李艷萍，劉婷麗，李 紅，陳國梁，王立群，郭小臘，駱學(xué)農(nóng),2*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730046;2.揚(yáng)州大學(xué)，江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009)

多房棘球蚴病(Echinococcosismultilocularis，Em),又稱泡球蚴病(alveolar echinococcosis，AE),是多房棘球蚴絳蟲的中絳期幼蟲-多房棘球蚴(E.multilocularis，Em)寄生于人和嚙齒類動(dòng)物的肝所引起的一種嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲病，廣泛流行于歐洲、北美、亞洲北部及我國西北地區(qū)[1-2]。犬、狐貍、狼等為其終末宿主，而嚙齒類動(dòng)物為其中間宿主[3]。人因誤食蟲卵而感染，幼蟲寄生于肝，如惡性腫瘤一樣形成局部侵襲性和浸潤性生長，并可轉(zhuǎn)移到其他組織器官[4]，未經(jīng)治療的患者死亡率高達(dá)90%[5]。目前，使用手術(shù)切除結(jié)合阿苯達(dá)唑(ABZ)藥物是公認(rèn)的治療方法[6]。

巨噬細(xì)胞亞群主要包括促炎的M1型和抗炎的M2型。M1型巨噬細(xì)胞通常產(chǎn)生高水平的促炎細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible NO synthase，iNOS)等，從而表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗微生物和腫瘤活性；而M2型巨噬細(xì)胞通常產(chǎn)生高水平的甘露糖受體(CD206)、精氨酸酶1(Arg1)及IL-10和TGF-β等，從而抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織重塑、血管生成和腫瘤形成[7-11]。肝巨噬細(xì)胞主要由常駐枯否氏細(xì)胞(KCs)和單核巨噬細(xì)胞(MoMφs)組成，在免疫耐受、維持肝穩(wěn)態(tài)和抗炎微環(huán)境中發(fā)揮重要作用[12]。研究證實(shí)，多房棘球蚴感染早期刺激宿主產(chǎn)生Th1型免疫應(yīng)答，隨著AE的發(fā)展逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)門h2型免疫抑制反應(yīng)。同時(shí)，在感染過程中也可能伴隨M1/M2型巨噬細(xì)胞極化[13]。據(jù)報(bào)道，多房棘球蚴感染小鼠在第5天時(shí)肝中就出現(xiàn)大量以M1表型(F4/80+)為主的巨噬細(xì)胞浸潤，通過產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子來清除早期幼蟲。而在慢性感染階段極化為M2表型，從而有利于蟲體的持續(xù)性感染[14]。

微小RNA(miRNAs)和環(huán)狀RNAs(circRNAs)參與不同水平的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[15]。miRNA通常與靶基因3′UTR互補(bǔ)結(jié)合，抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄或降解，從而下調(diào)靶基因的表達(dá)[16]。circRNAs作為一種內(nèi)源性RNAs，通過與miRNAs的競(jìng)爭(zhēng)性靶向結(jié)合，從而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)[17]。越來越多的證據(jù)表明，miRNAs和circRNAs參與細(xì)胞自噬、凋亡、增殖等生理病理過程[18-22]，在調(diào)控疾病進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[23-27]。在寄生蟲感染過程中，很多miRNAs參與宿主巨噬細(xì)胞的極化[28-30]，在調(diào)節(jié)宿主與病原相互作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用。目前，circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在疾病的致病機(jī)制、診斷、治療領(lǐng)域具有很大的研究潛力[31]。因此，本研究通過RNA高通量測(cè)序分析，篩選并鑒定與多房棘球蚴感染誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化相關(guān)的非編碼RNA(ncRNA)，并建立與之相關(guān)的circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，旨在探索ncRNAs在多房棘球蚴感染誘導(dǎo)的KCs極化中的作用機(jī)制，為進(jìn)一步揭示多房棘球蚴的免疫逃避機(jī)制，探索其診斷標(biāo)志提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及蟲體 BALB/c小鼠，雄性，6～8周齡，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。長爪沙鼠(Merionesunguiculatus)購自北京首都醫(yī)科大學(xué)，多房棘球蚴于長爪沙鼠體內(nèi)保種。

