毒害艾美耳球蟲與另外6種雞艾美耳球蟲和6種頂復(fù)門原蟲的ApiAP2蛋白氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)它們的AP2結(jié)構(gòu)域高度保守，均包含1個(gè)α-螺旋和3個(gè)β-折疊結(jié)構(gòu)(圖2)。

2.2 原核表達(dá)載體的鑒定

構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定(圖3)，獲得大小約5 350和1 830 bp的條帶，與預(yù)期大小相符。測(cè)序結(jié)果顯示,目的基因未發(fā)生堿基突變，表明重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-EnApiAP2構(gòu)建成功。

2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和鑒定

將重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-EnApiAP2轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，重組蛋白大小約74 ku，與預(yù)期相符(圖4A)，主要以包涵體形式表達(dá)(圖4B)；Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，重組蛋白能被6×HIS標(biāo)簽單克隆抗體特異性識(shí)別(圖4C)。

M. DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. EnApiAP2基因擴(kuò)增產(chǎn)物M. DL 2000 DNA marker; 1. The amplification of EnApiAP2 gene圖1 EnApiAP2基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 Amplification of EnApiAP2 gene by PCR

1.毒害艾美耳球蟲(揚(yáng)州株)；2.柔嫩艾美耳球蟲；3.早熟艾美耳球蟲；4.和緩艾美耳球蟲；5.巨型艾美耳球蟲；6.布氏艾美耳球蟲；7.堆型艾美耳球蟲；8.豬囊等孢球蟲；9.卡耶塔環(huán)孢子蟲；10.貝氏貝諾孢子蟲；11.犬新孢子蟲；12.馬泰勒蟲；13.剛第弓形蟲1. Eimeria necatix (Yangzhou strain)；2. E. tenella；3. E. praecox；4. E. mitis；5. E. maxima；6. E. brunetti；7. E. acervulina；8. Cystoisopora suis；9. Cyclospora cayetanensis；10. Besnoitia besnoiti；11. Neospora caninum；12. Theileria equi；13. Toxoplasma gondii圖2 13種頂復(fù)門原蟲ApiAP2基因編碼的ApiAP2結(jié)構(gòu)域比較Fig.2 Comparison of ApiAP2 domains from thirteen apicomplexan

M. DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. Bam HⅠ和SalⅠ雙酶切產(chǎn)物M. GeneRuler 1 kb DNA marker；1. Recombinant plasmid digested by Bam HⅠ and SalⅠ圖3 重組表達(dá)載體的酶切鑒定結(jié)果Fig.3 Recombinant plasmid digested by restriction enzyme

2.4 重組蛋白的純化復(fù)性

大量誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白rEnApiAP2，超聲裂解釋放包涵體，經(jīng)含有6×HIS標(biāo)簽的Ni-NTA親和純化層析柱純化，收集不同階段的流出液。SDS-PAGE分析結(jié)果顯示(圖5)，重組蛋白幾乎全部結(jié)合到層析柱上，經(jīng)過3次Washing Buffer洗滌，雜條帶基本清除，經(jīng)過Elution Buffer洗脫，重組蛋白純化效果較好。

2.5 鼠抗重組蛋白的血清效價(jià)測(cè)定

免疫兩次BALB/c小鼠后，間接ELISA法測(cè)定血清抗體滴度。陽性血清按1∶200倍稀釋時(shí)，D450值為2.5；按1∶51 200倍稀釋時(shí)，D450值仍大于陰性血清的2.1倍，因此陽性血清的抗體效價(jià)為1∶51 200，而陰性對(duì)照組小鼠血清未檢測(cè)到相應(yīng)抗體，表明重組蛋白rEnApiAP2能刺激小鼠產(chǎn)生高水平抗體。

