周改靜，羅俊聰，石正旺，萬 穎，楊 波，曹麗艷，宋 銳，田 宏，鄭海學(xué)

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室 OIE/國家口蹄疫參考實驗室，蘭州 730046)

非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)是一種有囊膜的大型DNA雙鏈病毒，是非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬的唯一成員，也是目前唯一已知的蟲媒DNA病毒[1-2]。野豬感染后一般形成持續(xù)性感染而不表現(xiàn)任何疾病形式，而家豬常表現(xiàn)為高熱、皮膚發(fā)紺、內(nèi)臟器官出血、淋巴結(jié)腫大等癥狀[3-4]，且死亡率高達(dá)100%。由于ASFV基因組龐大，編碼蛋白復(fù)雜，免疫逃逸機(jī)制尚不清楚等[5]，迄今為止，全球范圍內(nèi)仍沒有可用的商品化疫苗，非洲豬瘟(African swine fever，ASF)的防控及凈化仍面臨著巨大挑戰(zhàn)，因此，早期、快速、準(zhǔn)確的檢測仍是目前國內(nèi)外ASF防控的重要環(huán)節(jié)。

在目前已知的50多種ASFV結(jié)構(gòu)蛋白中，p30、p54及p72因具有良好的免疫原性及保守性，是目前ASF血清學(xué)診斷的主要靶標(biāo)[6]。其中，p30蛋白由CP204L基因編碼，位于內(nèi)囊膜上，是ASFV最具有免疫原性的蛋白之一[4,7]，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生具有一定中和作用的抗體[8]，研究表明，在感染后7～10 d即可產(chǎn)生該抗體，且持續(xù)時間較長[9]。此外，p30是一個早期表達(dá)蛋白，研究表明，在感染后2 h便可檢測到該蛋白，并持續(xù)整個感染周期[10]，與其他蛋白相比，具有更高的抗體檢測效率，大大提高了陰性血清和陽性血清的區(qū)分能力[11]。綜上所述，p30是用于ASFV抗體檢測的一個良好靶標(biāo)蛋白。

本研究將ASFVCP204L基因進(jìn)行原核表達(dá)，并成功制備出1株具有良好阻斷效果的p30單克隆抗體，以此為基礎(chǔ)，建立了一種阻斷ELISA抗體檢測方法，可用于ASFV的感染診斷及流行病學(xué)調(diào)查，為ASF的防控提供一種有效的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

pET-32a載體、SP2/0細(xì)胞、MA104細(xì)胞、ASFV陰性血清、豬瘟病毒(CSFV)陽性血清、O型口蹄疫病毒(FMDV-O)陽性血清、A型口蹄疫病毒(FMDV-A)陽性血清、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)陽性血清、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)陽性血清、塞內(nèi)卡病毒(SVA)陽性血清均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室保存；ASFV CN/GS/2018分離株、ASFV滅活陽性血清及208份滅活豬血清樣品均由國家非洲豬瘟區(qū)域?qū)嶒炇?蘭州)提供；ASFV基因缺失弱毒株由本實驗室制備[12]；BALB/c小鼠購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實驗動物中心；ASFV阻斷ELISA抗體檢測試劑盒購自西班牙Ingenasa公司；HRP Conjugation Kit-Lighting-Link?試劑盒購自Abcam公司；Ni柱親和層析樹脂購自O(shè)MEGA公司。

1.2 p30重組蛋白的制備及鑒定

將ASFVCP204L基因(GenBank ID：MK128995.1)構(gòu)建至pET-32a載體中，將重組質(zhì)粒pET-32a-p30轉(zhuǎn)化至E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞中。挑取單克隆菌落于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。收集菌體，用PBS洗滌2次，超聲破碎后分離上清和沉淀，通過SDS-PAGE分析可溶性。用緩沖液(50 mmol·L-1Tris-HCl、2 mmol·L-1EDTA及100 mmol·L-1NaCl溶于PBS，pH 7.4)對菌體沉淀進(jìn)行重懸并超聲，重復(fù)5次后，用8 mol·L-1尿素對沉淀進(jìn)行溶解，并于4 ℃過夜透析至4 mol·L-1濃度。將溶解的包涵體蛋白加入平衡液平衡后的Ni柱中結(jié)合3～5 min，用50 mmol·L-1咪唑洗雜6次，100 mmol·L-1咪唑洗雜5次，最后用250 mmol·L-1咪唑洗脫目的蛋白。用SDS-PAGE分析純化結(jié)果，用Western blot鑒定與ASFV陽性血清的反應(yīng)活性。