1.1.2 主要試劑 膠原酶Ⅳ(Gibco, USA)、胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、RPMI-1640培養(yǎng)基、Opti-MEM無血清培養(yǎng)基、0.25%的胰蛋白酶(trypsin)均購自Gibco公司；lipofectamine 3000、TRIzol試劑購自Invitrogen公司；HiScript?III 1 st Strand cDNA Synthesis試劑盒購自南京諾維贊生物公司；All-in-One qPCR Mix、qPCR內(nèi)參GAPDH、U6引物均購自Gene Copoeia；mmu-miR-466c-5p模擬物購自上海生工生物公司。

1.1.3 主要儀器 恒溫循環(huán)水浴、ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Termo Fisher)、CO2恒溫培養(yǎng)箱(Termo Fisher)、水浴鍋、低速冷凍離心機(jī)和倒置熒光顯微鏡(Leica)等。

1.2 方 法

1.2.1 多房棘球蚴原頭蚴感染小鼠模型的建立 采用頸椎脫臼處死長爪沙鼠，取出腹腔內(nèi)寄生的多房棘球蚴包囊，研磨過濾后收集原頭蚴，并進(jìn)行計(jì)數(shù)。將60只BALB/c小鼠隨機(jī)分為感染組和對(duì)照組，每組30只。感染組每只小鼠腹腔接種600只原頭蚴，對(duì)照組腹腔注射等體積PBS，分別在感染后1、2和3月處死小鼠，分離肝KCs。

1.2.2 小鼠肝KCs的分離鑒定 分別取感染組和對(duì)照組小鼠各3只，麻醉后暴露腹腔，將乙二醇雙四乙酸(EGTA)經(jīng)肝門靜脈注入肝。2 min后，灌注含0.04%的膠原酶Ⅳ的EB(Earle’s balanced salt solution)溶液，消化6 min。摘取肝，剔除膽囊及結(jié)蹄組織，放入含0.1 mg·mL-1DNase Ⅰ及0.08%的膠原酶Ⅳ的EB中，充分研磨，于37 ℃水浴內(nèi)消化30 min，用70目細(xì)胞篩過濾后，收集濾液于50 mL離心管，45×g離心5 min，收集上清液，加入等體積的GBSS(Gey’s balanced salt solution)緩沖液，600×g離心10 min。棄上清，用少量GBSS重懸沉淀，并加入GBSS溶液至50 mL，500×g離心10 min，棄上清，用2～3 mL GBSS重懸細(xì)胞沉淀。用GBSS分別配制20%和11.5% 的optiprep溶液，并用長針頭將20%、11.5% optiprep溶液及細(xì)胞懸液依次沿管壁緩慢加入15 mL離心管中，1 400×g離心17 min，收集最上面的KCs層于15 mL離心管，加入GBSS緩沖液，600×g離心10 min，收集細(xì)胞沉淀，用含10% FBS的RPMI-1640進(jìn)行培養(yǎng)。

KCs培養(yǎng)4 h后，用TRizol提取總RNA， HiScript?III合成cDNA第一鏈，用All in one qPCR Mix進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，檢測(cè)KCs表面標(biāo)志分子F4/80及肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)標(biāo)志分子Col1a1、Col3a1、a-SMA及GFAP的水平。反應(yīng)體系：2×All in one qPCR Mix 10 μL，Rox Reference Dye 0.4 μL，上、下游引物(2 μmol·L-1)各1 μL，cDNA模板2 μL，DEPC水 6.5 μL。反應(yīng)程序參數(shù)：95 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸1 min，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)試驗(yàn)設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.3 不同感染時(shí)期KCs表型分子的相對(duì)表達(dá)水平 分別分離多房棘球蚴感染1、2和3月的小鼠肝KCs，用qPCR檢測(cè)M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志分子IFN-γ、IL1β、IL12α、IL18、TNF-α、iNOS、IL6及M2型標(biāo)志分子IL4、IL10、IL13、TGF-β、Arg1的mRNA水平。同時(shí)，用Western blot檢測(cè)M2型標(biāo)志分子IL13 和Arg1的表達(dá)水平。