M. 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. BL21 IPTG誘導(dǎo)；2. pET28a(+)/BL21 IPTG誘導(dǎo)；3. pET28a(+)-EnApiAP2/BL21 IPTG未誘導(dǎo)；4. pET28a(+)-EnApiAP2/BL21IPTG誘導(dǎo)；5. pET28a(+)/BL21 IPTG誘導(dǎo)；6. 重組菌誘導(dǎo)后超聲裂解沉淀；7. 重組菌誘導(dǎo)后超聲裂解上清；8. pET28a(+)-EnApiAP2/BL21 IPTG誘導(dǎo)；9. pET28a(+)/BL21 IPTG誘導(dǎo)M. Protein marker；1. BL21 with IPTG induction；2. pET28a(+)/BL21 with IPTG induction；3. pET28a(+)-EnApiAP2/BL21 without IPTG induction；4. pET28a(+)-EnApiAP2/BL21 with IPTG induction；5. pET28a(+)/BL21 with IPTG induction；6. Sediments of bacterial sonicates；7. Supernatant of bacterial sonicates；8. pET28a(+)-EnApiAP2/BL21 with IPTG induction；9. pET28a(+)/BL21 with IPTG induction圖4 重組蛋白的SDS-PAGE分析(A、B)和Western blot鑒定(C)Fig.4 The SDS-PAGE (A, B) and Western blot (C) analysis of rEnApiAP2

M. 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 重組菌誘導(dǎo)后超聲裂解上清；2. 重組菌誘導(dǎo)后超聲裂解沉淀；3. 裂解液與Ni-NTA結(jié)合后流出液；4. Washing Buffer第1次洗脫液；5. Washing Buffer第3次洗脫液；6. Elution Buffer洗脫液；7. 透析復(fù)性后的目的蛋白M. Protein marker；1. Supernatant of bacterial sonicates；2. Sediments of bacterial sonicates；3. Effluent after binding with Ni-NTA；4. Washing buffer for the first time；5. Washing buffer for the third time；6. Effluent of Elution Buffe；7. Renaturation protein of dialysis圖5 重組蛋白的純化復(fù)性Fig.5 The purification and renaturation of rEnApiAP2

2.6 重組蛋白的抗原性與交叉反應(yīng)性分析

Western blot分析顯示，重組蛋白rEnApiAP2能被鼠抗重組蛋白多克隆抗體(圖6A)、雞抗毒害艾美耳球蟲康復(fù)血清(圖6B)和雞抗柔嫩艾美耳球蟲康復(fù)血清識(shí)別(圖6C)，但不能被抗巨型艾美耳球蟲(圖6D)和抗堆型艾美耳球蟲(圖6E)雞康復(fù)血清識(shí)別，表明重組蛋白具有良好的抗原性，僅對(duì)柔嫩艾美耳球蟲有交叉反應(yīng)原性。

2.7 天然蛋白檢測(cè)

以鼠抗重組蛋白多克隆抗體為一抗進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果顯示，在毒害艾美耳球蟲第3代裂殖子蛋白中有1條帶能被鼠抗重組蛋白多克隆抗體特異性識(shí)別，其大小約85 ku，而在第2代裂殖子蛋白中未檢測(cè)到條帶(圖7)。

2.8 EnApiAP2蛋白在蟲體細(xì)胞中的定位

以鼠抗rEnApiAP2多克隆抗體為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，對(duì)毒害艾美耳球蟲第2代和3代裂殖子進(jìn)行免疫熒光定位分析。結(jié)果顯示，在第2代和第3代裂殖子的細(xì)胞核上均觀察到明顯綠色熒光，尤其在第3代裂殖子，在細(xì)胞質(zhì)中綠色熒光相對(duì)較弱，表明EnApiAP2蛋白主要定位于蟲體細(xì)胞核內(nèi)(圖8)。

