国产日韩欧美一区二区三区三州_亚洲少妇熟女av_久久久久亚洲av国产精品_波多野结衣网站一区二区_亚洲欧美色片在线91_国产亚洲精品精品国产优播av_日本一区二区三区波多野结衣 _久久国产av不卡

?

新型冠狀病毒檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展

2023-01-04 12:46王子豪孔桂美
實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志 2022年11期
關(guān)鍵詞:膠體金特異性核酸

王子豪, 黃 瑤, 2, 孔桂美

(1. 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚(yáng)州, 225000; 2. 江蘇省揚(yáng)州市疾病預(yù)防控制中心, 江蘇 揚(yáng)州, 225000)

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)的迅速傳播導(dǎo)致了新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)在全球范圍內(nèi)的大流行。因此,開(kāi)發(fā)快速而高特異性的病毒檢測(cè)方法以便快速識(shí)別和隔離感染患者對(duì)控制SARS-CoV-2的傳播至關(guān)重要,是全球疫情防控的關(guān)鍵。目前,檢測(cè)SARS-CoV-2感染的方法包括病原學(xué)檢測(cè)、核酸檢測(cè)和血清學(xué)檢測(cè)。核酸檢測(cè),尤其是實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)方法具有諸多優(yōu)勢(shì),是目前檢測(cè)SARS-CoV-2感染的首選方法。血清學(xué)檢測(cè)方法主要針對(duì)血液中病毒的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè),與核酸檢測(cè)有著較好的互補(bǔ)性。本研究對(duì)目前SARS-CoV-2檢測(cè)方法的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,以期為臨床醫(yī)生及科研工作者提供參考。

1 病原學(xué)檢測(cè)

病原學(xué)檢測(cè)是直接檢測(cè)機(jī)體內(nèi)病毒感染情況的方法,是檢測(cè)SARS-CoV-2的金標(biāo)準(zhǔn)。病毒的分離、培養(yǎng)、鑒定及電鏡觀察是目前主要使用的病原學(xué)檢測(cè)方法。LIU C等[1]使用冷凍電子顯微鏡首次觀察到了SARS-CoV-2經(jīng)滅活后的真實(shí)形貌,病毒顆粒近似球形或中度多形性,刺突向外呈釘子狀,病毒體嵌入包膜內(nèi); 同時(shí),對(duì)融合后尖峰結(jié)構(gòu)的研究則表明了融合后的刺突是柔性的,并且相對(duì)于病毒膜具有有限的可變方向。非常關(guān)鍵的收獲是捕捉到了病毒即將與細(xì)胞發(fā)生融合這一重要的中間狀態(tài),這為SARS-CoV-2的識(shí)別、鑒定和臨床相關(guān)研究提供了重要的超微影像基礎(chǔ)。ZHU N等[2]從3份支氣管肺泡灌洗樣本中分離獲得病毒毒株; 同時(shí),體外培養(yǎng)表明接種人氣道上皮細(xì)胞96 h后即可觀察到細(xì)胞病變作用,直到接種后6 d, 在Vero E6和Huh-7細(xì)胞系中仍未觀察到特異性的細(xì)胞病變作用。雖然病原學(xué)檢測(cè)方法是檢測(cè)SARS-CoV-2的金標(biāo)準(zhǔn),但與其他檢測(cè)技術(shù)相比,其對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境要求極為苛刻,必須在P3級(jí)及以上的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行,同時(shí)操作過(guò)程繁瑣、耗時(shí)且難度高,難以滿足現(xiàn)階段SARS-CoV-2的檢測(cè)需求,只適用于基礎(chǔ)科學(xué)研究。

2 核酸檢測(cè)

機(jī)體感染SARS-CoV-2后會(huì)產(chǎn)生大量RNA, 而免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的抗體往往出現(xiàn)較晚,因此核酸檢測(cè)仍是目前最主要的檢測(cè)方法。核酸檢測(cè)的主要樣本來(lái)源包括感染者的鼻咽拭子、深部痰、下呼吸道分泌物、肺泡灌洗液等。

2.1 基因測(cè)序技術(shù)

