何珍珍，袁小亮

（1. 贛南醫(yī)學(xué)院2019級(jí)碩士研究生；2. 贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江西 贛州 341000）

相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，目前國(guó)內(nèi)肺癌的死亡增長(zhǎng)幅度及危害程度居惡性腫瘤之首［1］。由于在疾病早期，肺癌患者多無(wú)癥狀或癥狀少且無(wú)特異性，絕大部分未能引起足夠重視，導(dǎo)致約2/3 的患者在確診時(shí)已無(wú)早期手術(shù)治療機(jī)會(huì)，因此肺癌的死亡率始終居高不下［2］，而五年生存率的提高有賴于肺癌的早期診斷治療［3］。由此可見(jiàn)，肺癌高死亡率和它的早期診斷治療呈負(fù)相關(guān)，因此早發(fā)現(xiàn)、早診治可顯著降低肺癌患者死亡率［4］。有研究表明，對(duì)于降低肺癌患者死亡率，傳統(tǒng)的肺癌診斷方法作用有限［5］。

目前臨床主要通過(guò)影像學(xué)檢查、細(xì)胞學(xué)檢查、組織學(xué)檢查及腫瘤標(biāo)志物來(lái)診斷肺癌。常規(guī)影像X線胸片對(duì)于直徑＜5～6 mm的病變難以識(shí)別，且空間分辨率差；低劑量CT存在輻射風(fēng)險(xiǎn)、容易漏診、假陽(yáng)性率高和醫(yī)療費(fèi)用偏高等問(wèn)題；PET-CT檢查對(duì)于直徑＜8 mm 的肺癌結(jié)節(jié)其陽(yáng)性率不高［6］，且具有該設(shè)備的醫(yī)療單位較少，加之費(fèi)用昂貴，患者依從性不高。細(xì)胞學(xué)檢查中痰液及胸水標(biāo)本檢出率低，易受人為因素影響。各種組織學(xué)檢查對(duì)于直徑小的病灶檢出率低，且各種活檢和手術(shù)都是有創(chuàng)操作，患者依從性低。腫瘤標(biāo)志物或可彌補(bǔ)上述不足，但目前尚無(wú)明確的能指導(dǎo)治療決策的肺癌生物標(biāo)志物。常規(guī)腫瘤標(biāo)志物晚期肺癌患者的診斷效能更高［7］。已知的新型標(biāo)志物尚未大規(guī)模運(yùn)用于臨床，還需進(jìn)一步更具說(shuō)服力的科學(xué)驗(yàn)證。上述用于肺癌診斷的標(biāo)志物，其敏感性及特異性均不高，嘗試用各種新方法探索肺癌相關(guān)的特異性分子標(biāo)志物已成為研究熱點(diǎn)。質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)作為肺癌診斷的新方法，發(fā)展迅速，其具有高靈敏度、所需樣本量少、分析快速、可同時(shí)進(jìn)行分離和鑒定等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于肺癌不同生物樣本的研究中，以期發(fā)現(xiàn)一些新的能預(yù)測(cè)肺癌發(fā)生發(fā)展的特異性分子標(biāo)志物，在將來(lái)成為肺癌診斷方法的補(bǔ)充。