Western blot：用純化的p30重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，并轉(zhuǎn)印至NC膜上；5%脫脂乳室溫封閉2 h；用ASFV陽性血清(1∶500)4 ℃過夜孵育；PBST洗滌30 min，用HRP標(biāo)記的豬二抗(1∶1 000)室溫孵育1 h；PBST洗滌30 min，顯色液曝光。

1.3 p30單克隆抗體的制備及鑒定

用純化的p30重組蛋白以100 μg·只-1的劑量免疫6～8周齡的BALB/c小鼠，免疫3次，間隔2周。取免疫小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合[13]，采用間接ELISA及間接免疫熒光(IFA)方法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞株。通過有限稀釋法對單克隆陽性孔進(jìn)行3次亞克隆。對穩(wěn)定分泌p30單抗的陽性孔進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并制備腹水。腹水單抗用正辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行純化，并進(jìn)行HRP標(biāo)記。

間接ELISA：用純化的p30重組蛋白以2 μg·mL-1的濃度包被酶標(biāo)板(50 μL·孔-1)；將雜交瘤細(xì)胞上清加入檢測孔中(50 μL·孔-1)，并設(shè)置陽性對照(融合鼠血清，1∶500)及陰性對照(SP2/0細(xì)胞上清)，37 ℃孵育30 min；PBST洗4次并拍干，加入HRP標(biāo)記的鼠二抗(1：20 000，50 μL·孔-1)，37 ℃孵育30 min；PBST洗4次并拍干，加入TMB(50 μL·孔-1)，37 ℃顯色12 min(避光)；加入終止液(50 μL·孔-1)，酶標(biāo)儀讀取OD450 nm值。

IFA：用1 MOI的ASFV CN/GS/2018分離株感染MA104細(xì)胞，同時設(shè)置陰性對照；培養(yǎng)48 h后棄培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛，室溫固定30 min；PBS洗3次，加入0.1% Triton，室溫通透10 min；PBS洗3次，加入5% BSA，室溫封閉1 h；PBS洗1次，加入雜交瘤細(xì)胞上清，4 ℃過夜孵育；PBST洗3次，加入FITC標(biāo)記的鼠二抗(1∶100)，室溫孵育1 h；PBST洗3次，用DAPI染核10 min。置于熒光顯微鏡下觀察熒光并拍照。

1.4 p30阻斷ELISA方法的建立及反應(yīng)條件的優(yōu)化

根據(jù)方陣滴定法，用碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)將p30重組蛋白從16 μg·mL-1倍比稀釋至0.125 μg·mL-1，分別包被至酶標(biāo)板，50 μL·孔-1，4 ℃包被12 h；PBST洗4次并拍干，加入1% BSA，120 μL·孔-1，4 ℃封閉10 h；棄液并拍干。將ASFV陰、陽性血清用1% BSA分別作0、1∶2、1∶5、1∶10稀釋，同時設(shè)置空白對照孔(PBST)，50 μL·孔-1，每個稀釋度重復(fù)3孔，37 ℃孵育30 min；PBST洗4次并拍干，加入1∶20 000稀釋的酶標(biāo)單抗，50 μL·孔-1，37 ℃孵育30 min；PBST洗4次并拍干，加入TMB(50 μL·孔-1)，37 ℃顯色12 min(避光)；加入終止液(50 μL·孔-1)，酶標(biāo)儀讀取OD450 nm值。

根據(jù)阻斷率(percentage inhibition，PI)公式：PI(%)=(1-OD450 nm待檢血清/OD450 nm空白對照)×100，計算PPI(陽性阻斷率)和NPI(陰性阻斷率)。并根據(jù)公式：DPI=PPI-NPI，計算DPI(阻斷率差值)。選擇DPI值最高的反應(yīng)條件作為最佳抗原包被濃度和血清稀釋度。

按照上述操作步驟，以確定的最佳抗原包被濃度和血清稀釋度繼續(xù)對最佳封閉液(1% BSA、5%脫脂乳、1%明膠)、血清孵育時間(15、30、45、60 min)、酶標(biāo)單抗稀釋度(1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000、1∶30 000、1∶40 000、1∶50 000)、酶標(biāo)單抗孵育時間(15、30、45、60 min)、底物顯色時間(5、10、15、20 min)等條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.5 阻斷ELISA方法臨界值的確定