隨著高通量測(cè)序技術(shù)(NGS)的迅猛發(fā)展,其在病原檢測(cè)中展現(xiàn)出一定的技術(shù)優(yōu)勢(shì),可在第一時(shí)間獲取新發(fā)未知病毒的基因組序列信息,為突發(fā)疫情的防控和后續(xù)研究提供了技術(shù)支撐。NGS可一次性地檢測(cè)包括SARS-CoV-2在內(nèi)的所有可能感染的病原微生物基因序列[3], 為獲得多重感染或繼發(fā)感染的相關(guān)病原信息提供支持。CHEN L J等[4]利用宏基因組測(cè)序(mNGS)快速檢測(cè)出患者支氣管肺泡灌洗液(BALF)標(biāo)本中的SARS-CoV-2; 進(jìn)一步的系統(tǒng)發(fā)育分析表明, SARS-CoV-2與蝙蝠冠狀病毒毒株bat-SL-CoVZC45、bat-SL-CoVZXC21具有87.9%的核苷酸同源性。WANG M等[5]結(jié)合病毒靶向擴(kuò)增和納米孔測(cè)序長(zhǎng)讀、實(shí)時(shí)的優(yōu)勢(shì),創(chuàng)造性地開(kāi)發(fā)了納米孔靶向測(cè)序(NTS)技術(shù),僅需6~10 h即可同時(shí)檢測(cè)包括SARS-CoV-2等多種常見(jiàn)的呼吸道病毒,有助于快速判斷SARS-CoV-2患者是否發(fā)生多重感染,對(duì)臨床診斷及治療具有重大的意義。同時(shí), NTS還可以檢測(cè)病毒突變,用于SARS-CoV-2的分型,為流行病學(xué)分析提供支持。雖然NGS具有高準(zhǔn)確性、高靈敏度等優(yōu)勢(shì),但鑒于其檢測(cè)儀器昂貴、檢測(cè)結(jié)果需要專業(yè)人士來(lái)解讀、檢測(cè)周期長(zhǎng)等問(wèn)題,難以進(jìn)行大規(guī)模的快速篩查。

2.2 qRT-PCR技術(shù)

qRT-PCR技術(shù)是目前臨床檢測(cè)SARS-CoV-2的主要手段。qRT-PCR技術(shù)是從樣本中分離出病毒RNA, 利用熒光信號(hào)對(duì)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)的進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè),最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。目前, SARS-CoV-2基因組中的ORF1ab基因和N基因是qRT-PCR的主要靶向。CHU D K W等[6]開(kāi)發(fā)了2種單步qRT-PCR, 用于檢測(cè)SARS-CoV-2基因組中的ORF1ab基因和N基因,通過(guò)對(duì)COVID-19患者的臨床樣本進(jìn)行進(jìn)一步系統(tǒng)性研究,證實(shí)了該方法在臨床診斷中的價(jià)值,并發(fā)現(xiàn)了N基因RT-PCR檢測(cè)對(duì)臨床樣本中的SARS-CoV-2 RNA更為敏感,約是ORF1ab基因測(cè)定的10倍。依據(jù)檢測(cè)性能,N基因RT-PCR被建議用作篩查測(cè)定,而ORF1ab基因測(cè)定則推薦作為確診測(cè)定。CORMAN V M等[7]在缺乏SARS-CoV-2分離株的條件下,利用公開(kāi)的SARS-CoV-2序列,開(kāi)發(fā)了一種針對(duì)N、E和RdRP基因的單步RT-PCR試劑盒,其中RdRP基因測(cè)定表現(xiàn)出最高的靈敏度。CHAN J F W等[8]開(kāi)發(fā)了針對(duì)RdRp/Hel不同區(qū)域的新型檢測(cè)方法,對(duì)于不同類型的臨床樣本均顯示出較之前開(kāi)發(fā)的RdRp-P2基因測(cè)定法更高的靈敏度。更重要的是,RdRp/Hel檢測(cè)方法與其他常見(jiàn)呼吸道病原體無(wú)交叉反應(yīng),具有高度特異度。

盡管qRT-PCR技術(shù)具有成本較低、操作簡(jiǎn)便、快速、高靈敏度和高特異度等特點(diǎn),但仍有缺點(diǎn),例如采樣方式的不規(guī)范以及感染早期時(shí)病毒載量低于qRT-PCR檢測(cè)閾值等均會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果,因而在后續(xù)的檢測(cè)工作中需規(guī)范樣本采集,多部位聯(lián)合采集,以減少假陰性結(jié)果的發(fā)生[9]。

2.3 微流控芯片技術(shù)