1.2.4 circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析 將感染2月的小鼠肝KCs進(jìn)行RNA高通量測(cè)序分析，篩選出與M2型巨噬細(xì)胞極化相關(guān)的部分差異表達(dá)的circRNA、miRNA和mRNA，結(jié)合Target Scan在線軟件預(yù)測(cè)基因靶向結(jié)合位點(diǎn)，利用Cytoscape2.0軟件構(gòu)建相關(guān)ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并利用qPCR驗(yàn)證部分基因的轉(zhuǎn)錄水平。

1.2.5 miR-466c-5p抑制circ_0000372和IL13的表達(dá) 分離正常小鼠的KCs，用人工合成的miR-466c-5p模擬物(mimics)轉(zhuǎn)染KCs，利用qPCR分析miR-466c-5p過表達(dá)對(duì)circ_0000372和IL13的轉(zhuǎn)錄水平的影響，進(jìn)一步驗(yàn)證上述構(gòu)建的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠KCs的純度鑒定

qPCR結(jié)果顯示(圖1)，KCs表面標(biāo)志分子F4/80的表達(dá)水平顯著高于HSCs的標(biāo)志分子Col1a1、Col3a1、a-SMA及GFAP的mRNA表達(dá)水平(P<0.000 1)，說明分離的KCs純度較好。

****. P<0.000 1圖1 KCs純度檢測(cè)Fig.1 Detection of KCs purity

2.2 小鼠KCs表型標(biāo)志分子檢測(cè)

qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)(圖2)，感染1月時(shí)，M1型標(biāo)志分子IL1β和TNF-α極顯著上調(diào)(P<0.001)，M2型標(biāo)志分子IL10和IL13極顯著上調(diào)(P<0.000 1)(圖2A)；感染2和3月時(shí)M1型標(biāo)志分子均顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.001)下調(diào)，而M2型標(biāo)志分子的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P<0.01)(圖2B、C，圖3)。說明多房棘球蚴感染先誘導(dǎo)KCs產(chǎn)生M1型和M2型混合型極化，而后逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐訫2型巨噬細(xì)胞為主的極化，產(chǎn)生抗炎因子Arg1和IL13等。

*. P<0.05，**. P<0.01，***. P<0.001, ****. P<0.000 1, ns. P>0.05圖2 多房棘球蚴不同感染時(shí)期KCs表型標(biāo)志分子的相對(duì)表達(dá)水平Fig.2 Relative expression levels of phenotypic markers in KCs at different stages of E. multilocularis

2.3 ceRNA調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)分析

根據(jù)RNA高通量測(cè)序分析，篩選出與多房棘球蚴感染相關(guān)的M2型標(biāo)志分子IL10、IL13及Arg1呈顯著正相關(guān)的circRNAs，然后預(yù)測(cè)與IL10、IL13及Arg1具有負(fù)調(diào)控關(guān)系的miRNA，構(gòu)建出由5個(gè)circRNA、9個(gè)miRNA及3個(gè)mRNA(IL10、IL13和Arg1)組成的12對(duì)circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系(圖4)。

2.4 qPCR驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

為了驗(yàn)證構(gòu)建的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖中的部分非編碼RNA和mRNA的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了qPCR檢測(cè)(圖5)。結(jié)果顯示，circ_0000372、circ-0001571及circ-0001684在多房棘球蚴感染2月的小鼠KCs中均顯著上調(diào)表達(dá)(P<0.05)，而miR-449a-5p、miR-142a-5p、miR-182-5p、miR-466c-5p均呈顯著下調(diào)表達(dá)(P<0.05)，其靶基因IL10、IL13及Arg1均顯著上調(diào)表達(dá)(P<0.01)。circRNA、miRNA及mRNA的表達(dá)趨勢(shì)與測(cè)序結(jié)果及它們間的調(diào)節(jié)關(guān)系基本一致。