按照已優(yōu)化的阻斷ELISA條件檢測155份血清樣品(62份ASFV滅活陽性血清和93份ASFV陰性血清)，計算每份樣品的PI值。用SPSS 23.0 軟件將PI值繪制成縱坐標(biāo)為敏感性、橫坐標(biāo)為(1-特異性)的ROC(receiver operating characteristic)曲線，并以Youden指數(shù)[Youden指數(shù)=敏感性-(1-特異性)]最大時對應(yīng)的PI值為臨界值(cut-off值)[14-15]。

1.6 阻斷ELISA方法特異性檢測

按照已優(yōu)化的阻斷ELISA條件檢測CSFV、FMDV-O/A、PRRSV、PEDV、SVA陽性血清，同時設(shè)置ASFV陽性血清作為對照，每份樣品重復(fù)2次，計算PI值，評價該方法的特異性。

1.7 阻斷ELISA方法敏感性檢測

將ASFV陽性血清從原液開始倍比稀釋至1∶2 048，用本研究建立的阻斷ELISA方法與Ingenasa 公司生產(chǎn)的ASFV阻斷ELISA抗體檢測試劑盒同時進(jìn)行檢測，分析該方法的敏感性。

1.8 阻斷ELISA方法重復(fù)性檢測

用同一批次包被的酶標(biāo)板檢測隨機(jī)挑選的3份陽性血清和3份陰性血清，計算批內(nèi)變異系數(shù)。并用3批次包被的酶標(biāo)板對這6份血清進(jìn)行檢測，計算批間變異系數(shù)。每個血清設(shè)置2個重復(fù)。

1.9 p30抗體檢測

為掌握p30抗體消長規(guī)律，用本方法對ASFV基因缺失弱毒株攻毒后的豬血清進(jìn)行追蹤檢測。5頭豬編號分別為：Pig 1、Pig 2、Pig 3、Pig 4、Pig 5，分別于攻毒后第1～17天采集血清，間隔1 d。

1.10 臨床樣品檢測

用本研究建立的阻斷ELISA方法與Ingenasa 公司生產(chǎn)的ASFV阻斷ELISA抗體檢測試劑盒同時檢測208份豬血清，根據(jù)公式[16]計算Kappa值。若0

2 結(jié) 果

2.1 p30重組蛋白的純化及鑒定

SDS-PAGE分析顯示，該原核表達(dá)的p30重組蛋白主要以包涵體的形式存在(圖1A)，分子量約為45 ku，且Ni柱純化后具有較高的純度(圖1B)；Western blot結(jié)果顯示，純化后的p30蛋白與ASFV陽性血清具有良好的反應(yīng)性(圖1C)。

2.2 p30單克隆抗體的制備及鑒定

用間接ELISA及IFA對雜交瘤細(xì)胞上清進(jìn)行鑒定，并通過有限稀釋法對陽性孔進(jìn)行3次亞克隆，最終獲得1株p30單抗，命名為3B2。間接ELISA結(jié)果顯示，該株單抗與p30蛋白具有良好的反應(yīng)性(圖2A)；IFA結(jié)果顯示，該株單抗與ASFV具有良好的反應(yīng)性(圖2B)。

M. 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. pET-32a-p30未誘導(dǎo)菌；2. pET-32a-p30誘導(dǎo)菌；3. pET-32a-p30誘導(dǎo)菌超聲上清；4. pET-32a-p30誘導(dǎo)菌超聲沉淀；5. 純化后的p30重組蛋白M. Protein marker;1. Non-induced pET-32a-p30; 2. Induced pET-32a-p30; 3. Ultrasonic supernatant of induced pET-32a-p30; 4. Ultrasonic precipitation of induced pET-32a-p30; 5. Recombinant p30 protein after purification圖1 p30重組蛋白的SDS-PAGE分析(A、B)及Western blot鑒定(C)Fig.1 Identification of recombinant p30 protein with SDS-PAGE (A, B) and Western blot (C)

圖2 p30單克隆抗體的間接ELISA(A)及IFA(B)鑒定Fig.2 Identification of p30 monoclonal antibody with indirect ELISA(A) and IFA(B)

2.3 阻斷ELISA方法最佳反應(yīng)條件的確定

經(jīng)條件優(yōu)化，確定了該阻斷ELISA方法的最佳反應(yīng)條件，如下：抗原最佳包被濃度為2 μg·mL-1，4 ℃包被12 h；最佳封閉液為1% BSA，4 ℃封閉10 h；待檢血清最佳稀釋度為原液，最佳孵育時間為37 ℃下孵育30 min；酶標(biāo)單抗最佳稀釋度為1∶20 000，最佳孵育時間為37 ℃下孵育30 min；底物溶液最佳顯色時間為37 ℃下避光顯色15 min。