微流體技術(shù)將樣品制備、反應(yīng)、分離和檢測(cè)等基本操作單元集成到微米級(jí)芯片中,自動(dòng)完成整個(gè)分析過(guò)程。即時(shí)檢驗(yàn)(POCT)也稱為快速現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)或床頭檢驗(yàn),不同于傳統(tǒng)的檢驗(yàn)?zāi)J? POCT是一種在采樣現(xiàn)場(chǎng)立即進(jìn)行分析的新方法,不需要在實(shí)驗(yàn)室測(cè)試中對(duì)標(biāo)本進(jìn)行復(fù)雜的處理程序,可以快速獲得檢驗(yàn)結(jié)果。微流體技術(shù)具有低成本、高通量、快速、易于微型化等優(yōu)勢(shì),被廣泛應(yīng)用于POCT領(lǐng)域。DVBOX(DetectVirus BOX)也稱為檢毒BOX, 是由中國(guó)自主研發(fā)的一款全封閉、超高靈敏度的一體式微流控SARS-CoV-2核酸檢測(cè)POCT設(shè)備[10], 具有低實(shí)驗(yàn)操作環(huán)境要求、高靈敏度、低假陰性率、低檢測(cè)成本、無(wú)需運(yùn)輸樣本、檢測(cè)時(shí)間短、不需要大量經(jīng)專業(yè)防護(hù)和實(shí)驗(yàn)操作培訓(xùn)的技術(shù)人員等優(yōu)勢(shì)。

2.4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

RT-PCR因其高靈敏度、高準(zhǔn)確度等優(yōu)勢(shì)而被廣泛用于SARS-CoV-2的檢測(cè),但仍然存在一定的局限,例如對(duì)溫控精度高的熱循環(huán)儀的依賴而導(dǎo)致檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng),因而無(wú)法實(shí)時(shí)快速地檢測(cè)SARS-CoV-2。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)可在等溫條件下快速、高效地?cái)U(kuò)增,非常適合SARS-CoV-2核酸的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。LAMP是一種新型的核酸擴(kuò)增方法,在引物和鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下, 60~65 ℃恒溫?cái)U(kuò)增, 15~60 min即可實(shí)現(xiàn)109~1010倍的核酸擴(kuò)增,一般針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4~6種特異引物以提高特異性,具有操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、產(chǎn)物易檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn),可廣泛用于感染性疾病的檢測(cè)。

HONG T C T等[11]基于LAMP技術(shù)開(kāi)發(fā)了一種單步單管加速實(shí)時(shí)定量RT-LAMP測(cè)定法,對(duì)臨床49份標(biāo)本檢測(cè), RT-LAMP分析的檢測(cè)靈敏度是RT-PCR的100倍,檢測(cè)極限為0.01 PFU。ANAHTAR M N等[12]利用RT-LAMP對(duì)135例鼻咽標(biāo)本進(jìn)行了COVID-19感染評(píng)估,通過(guò)優(yōu)化樣本, RT-LAMP可利用有限的設(shè)備實(shí)現(xiàn)快速且準(zhǔn)確的SARS-CoV-2檢測(cè),有成為理想檢測(cè)方法的潛力,尤其是在資源有限的環(huán)境下。LAMB L E等[13]確定了RT-LAMP的最佳條件: 63 ℃溫育30 min。YU L等[14]基于LAMP技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化,開(kāi)發(fā)了iLACO快速檢測(cè)技術(shù),該技術(shù)以O(shè)RF1ab基因?yàn)闄z測(cè)靶區(qū)進(jìn)行LAMP等溫?cái)U(kuò)增,靈敏度與基于Taq酶的RT-PCR相當(dāng),同時(shí)可以利用測(cè)序比對(duì)區(qū)分SARS-CoV-2與其他病毒,確保了檢測(cè)的特異性。

RT-LAMP具有操作簡(jiǎn)單、快速高效、檢測(cè)靈敏、特異性高等優(yōu)勢(shì),可用于快速篩查,但極易污染而產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果,故要特別注意嚴(yán)謹(jǐn)操作。此外, RT-LAMP目前使用的引物組的靈敏度不足以充分檢測(cè)出低病毒載量人群的感染[10]。RT-LAMP技術(shù)若在產(chǎn)物的回收鑒定、克隆、單鏈分離等方面加以完善和改進(jìn),對(duì)檢測(cè)性能的提高有著積極的意義[15]。

3 血清學(xué)檢測(cè)