M. 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、3、5、7、9. pET28a(+)-EnApiAP2/BL21 IPTG誘導(dǎo)；2、4、6、8、10. pET28a(+)/BL21 IPTG誘導(dǎo)M. Protein marker；1，3，5，7，9. pET28a(+)-EnApiAP2/BL21 with IPTG induction；2，4，6，8，10. pET28a(+)/BL21 with IPTG induction圖6 重組蛋白的抗原性(A、B)與交叉反應(yīng)原性檢測(cè)(C、D、E)Fig.6 Detection of antigenicity (A, B) and cross reactivity (C, D, E) of rEnApiAP2

M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.第2代裂殖子；2.第3代裂殖子M. Protein marker；1. The second generation merozoites；2. The third generation merozoites圖7 鼠抗重組蛋白多抗對(duì)天然裂殖子蛋白的識(shí)別Fig.7 Recognition of natural merozoite proteins by mouse anti-rEnApiAP2 antibody

2.9 EnApiAP2基因的轉(zhuǎn)錄水平分析

熒光定量PCR結(jié)果顯示(圖9)，第3代裂殖子EnApiAP2基因轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于第2代裂殖子(P<0.01)。

3 討 論

ApiAP2蛋白是Balaji等[4]用生物信息學(xué)方法在惡性瘧原蟲(P.falciparum)蛋白組中搜索DNA結(jié)合域時(shí)發(fā)現(xiàn)的一類含AP2 DNA結(jié)合域的蛋白質(zhì)。多數(shù)ApiAP2蛋白只含有1個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域，其長度約60個(gè)氨基酸殘基，結(jié)構(gòu)與植物AP2域相類似，包括1條α-螺旋和3條β-折疊[14]。本文中克隆的EnApiAP2基因推導(dǎo)的氨基酸序列中，在第119—157位氨基酸組成AP2結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含1個(gè)α-螺旋和3個(gè)β-折疊結(jié)構(gòu)，與另外6種雞艾美耳球蟲和6種頂復(fù)門原蟲ApiAP2蛋白的AP2結(jié)構(gòu)域相一致。此外，用NLStradamus軟件預(yù)測(cè)該基因編碼的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)在第361—372位存在核定位信號(hào)序列，且EnApiAP2蛋白定位于第2、3代裂殖子的細(xì)胞核。因此，可以推論本文克隆的基因?yàn)镋nApiAP2基因。

AP2域大多高度保守，但AP2域外的氨基酸通常沒有序列同源性[15]。同樣，作者在比較不同雞球蟲ApiAP2蛋白氨基酸序列，也發(fā)現(xiàn)EnApiAP2除了與柔嫩艾美耳球蟲相似性較高(達(dá)90.4%)外，與其他5種雞球蟲的相似性較低，僅為19.8%～30.3%。但組成AP2結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相似性明顯高于ApiAP蛋白全長氨基酸序列，其中，與柔嫩艾美耳球蟲的相似性高達(dá)100%，與其他5種雞球蟲的相似性在64.1%～82.1%。在7種雞球蟲中毒害艾美耳球蟲與柔嫩艾美耳球蟲的ApiAP2蛋白氨基酸序列相似性最高，且Western blot分析顯示重組蛋白rEnApiAP2能被雞抗柔嫩艾美耳球蟲康復(fù)血清識(shí)別，不能被抗巨型艾美耳球蟲和抗堆型艾美耳球蟲雞康復(fù)血清識(shí)別，顯示毒害艾美耳球蟲與柔嫩艾美耳球蟲間的親緣關(guān)系最近，這與早期文獻(xiàn)報(bào)道的7種雞球蟲系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果相一致[16]。