2.4 阻斷ELISA方法臨界值的確定

按照優(yōu)化的反應(yīng)條件檢測62份陽性血清和93份陰性血清，讀取OD450 nm值并計算PI值。用SPSS 23.0將PI值繪制成ROC曲線(圖3)，計算每個cut-off值對應(yīng)的Youden指數(shù)。結(jié)果顯示，當(dāng)PI臨界值為16.63%時，Youden指數(shù)達(dá)到最大值0.98，此時靈敏度為98%，特異性為100%(表1)，表明此時本方法具有較好的檢測準(zhǔn)確性，因此，該方法的臨界值定為16.63%。

圖3 ROC曲線Fig.3 ROC curve

2.5 阻斷ELISA方法特異性檢測

用本研究建立的阻斷ELISA方法同時檢測ASFV、CSFV、FMDV-O/A、PRRSV、PEDV、SVA陽性血清，結(jié)果顯示CSFV、FMDV-O/A、PRRSV、PEDV、SVA陽性血清的PI值均低于16.63%，ASFV陽性血清的PI值遠(yuǎn)高于16.63%(圖4)，表明該方法的特異性良好，與其他6種常見的豬病原無交叉反應(yīng)。

2.6 阻斷ELISA方法敏感性檢測

用本研究建立的阻斷ELISA方法和Ingenasa 公司的阻斷ELISA抗體檢測試劑盒同時檢測從原液倍比稀釋至1∶2 048的ASFV陽性血清，結(jié)果顯示，本研究建立的阻斷ELISA方法最低能檢測到1∶128稀釋的ASFV陽性血清，Ingenasa公司的阻斷ELISA抗體檢測試劑盒最低可檢測到1∶256稀釋的ASFV 陽性血清(圖5)，兩者相差一個稀釋度，表明本方法敏感性良好。

表1 不同臨界值下的敏感性和特異性

圖4 阻斷ELISA特異性檢測結(jié)果Fig.4 The specificity results of blocking ELISA

圖5 本方法與Ingenasa 阻斷ELISA敏感性檢測結(jié)果Fig.5 The sensitivity results of the blocking ELISA method established in this study and the Ingenasa method

2.7 阻斷ELISA方法重復(fù)性檢測

用本研究建立的阻斷ELISA方法檢測3個陽性血清和3個陰性血清，進(jìn)行批內(nèi)和批間試驗，結(jié)果顯示，批內(nèi)變異系數(shù)為0.28%～7.80%，批間變異系數(shù)為2.14%～9.16%，批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于10%(表2)，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.8 p30抗體檢測

由圖6抗體消長曲線可知，5頭豬在攻毒后第7天開始產(chǎn)生免疫應(yīng)答，第9天抗體均轉(zhuǎn)陽，之后抗體水平逐漸升高，與之前的研究報道[9]基本一致。

表2 重復(fù)性試驗結(jié)果

圖6 p30抗體消長曲線Fig.6 The curve of p30 antibody growth and decline

2.9 臨床樣品檢測

用本研究建立的阻斷ELISA方法與商品化的Ingenasa ASFV阻斷ELISA抗體檢測試劑盒同時檢測208份豬血清樣品，根據(jù)公式計算Kappa值。結(jié)果顯示，Kappa值為0.96>0.75，表明本研究建立的阻斷ELISA方法與商品化試劑盒具有高度一致性(表3)。

表3 比對試驗結(jié)果

3 討 論

ASFV感染家豬后致死率可高達(dá)100%，而我國作為世界上最大的生豬養(yǎng)殖和消費國，近年來受到該病的毀滅性打擊[18]。在沒有有效疫苗及治療性藥物的形勢下，早期的診斷檢測對ASF防控至關(guān)重要。隨著疫病的發(fā)展和流行，國內(nèi)耐過豬、亞臨床癥狀的長期感染豬及弱毒性的基因突變?nèi)笔Ф局瓴粩喑霈F(xiàn)，單一的病原學(xué)檢測或血清學(xué)檢測已不能滿足對ASFV感染豬進(jìn)行監(jiān)測的需要，聯(lián)合核酸檢測與血清學(xué)抗體檢測的方法成為新形勢下我國ASF防控與凈化的重要手段，但國內(nèi)尚無批準(zhǔn)的抗體檢測試劑盒，國外有西班牙Ingenasa公司、瑞典Svanova公司和法國ID Vet公司生產(chǎn)的試劑盒[19-20]，但價格都比較昂貴，因此，亟需研制出國內(nèi)可用的,精準(zhǔn)、快速的ASFV抗體檢測方法。