目前, RT-PCR檢測(cè)陽(yáng)性是公認(rèn)的診斷臨床疑似病例的確診標(biāo)準(zhǔn)。然而, RT-PCR檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性很大程度上依賴于病毒載量,低病毒載量易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。血清學(xué)檢測(cè)操作便捷、耗時(shí)少,可以作為核酸檢測(cè)的有益補(bǔ)充,輔助臨床診斷[16]。同時(shí),《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》[17]明確將SARS-CoV-2特異性抗體檢測(cè)納入確診病例的診斷標(biāo)準(zhǔn)以及疑似病例的排除標(biāo)準(zhǔn)。感染SARS-CoV-2后,免疫球蛋白M(IgM)最早可在感染后的第3天被檢測(cè)到,其峰值出現(xiàn)在感染后2~3周; 免疫球蛋白G(IgG)最早可在4 d內(nèi)出現(xiàn),并在17 d內(nèi)達(dá)到峰值[18]。血清學(xué)檢測(cè)方法主要包括膠體金法、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)和化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA), 具有靈敏度高、簡(jiǎn)便、范圍廣、易推廣等優(yōu)點(diǎn)。

3.1 膠體金法

膠體金法是一種以膠體金作為示蹤標(biāo)志物檢驗(yàn)抗原抗體的免疫標(biāo)記檢測(cè)技術(shù),無(wú)需專業(yè)、昂貴的設(shè)備和試劑,具有操作簡(jiǎn)單、結(jié)果迅速等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于病原體檢測(cè)領(lǐng)域。

鄧杰倫等[19]對(duì)76例患者血清IgM和總抗體進(jìn)行了膠體金檢測(cè),特異性均>90%, 陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值均>70%, 可以滿足臨床要求,輔助臨床診斷。LI Z T等[20]基于免疫膠體金技術(shù)的原理,創(chuàng)新地研發(fā)了IgM-IgG聯(lián)合抗體快速檢測(cè)方法,可以在15 min內(nèi)確認(rèn)近期是否有SARS-CoV-2感染。彭孝斌等[21]分別采用ELISA與膠體金法對(duì)26例確診病例和54例發(fā)熱患者進(jìn)行IgM及IgG檢測(cè),結(jié)果表明,在現(xiàn)有的試劑條件下,膠體金法較ELISA操作更為簡(jiǎn)便、快捷,更適合基層實(shí)驗(yàn)室。

膠體金法多以靜脈血和指尖血為檢測(cè)樣本,易于獲取,短時(shí)間內(nèi)即可得到檢測(cè)結(jié)果,因而適用于大規(guī)模人群篩查。但由于較低的靈敏度和較長(zhǎng)的檢測(cè)窗口期,膠體金法尚不能作為SARS-CoV-2確診和排除的唯一依據(jù)[20]。

3.2 CLIA

CLIA是一種具有化學(xué)發(fā)光測(cè)定技術(shù)的高靈敏度與免疫反應(yīng)的高特異度新型檢測(cè)分析技術(shù),其原理是以磁微粒作為固相載體,通過(guò)對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的檢測(cè)來(lái)確定待測(cè)物濃度。CLIA的主要優(yōu)勢(shì)有: ① 樣本易于獲得; ② 具有快速高效,靈敏度高,可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本全自動(dòng)、高通量檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)。但是, CLIA也存在一系列問(wèn)題,如抗體檢測(cè)窗口期長(zhǎng)、假陽(yáng)性率高等。

重慶醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合博奧賽斯生物科技有限公司研發(fā)的SARS-CoV-2化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒是全球首批獲批的磁微粒化學(xué)發(fā)光SARS-CoV-2 IgG/IgM檢測(cè)試劑盒,已累計(jì)完成13 532例樣本測(cè)試,其中1 362例為COVID-19確診病例,結(jié)果顯示IgM靈敏性為93.7%, 特異性為99.4%, IgG靈敏性為89.6%, 特異性為99.2%。廖凡路等[22]發(fā)現(xiàn)部分確診患者SARS-CoV-2核酸檢測(cè)始終為陰性,而SARS-CoV-2抗體的檢測(cè),尤其是總抗體對(duì)其敏感性很高(總抗體檢測(cè)陽(yáng)性率為100%), 表明增加SARS-CoV-2抗體的檢測(cè)對(duì)于臨床確診患者的診斷有十分重要的意義。數(shù)據(jù)分析[23]表明,化學(xué)發(fā)光抗體檢測(cè)試劑仍不能取代RT-PCR確診檢測(cè),且需要專業(yè)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)設(shè)備,也不適用于人群篩查。

