魯奕君，陳鴻凱，蔡 亮，呂 強，何 毅

膀胱癌是全球范圍內(nèi)最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，男性發(fā)病率明顯高于女性[1]。隨著診療水平的發(fā)展，膀胱癌患者的預(yù)后有所改善，由于膀胱癌的高復(fù)發(fā)率和侵襲性，多數(shù)膀胱癌患者的臨床治療效果較差[2]。探究膀胱癌惡性增殖和轉(zhuǎn)移的調(diào)控因子，對提高膀胱癌患者5年生存率具有重要臨床意義。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一組大于200個堿基長度的內(nèi)源性RNA分子，缺乏開放閱讀框，不具有編碼蛋白的能力[3]。近年來研究顯示，lncRNA在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后可調(diào)節(jié)靶基因的表達，影響細(xì)胞的生理和病理過程[4]。大量研究顯示，膀胱癌中存在多種lncRNA的異常表達，與膀胱癌細(xì)胞的活力、侵襲性、血管形成等過程相關(guān)，lncRNA可能成為膀胱癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的分子診斷標(biāo)志物[5-7]。RP11-635L1.2由748個堿基組成，定位于4號染色體。RP11-635L1.2在膀胱癌發(fā)病過程中的分子機制研究很少。本研究通過分析RP11-635L1.2在膀胱癌組織和細(xì)胞系中的表達水平，探究RP11-635L1.2對膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)行為的作用及其分子機制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系和試劑 膀胱癌細(xì)胞系MGH-U3、253J、J82、T24和永生化膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、CCK-8試劑盒、基質(zhì)膠購于日本Takara公司；Lipofectamine 2000和胎牛血清購于美國Invitrogen公司；空載質(zhì)粒(pcDNA3-NC)和RP11-635L1.2過表達質(zhì)粒(pcDNA3-RP11-635L1.2)、qRT-PCR試劑盒購于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；miR-NC和miR-373-3p mimics購于廣州銳博生物科技有限公司；Transwell小室、雙熒光報告載體野生型RP11-635L1.2和突變型RP11-635L1.2購于美國Promega公司；p-EGFR、p-AKT、p-ERK、p-JAK2、p-STAT3、α-Tubulin抗體購于美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2生物信息學(xué)技術(shù)分析 登錄GEPIA數(shù)據(jù)庫分析RP11-635L1.2在膀胱癌組織和癌旁正常組織中的表達水平，登錄LncCeRBase數(shù)據(jù)庫分析比較與RP11-635L1.2存在高度保守互補序列的微小RNA(miRNA)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 所有細(xì)胞置于37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱中，使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)MGH-U3、J82、T24細(xì)胞，使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)253J和SV-HUC-1細(xì)胞。選取J82細(xì)胞對RP11-635L1.2進行功能性研究，分為NC組和RP11-635L1.2組，根據(jù)Lipofectamine 2000試劑盒說明書分別轉(zhuǎn)染pcDNA3-NC質(zhì)粒和pcDNA3-RP11-635L1.2質(zhì)粒。

1.4qRT-PCR檢測RP11-635L1.2和miR-373-3p的相對表達水平 采用Trizol法提取各細(xì)胞及轉(zhuǎn)染后的2組J82細(xì)胞總RNA，進一步逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。RP11-635L1.2表達水平以GAPDH為內(nèi)參，miR-373-3p表達水平以U6為內(nèi)參。設(shè)計引物序列，GAPDH上游引物：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，下游引物：5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3'；RP11-635L1.2上游引物：5'-CTCTCTCCAAGTCCCAGTCG-3'，下游引物：5'-TAGGAAGTTGGCAGGGAAGA-3'；miR-373-3p上游引物：5'-GAAGTGCTTCGATTTTGCC-3'，下游引物：5'-GAATACCTCGGACCCTGC-3'；U6上游引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。設(shè)置qRT-PCR反應(yīng)條件：92 ℃ 40 s,58 ℃ 28 s,72 ℃ 28 s,循環(huán)36次，以2-ΔΔCt法計算RP11-635L1.2和miR-373-3p的相對表達水平。

1.5CCK-8法檢測J82細(xì)胞增殖能力 將2組J82細(xì)胞以2×103個/孔的密度均勻接種在96孔板中，培養(yǎng)12 h至細(xì)胞貼壁。以細(xì)胞貼壁為0 d，分別于1、2、3、4、5 d的同一時刻更換新鮮培養(yǎng)基，在每孔中加入CCK-8試劑30 μl，震蕩均勻。37 ℃避光環(huán)境孵育240 min，調(diào)整酶標(biāo)儀波長為450 nm，檢測每孔J82細(xì)胞的吸光度(A)值。