p30蛋白因具有免疫原性好、保守性好、早期表達(dá)且長期存在等特點，成為ASFV診斷檢測的重要靶點。2000年Barderas等[21]及2006年P(guān)érez-Filgueira等[22]均基于p30蛋白建立了與OIE推薦方法敏感性相當(dāng)且特異性更好的ELISA檢測方法，2016年Giménez-Lirola等[9]基于p30蛋白建立了可檢測感染后8～10 d血清和口腔液中ASFV抗體的間接ELISA方法，2021年于浩洋等[23]基于真核表達(dá)的p30蛋白也建立了具有良好特異性和敏感性的阻斷ELISA方法。此外，p30蛋白也已被應(yīng)用到商品化ELISA檢測試劑盒中，例如ID-Vet公司研制的ASFV間接及競爭ELISA抗體檢測試劑盒。

本研究建立的p30阻斷ELISA檢測方法與同年于浩洋等[23]建立的相比，待檢血清及酶標(biāo)二抗孵育時間均減少一半，且待檢樣品無需稀釋，總的檢測時間相對縮短1 h，與Ingenasa公司生產(chǎn)的ASFV阻斷ELISA抗體檢測試劑盒相比也減少了至少0.5 h。本方法的臨界值是由ROC曲線分析所得，ROC曲線是用真陽性率(敏感性)和假陽性率(1-特異性)作圖所得出的[24]，它可表示靈敏度和特異度之間的相互關(guān)系。然后通過計算Youden指數(shù)來篩選該方法的最佳臨界值，Youden指數(shù)=敏感性-(1-特異性)，Youden指數(shù)越大，所對應(yīng)的臨界值越具有真實性[15, 25]。這種方法與陰性對照平均值±2SD或3SD確定臨界值的方法相比，權(quán)衡了敏感性與特異性，所確定的臨界值最大可能地降低了假陽性與假陰性之和[26]，因此是目前最具有科學(xué)性的一種臨界值確定方法。本方法的Youden指數(shù)最大為0.98，此時，敏感性為98%、特異性為100%，所對應(yīng)的阻斷率即臨界值為16.63%，這表明該方法具有較好的陰性和陽性血清區(qū)分能力。

研究結(jié)果表明，本方法具有較好的特異性，與目前豬場常見的其他6種豬病毒的陽性血清均不發(fā)生交叉反應(yīng)；最低可以檢測出1∶128稀釋的陽性血清；批內(nèi)及批間變異系數(shù)均小于10%，具有良好的重復(fù)性。Kappa統(tǒng)計量作為一種矯正機(jī)遇可能后衡量一致性的方法，在獸醫(yī)實驗室中評估兩種檢測方法、兩臺儀器設(shè)備等的符合程度及同一種方法多次測定結(jié)果是否可以重現(xiàn)方面均有適用性，Kappa值越大，表明兩者的一致性越高。本研究用Kappa值來評估本方法與商品化試劑盒檢測結(jié)果的一致性，與國內(nèi)同類研究相比排除了機(jī)遇因素，更具有科學(xué)依據(jù)[17]。此外，利用本方法追蹤檢測ASFV基因缺失弱毒株攻毒后的血清抗體水平，數(shù)據(jù)顯示攻毒后第9天抗體均為陽性，這與之前研究報道[9]基本一致，進(jìn)一步說明本方法可用于ASFV感染動物的檢測以及豬群ASFV抗體的監(jiān)測。

4 結(jié) 論

本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了p30蛋白，并篩選到1株具有良好阻斷效果的p30單克隆抗體；基于該蛋白及阻斷單克隆抗體成功建立了一種操作簡便、快速，且具有良好特異性、敏感性及重復(fù)性的阻斷ELISA方法。本方法與商品化試劑盒相比具有高度一致性，可用于ASF的臨床樣品檢測、流行病學(xué)調(diào)查及豬群免疫水平監(jiān)測。本方法將進(jìn)一步優(yōu)化測試以形成商品化的ASFV抗體檢測試劑盒，為我國ASF的防控提供技術(shù)支撐。