完整的ApiAP2蛋白在大小上有很大差異，氨基酸殘基數(shù)從200～4 000個(gè)以上不等[9]。本文克隆的EnApiAP2基因全長1 830 bp，編碼610個(gè)氨基酸，推導(dǎo)的理論分子質(zhì)量為67.69 ku。但用Western blot檢測(cè)裂殖子全蟲體蛋白，在第3代裂殖子中發(fā)現(xiàn)天然EnApiAP2蛋白為85 ku，較推導(dǎo)的理論分子質(zhì)量要大，兩者差異的原因有待進(jìn)一步研究。但在在第2代裂殖子中未檢測(cè)到天然EnApiAP2蛋白，與免疫熒光定位結(jié)果不一致，推測(cè)其原因可能是免疫熒光定位的敏感性高于Western blot方法、以及EnApiAP2蛋白在第3代裂殖子中的表達(dá)量高于第2代裂殖子。熒光定量PCR結(jié)果顯示，EnApiAP2基因在第3代裂殖子中的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于第2代裂殖子，這一結(jié)果也本課題組前期的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果相一致[10]。

A～D.第2代裂殖子/鼠陰性血清；E～H.第2代裂殖子/鼠抗rEnApiAP2多克隆抗體；I～L.第3代裂殖子/鼠陰性血清；M～P.第3代裂殖子/鼠抗rEnApiAP2多克隆抗體；A、E、I、M.微分干涉；B、F、J、N.DAPI染色；C、G、K、O.FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG孵育；D、H、L、P.不同熒光的疊加A-D. MZ-2/mouse negative control serum；E-H. MZ-2/polyclonal mouse anti-EnApiAP2 antibodies；I-L. MZ-3/mouse negative control serum；M-P. MZ-3/polyclonal mouse anti-EnApiAP2；A，E，I，M. The images taken under differential interference contrast；B，F(xiàn)，J，N. Counter-stained with DAPI；C，G，K，O. Stained using FITC sheep anti-mouse IgG；D，H，L，P. The superposition of different fluorescences (Merge)圖8 EnApiAP2蛋白的免疫熒光定位(標(biāo)尺=5 μm)Fig.8 Localization of EnApiAP2 protein in the second and third generation merozoites (bar=5 μm)

MZ-2.第2代裂殖子；MZ-3.第3代裂殖子。**.P<0.01MZ-2. The second generation merozoites; MZ-3. The third generation merozoites. **. P<0.01圖9 EnApiAP2基因在兩個(gè)發(fā)育階段蟲體中mRNA轉(zhuǎn)錄水平Fig.9 The transcriptional levels of EnApiAP2 at two development stages of E.necatrix

迄今，ApiAP2蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控頂復(fù)門原蟲生長發(fā)育的研究主要見于瘧原蟲和弓形蟲[15]，在惡性瘧原蟲中，PfAP2-G是配子體形成的主要轉(zhuǎn)錄激活因子，PfAP2-G5和PfAP2-G2則作為轉(zhuǎn)錄抑制因子，協(xié)同阻斷蟲體無性期發(fā)育所需基因表達(dá)[17]。在弓形蟲中，TgAP2XI-4是緩殖子階段基因表達(dá)的激活因子，促進(jìn)緩殖子形成[18]；TgAP2IX-9和TgAP2IX-4是基因表達(dá)的抑制因子，與蟲體毒力和包囊形成相關(guān)[19-20]。除了通過轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄抑制來直接調(diào)控靶基因編碼蛋白表達(dá)水平外，ApiAP2蛋白還具有其他功能。惡性瘧原蟲PfAP2-G5轉(zhuǎn)錄因子可使PfAP2-G下調(diào)，從而間接調(diào)控由PfAP2-G激活的早期配子體基因[21]。PfAP2-HC不參與基因表達(dá)調(diào)控，但是參與組成瘧原蟲異染色質(zhì)的核心部分[22]。本研究克隆的ApiAP2基因在毒害艾美耳球蟲生長發(fā)育與性別分化進(jìn)程中是否發(fā)揮類似的功能還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

成功克隆并原核表達(dá)了EnApiAP2基因，該基因在第3代裂殖子轉(zhuǎn)錄水平顯著高于第2代裂殖子；EnApiAP2蛋白定位在第2、3代裂殖子細(xì)胞核內(nèi)；天然EnApiAP2蛋白分子質(zhì)量約為85 ku。