1.6Transwell實驗檢測J82細(xì)胞侵襲能力 2組J82細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，采用磷酸鹽緩沖液清洗4次，胰蛋白酶消化，細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)。在Transwell上層小室鋪一層基質(zhì)膠，于培養(yǎng)箱中凝固。2組細(xì)胞按照2×104個/孔密度加至Transwell上層小室，在Transwell下層加入含30%血清的RPMI-1640培養(yǎng)基溶液700 μl，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)28 h。采用多聚甲醛凝固、結(jié)晶紫溶液染色，流水沖洗后室溫晾干，在倒置顯微鏡下計數(shù)。

1.7雙熒光素酶報告實驗 選取對數(shù)生長期的J82細(xì)胞進行雙熒光素酶報告實驗，分別提取雙熒光報告載體野生型RP11-635L1.2質(zhì)粒和突變型RP11-635L1.2質(zhì)粒，分別與miR-NC或miR-373-3p共轉(zhuǎn)染至J82細(xì)胞。培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染52 h后，低溫裂解細(xì)胞，分別測定細(xì)胞螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶表達強度，其比值即為相對熒光素酶活性。

1.8Western blot實驗 吸去2組細(xì)胞培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液洗4次，每孔加細(xì)胞裂解液200 μl，冰浴裂解40 min，離心取上清蛋白。通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，以220 mA電流轉(zhuǎn)膜至聚丙烯酰胺膜，封閉液封閉3.5 h，加入一抗p-EGFR(1∶1000稀釋)、p-ERK(1∶2000稀釋)、p-JAK2(1∶1000稀釋)、α-Tubulin(1∶5000稀釋)、p-AKT(1∶2000稀釋)、p-STAT3(1∶1000稀釋)，孵育12 h。室溫下與羊抗鼠二抗(1∶5000稀釋)孵育3.5 h。加入化學(xué)顯影液反應(yīng)30 s，在凝膠成像儀中成像。

2 結(jié)果

2.1RP11-635L1.2在膀胱癌組織中的表達 與癌旁正常組織比較，膀胱癌組織中RP11-635L1.2的表達明顯降低(P<0.01)，見圖1。

圖1 膀胱癌組織和癌旁正常組織中RP11-635L1.2的表達

2.2RP11-635L1.2在膀胱癌細(xì)胞系中的表達 與永生化膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1比較，膀胱癌細(xì)胞系MGH-U3、253J、J82、T24中RP11-635L1.2的表達水平明顯降低(P<0.05，P<0.01)，其中RP11-635L1.2在J82細(xì)胞中的表達水平最低，見圖2。

圖2 膀胱癌細(xì)胞系中RP11-635L1.2的表達

2.3轉(zhuǎn)染后J82細(xì)胞中RP11-635L1.2的表達情況 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，NC組和RP11-635L1.2組J82細(xì)胞中RP11-635L1.2表達水平分別為1.01±0.57和10.48±3.12，與NC組相比，RP11-635L1.2組J82細(xì)胞RP11-635L1.2表達水平明顯升高(P<0.01)。

2.4RP11-635L1.2對J82細(xì)胞增殖的影響 CCK-8法檢測顯示，相比NC組，RP11-635L1.2組從第2日開始J82細(xì)胞增殖能力明顯降低(P<0.05，P<0.01)。見圖3。

圖3 RP11-635L1.2對膀胱癌J82細(xì)胞增殖的影響與NC組比較，①P<0.05，②P<0.01

2.5RP11-635L1.2對J82細(xì)胞侵襲能力的影響 Transwell實驗顯示，NC組和RP11-635L1.2組J82細(xì)胞侵襲量分別為(60.24±16.47)個和(24.32±11.30)個，與NC組相比，RP11-635L1.2組J82細(xì)胞侵襲量明顯減少(P<0.01)。見圖4。

圖4 RP11-635L1.2對膀胱癌J82細(xì)胞侵襲能力的影響

2.6RP11-635L1.2對miR-373-3p的靶向作用 利用LncCeRBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測，RP11-635L1.2與miR-373-3p存在互補結(jié)合的序列，見圖5。雙熒光素酶報告實驗顯示，野生型RP11-635L1.2與miR-373-3p共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性明顯低于與miR-NC共轉(zhuǎn)染組(P<0.01)，當(dāng)RP11-635L1.2與miR-373-3p結(jié)合區(qū)域突變后，miR-373-3p對細(xì)胞的熒光素酶活性無明顯影響(P>0.05)。見圖6。

圖5 RP11-635L1.2與miR-373-3p存在高度保守互補序列

圖6 雙熒光素酶報告實驗結(jié)果

2.7RP11-635L1.2對miR-373-3p表達的影響 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，NC組和RP11-635L1.2組膀胱癌J82細(xì)胞miR-373-3p表達水平分別為5.12±1.28和0.99±0.35，過表達RP11-635L1.2抑制了J82細(xì)胞miR-373-3p的相對表達(P<0.01)。