3.3 ELISA

ELISA是目前最常用的免疫分析方法,其原理是利用抗原、抗體間專一性鍵結(jié)合的特性進(jìn)行檢測(cè)。由于結(jié)合于聚苯乙烯載體上的SARS-CoV-2抗原仍具有免疫活性,配合酶促呈色反應(yīng),即可顯示人血清中是否存在SARS-CoV-2抗體,并可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定量分析。

胡燕等[24]利用ELISA分別對(duì)116例COVID-19患者和346例非COVID-19者的血清SARS-CoV-2抗體進(jìn)行檢測(cè), ELISA檢測(cè)血清SARS-CoV-2 IgG抗體的敏感性為63.79%, 特異性為96.53%, 準(zhǔn)確性為88.31%; ELISA檢測(cè)血清SARS-CoV-2 IgM抗體的敏感性為58.62%, 特異性為97.40%, 準(zhǔn)確性為87.66%, 可以滿足實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)需要。

ELISA的靈敏度高、特異度高、檢測(cè)成本低,但是操作較為繁瑣,在抗體檢測(cè)的窗口期以及感染初期難以獲得準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果,使得ELISA只能作為SARS-CoV-2核酸檢測(cè)陰性疑似病例的補(bǔ)充檢測(cè)手段。

4 總結(jié)與展望

目前,核酸檢測(cè)仍是SARS-CoV-2主流的早期檢測(cè)手段,對(duì)SARS-CoV-2的傳播起著重要的預(yù)防作用。但是,目前的核酸檢測(cè)方法也存在一些局限性,包括檢測(cè)靈敏度低、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境和人員要求高、在臨床應(yīng)用中容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果等。相比較而言,血清學(xué)檢測(cè)操作便捷、耗時(shí)少,但機(jī)體對(duì)SARS-CoV-2的免疫反應(yīng)導(dǎo)致血清學(xué)檢測(cè)無(wú)法對(duì)COVID-19患者進(jìn)行早期即時(shí)篩查,因此建議將核酸檢測(cè)與血清學(xué)檢測(cè)結(jié)合使用以提高COVID-19的檢測(cè)精度。此外,影像學(xué)檢查也是COVID-19的重要檢測(cè)手段,聯(lián)合應(yīng)用可提供更加可靠的診斷結(jié)果[25]。

目前,疫情防控重點(diǎn)在于對(duì)無(wú)癥狀感染者進(jìn)行有效監(jiān)測(cè),技術(shù)創(chuàng)新就顯得極為重要,提高靈敏度和準(zhǔn)確度、高通量檢測(cè)、自動(dòng)化、便攜等是目前新技術(shù)開(kāi)發(fā)的主要方向。隨著上述新技術(shù)的發(fā)展,對(duì)COVID-19患者的檢測(cè)和診斷能力將進(jìn)一步提高。

猜你喜歡
膠體金特異性核酸
CT聯(lián)合CA199、CA50檢測(cè)用于胰腺癌診斷的敏感性與特異性探討
膠體金標(biāo)記兔抗-維氏氣單胞菌Lam B 多克隆抗體的制備與優(yōu)化
全員核酸
保靖苗族龍紋飾的藝術(shù)特異性與文化基因
核酸檢測(cè)點(diǎn)上,有最可愛(ài)的平江人
老年慢性非特異性腰痛綜合康復(fù)治療效果分析
第一次做核酸檢測(cè)
免疫膠體金技術(shù)在臨床檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展
血清鐵蛋白、IL-6和前列腺特異性抗原聯(lián)合檢測(cè)在前列腺癌診斷中的應(yīng)用
膠體金免疫層析技術(shù)在獸醫(yī)臨床中的運(yùn)用研究
织金县| 肇东市| 新宁县| 武城县| 宜黄县| 巴林右旗| 宁晋县| 古蔺县| 萝北县| 哈巴河县| 平塘县| 安国市| 兴宁市| 平泉县| 郎溪县| 盐边县| 石棉县| 宜州市| 神农架林区| 革吉县| 香港| 吴旗县| 山东| 阜阳市| 长丰县| 太湖县| 高碑店市| 昌都县| 海门市| 藁城市| 基隆市| 琼海市| 肃宁县| 望城县| 疏勒县| 固阳县| 新化县| 牟定县| 托克逊县| 凉山| 定西市|