2.5 circ_0000372-miR466c-5p-IL13調(diào)控關(guān)系

以circ_0000372-miR466c-5p-IL13調(diào)控軸為例進(jìn)一步驗(yàn)證ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)(圖6)，在KCs中過表達(dá)miR466c-5p后，circ_0000372及IL13的表達(dá)水平均顯著下調(diào)(P<0.01)。結(jié)果說明circ_0000372、miR-466c-5p及IL13之間可能存在靶向調(diào)控關(guān)系。

**. P<0.01圖3 多房棘球蚴感染2月的KCs M2型標(biāo)志分子的表達(dá)水平Fig.3 Expression level of KCs M2 marker molecule in 2 months infected with E. multilocularis

圖4 與KCs M2型極化相關(guān)的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Construction of ceRNA network related with M2 polarization of KCs

3 討 論

AE于1965年在我國新疆首次被報(bào)道[32]，隨后，在甘肅、寧夏、西藏、青海、四川等地陸續(xù)出現(xiàn)病例[33-37]，嚴(yán)重威脅牧民的生命健康以及畜牧業(yè)的發(fā)展。AE在臨床上有“蟲癌”之稱，蟲體浸潤性生長壓迫肝及周圍器官，阻塞肝門靜脈引起肝功能障礙、肝硬化、繼發(fā)膽管炎，并可通過血液循環(huán)轉(zhuǎn)移至其他器官組織[38]。多數(shù)寄生蟲為了達(dá)到長期生存的目的，進(jìn)化出了多種逃避宿主免疫應(yīng)答的策略，一方面是改變其表面抗原從而逃避宿主免疫系統(tǒng)的識(shí)別，另一方面，分泌一些活性物質(zhì)，調(diào)節(jié)宿主的免疫應(yīng)答。有研究報(bào)道，多房棘球蚴感染能誘導(dǎo)宿主淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(DC)凋亡[39-40]，并可上調(diào)BALB/c小鼠肝中抗凋亡相關(guān)因子的表達(dá)水平，有利于蟲體在宿主體內(nèi)的發(fā)育和存活[41]。此外，多房棘球蚴感染誘導(dǎo)宿主Th1/Th2失衡也是其逃避宿主免疫應(yīng)答的主要手段。目前大多數(shù)研究認(rèn)為，棘球蚴感染早期宿主為了清除蟲體感染主要產(chǎn)生Th1型免疫應(yīng)答，但隨著棘球蚴的生長和轉(zhuǎn)移，機(jī)體的免疫應(yīng)答逐漸向Th2型轉(zhuǎn)化[42]。KCs是肝常駐巨噬細(xì)胞，肝炎癥受促炎的M1型KCs和抗炎的M2型KCs的平衡調(diào)節(jié)。有研究發(fā)現(xiàn)，AE晚期的KCs中抗炎細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平均高于促炎細(xì)胞因子，而且KCs能分泌大量TGF-β1，激活HSCs，進(jìn)一步促進(jìn)肝纖維化[43]。本研究通過qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，多房棘球蚴感染小鼠1月時(shí)KCs中M1表型標(biāo)志分子IL1β、TNF-α顯著上調(diào)，在感染后2和3月時(shí)M1型標(biāo)志分子均顯著下調(diào)，而M2型標(biāo)志分子卻顯著上調(diào)，說明多房棘球蚴感染后期誘導(dǎo)KCs向M2型極化，這一結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了先前的報(bào)道。

*. P<0.05，**. P<0.01, ***. P<0.000 1, ns. P>0.05圖5 qPCR驗(yàn)證ceRNA網(wǎng)絡(luò)Fig.5 CeRNA network verified by qPCR