2.8RP11-635L1.2對膀胱癌J82細(xì)胞EGFR/AKT信號通路蛋白表達的影響 相比NC組，RP11-635L1.2組EGFR/AKT信號通路蛋白p-EGFR、p-AKT、p-ERK、p-JAK2、p-STAT3表達量明顯降低(P<0.01)，見圖7。

圖7 RP11-635L1.2對J82細(xì)胞EGFR/AKT信號通路蛋白表達的影響

3 討論

lncRNA的異常表達可顯著影響細(xì)胞內(nèi)癌基因或抑癌基因的表達，改變細(xì)胞的增殖活性、侵襲性、凋亡水平等，從而誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生[8-10]。目前研究證實，越來越多的lncRNA與膀胱癌發(fā)病密切相關(guān)[11-12]。LI等[13]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA LINC00355在膀胱癌組織中上調(diào)，尤其是在TNM分期較差的組織中，其高表達與膀胱癌患者的不良預(yù)后相關(guān)，沉默lncRNA LINC00355抑制了膀胱癌細(xì)胞的遷移、侵襲、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。SHEN等[14]研究顯示，與正常組織相比，膀胱癌組織中l(wèi)ncRNA MAGI2-AS3表達顯著下調(diào)，并且與腫瘤分期和預(yù)后不良呈負(fù)相關(guān)，其過表達可抑制膀胱癌細(xì)胞的遷移和侵襲。YANG等[15]報道，lncRNA LINC01133在永生化膀胱上皮細(xì)胞外泌體中的表達明顯高于在膀胱癌細(xì)胞中的表達，提示含有l(wèi)ncRNA LINC01133的外泌體通過誘導(dǎo)Wnt信號通路失活來抑制腫瘤細(xì)胞活力、遷移和侵襲。但在膀胱癌細(xì)胞增殖和侵襲過程中RP11-635L1.2的作用尚未明確。

本研究首先通過GEPIA數(shù)據(jù)庫分析相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，RP11-635L1.2在膀胱癌組織中表達下調(diào)。在此基礎(chǔ)上本研究通過qRT-PCR檢測顯示，與永生化膀胱上皮細(xì)胞相比，RP11-635L1.2在膀胱癌細(xì)胞系中表達下調(diào)，意味著RP11-635L1.2可能在膀胱癌的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。本研究進一步通過體外培養(yǎng)J82細(xì)胞并給予RP11-635L1.2過表達質(zhì)粒，結(jié)果表明RP11-635L1.2不僅能夠抑制J82細(xì)胞的增殖能力，而且對細(xì)胞的侵襲能力表現(xiàn)出拮抗作用。

明確lncRNA的靶基因是探究lncRNA分子機制的重要環(huán)節(jié)[16]。近年來多項研究表明，lncRNA通過與miRNA 5'端互補配對結(jié)合，造成游離miRNA表達顯著降低，從而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[17-18]。本研究通過LncCeRBase生物數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，RP11-635L1.2與miR-373-3p存在結(jié)合位點。研究顯示，腎透明細(xì)胞癌組織中miR-373-3p表達高于相鄰非腫瘤組織，其可促進細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞凋亡和維持線粒體膜電位，起到促腫瘤作用[19]。與體檢健康者相比，食管鱗狀細(xì)胞癌患者術(shù)前血清miR-373-3p表達水平顯著升高，而且miR-373-3p在癌組織中的表達水平顯著高于癌旁正常組織，并指出miR-373-3p啟動子甲基化水平在癌組織中顯著降低是miR-373-3p異常高表達的原因[20]。由此可見，miR-373-3p可能是一種致癌基因。WANG等[21]研究顯示，與鄰近正常組織相比，膀胱癌組織中miR-373-3p表達水平升高，而且膀胱癌患者血清miR-373-3p表達水平高于體檢健康者，提示miR-373-3p過表達能夠促進膀胱癌細(xì)胞的增殖和侵襲。本研究通過雙熒光素酶報告實驗驗證miR-373-3p與RP11-635L1.2之間存在靶向關(guān)系。同時，qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-373-3p表達受RP11-635L1.2的負(fù)調(diào)控。此外，miR-373-3p可通過活化EGFR/AKT信號通路，促進膀胱癌的發(fā)生發(fā)展[21]。本研究還顯示，過表達RP11-635L1.2后，EGFR/AKT信號通路蛋白p-EGFR、p-AKT、p-ERK、p-JAK2、p-STAT3表達減少，提示EGFR/AKT信號通路活化程度降低，進一步證實RP11-635L1.2是通過負(fù)調(diào)控miR-373-3p參與膀胱癌病理發(fā)展的。

綜上，RP11-635L1.2在膀胱癌組織和細(xì)胞系中低表達，其通過負(fù)調(diào)控miR-373-3p抑制膀胱癌J82細(xì)胞的增殖、侵襲。RP11-635L1.2可能成為膀胱癌新的診斷標(biāo)志物和治療靶點。