**. P<0.01，***. P<0.001圖6 circ_0000372-miR466c-5p-IL13調(diào)控軸驗(yàn)證Fig.6 Verification of circ_0000372-miR466c-5p-IL13 axis

miRNA參與巨噬細(xì)胞的極化，而且與巨噬細(xì)胞的極化相關(guān)的miRNAs具有治療炎癥相關(guān)疾病的潛力[44]。既然miRNAs 與多房棘球蚴感染引起的巨噬細(xì)胞極化有關(guān)，而circRNA又能競(jìng)爭(zhēng)性與miRNAs的靶基因結(jié)合，那么circRNA也可能參與多房棘球蚴誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化。Li等[45]發(fā)現(xiàn)食管鱗狀細(xì)胞癌中circRNA ciRS-7顯著上調(diào)，而miR-7卻顯著下調(diào)，說明ciRS-7可能通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-7，消除miR-7的腫瘤抑制作用。推測(cè)ciRS-7可作為預(yù)測(cè)疾病預(yù)后的生物標(biāo)志物和食管鱗狀細(xì)胞癌患者的潛在治療靶點(diǎn)。Liu等[46]用小鼠異種移植模型探索了circ_0000372對(duì)直腸癌體內(nèi)生長的影響，發(fā)現(xiàn)circ_0000372通過結(jié)合miR-495而上調(diào)了IL6的表達(dá)，可能參與JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活，而當(dāng)干擾circ_0000372時(shí)，則顯著抑制了體外直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲及體內(nèi)腫瘤的生長。說明circ_0000372-miR-495-IL6調(diào)控軸在直腸癌進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)，多房棘球蚴感染小鼠后2月時(shí)circ_0000372的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，而miR-466c-5p的水平顯著下調(diào)，同時(shí)miR-466c-5p的靶基因IL13的表達(dá)顯著上調(diào)。推測(cè)circ_0000372-miR-466c-5p-IL13軸可能參與了M2型巨噬細(xì)胞極化過程。為了驗(yàn)證這種調(diào)控關(guān)系，將miR-466c-5p在KCs中過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)circ_0000372和IL13均被顯著下調(diào)，說明多房棘球蚴感染可誘導(dǎo)circ_0000372的顯著上調(diào)，從而競(jìng)爭(zhēng)性與miR-466c-5p結(jié)合，引起miR-466c-5p的水平下調(diào)，最終導(dǎo)致其靶基因IL13的表達(dá)水平上調(diào)。此外，從構(gòu)建的ceRNA網(wǎng)絡(luò)圖中，驗(yàn)證了circ_0001684-miR-182-5p-IL13軸、circ_0001571-miR-449a-5p-IL13軸、circ_000896-miR-142-5p-IL10/Arg1軸上基因的表達(dá)趨勢(shì)均與預(yù)期的一致。推測(cè)這些ceRNAs對(duì)mRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系可能在多房棘球蚴感染誘導(dǎo)宿主M2型巨噬細(xì)胞極化過程中均發(fā)揮一定的作用。上述研究結(jié)果充分表明，多個(gè)circRNAs和miRNAs參與了多房棘球蚴感染誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化，而且同一個(gè)mRNA的表達(dá)水平，可能受多個(gè)ncRNAs的調(diào)節(jié)，形成了復(fù)雜的circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)調(diào)控關(guān)系。因此，下一步將對(duì)該網(wǎng)絡(luò)關(guān)系進(jìn)行深入研究，為揭示ncRNAs在多房棘球蚴持續(xù)感染中所發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用提供更多的理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

多房棘球蚴感染BALB/c小鼠后，其肝KCs由抗炎的M1型逐漸向抑炎的M2型極化，這一過程受一些circRNA和miRNA調(diào)控，并與之靶基因形成了復(fù)雜的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中，circ_0000372-miR-466c-5p-IL13調(diào)控軸可能發(fā)揮了重要作用。提示ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在多房棘球蚴感染誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化中發(fā)揮重要作用。