1 質(zhì)譜技術(shù)概述

質(zhì)譜分析法就是通過(guò)對(duì)被測(cè)樣品離子質(zhì)荷比的測(cè)定獲得物質(zhì)分子量的一種分析方法。質(zhì)譜儀由進(jìn)樣系統(tǒng)、離子源、質(zhì)量分析器、檢測(cè)器及數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)組成。樣品進(jìn)樣方式包括直接進(jìn)樣和色譜進(jìn)樣，單組分、高沸點(diǎn)的液體樣品可采用直接進(jìn)樣。色譜起化合物分離作用，分為液相色譜（LC）和氣相色譜（GC），多組分樣品可采用色譜進(jìn)樣。離子源將樣品離子化，傳統(tǒng)電離方式有電子電離（EI）、化學(xué)電離（CI）、場(chǎng)電離（FI）、場(chǎng)解吸（FD）、快原子轟擊（FAB）、基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）、電噴霧電離（ESI）、大氣壓化學(xué)電離（APCI）。目前研發(fā)的直接離子化技術(shù)，如表面解吸化學(xué)電離（DAPCI）、電噴霧萃取電離（EESI）、大氣壓解吸光電離（DAPPI）等改進(jìn)了傳統(tǒng)電離方式需復(fù)雜的樣本預(yù)處理方面的不足。質(zhì)量分析器可分離不同質(zhì)荷比的離子，有扇形磁場(chǎng)質(zhì)量分析器（Magnetic-Sector）、四級(jí)桿質(zhì)量分析器（Quadrupole）、離子阱質(zhì)量分析器（IT）、飛行時(shí)間質(zhì)量分析器（TOF）和傅里葉變換離子回旋共振分析器（FTICR）。不同類型的離子源和質(zhì)量分析器相互配合，構(gòu)成目前常見(jiàn)的質(zhì)譜儀。如APCI常與四級(jí)桿及離子阱質(zhì)量分析器組合；MALDI 通常與TOF 相結(jié)合，組成MALDI-TOF-MS。

2 質(zhì)譜技術(shù)在肺癌分子標(biāo)志物中的應(yīng)用

肺癌發(fā)生是多因素多步驟的發(fā)展過(guò)程，在發(fā)生分子水平及亞細(xì)胞層次的改變后才發(fā)生細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變［8］。肺癌患者的這些改變，可呈現(xiàn)在不同生物樣本中成分的變化。由此為質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)上述生物樣本尋找新的肺癌分子標(biāo)志物提供可能。以下對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)在肺癌代謝標(biāo)志物、蛋白標(biāo)志物、核酸標(biāo)志物及每類標(biāo)志物的適用樣本的研究進(jìn)行綜述。

2.1 代謝標(biāo)志物生物體代謝物質(zhì)種類繁多，為保證分析物的精確定量，常通過(guò)色譜、電泳兩種技術(shù)降低分析前樣品的復(fù)雜性。因此，代謝標(biāo)志物的分析通常采用液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）、氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）、毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜（CE-MS）等技術(shù)。基本工作原理：樣品通過(guò)色譜柱或毛細(xì)管遷移進(jìn)行分離，然后被引入質(zhì)譜儀，經(jīng)離子源電離為離子，在質(zhì)量分析器中根據(jù)質(zhì)荷比的不同被分離后進(jìn)行測(cè)量，最終通過(guò)質(zhì)譜峰顯示質(zhì)譜圖。其中，LC-MS無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行衍生化預(yù)處理，適宜分析大分子、難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定的化合物；GC-MS 對(duì)樣品預(yù)處理?xiàng)l件要求較高，因此，其預(yù)處理過(guò)程相對(duì)復(fù)雜，且其檢測(cè)結(jié)果受多方面因素影響，如富集方法的選擇、色譜柱種類的選擇、色譜升溫的條件等［9］；CE-MS 可快速、高分辨率地分析核酸、氨基酸、羧酸和糖磷酸酯等帶電的代謝物質(zhì)。而不同的離子源類型所進(jìn)行的電離方式，可區(qū)分不同類型和不同數(shù)量的代謝物。目前質(zhì)譜檢測(cè)用于肺癌代謝標(biāo)志物的研究，其生物樣品包括以下幾種。

2.1.1 血液標(biāo)本MAEDA J 等［10］研究探討了血漿氨基酸譜作為篩查非小細(xì)胞肺癌患者的新標(biāo)志物的可能性。通過(guò)對(duì)141 例非小細(xì)胞肺癌患者和423例健康對(duì)照者的靜脈血中氨基酸濃度進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定，同時(shí)對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并構(gòu)建診斷模型，發(fā)現(xiàn)無(wú)論疾病分期或組織類型，均可較好區(qū)分非小細(xì)胞肺癌患者和對(duì)照組。說(shuō)明血漿氨基酸譜可作為非小細(xì)胞肺癌的一種潛在篩查工具。陳瑩蓉等［11］運(yùn)用高效液相-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)30 例肺癌患者與30 例健康人血清進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，肺癌患者和正常對(duì)照人群的代謝譜有明顯差異，其中3-羥基-3-甲基戊二酸、鞘氨醇、氯磷膽堿、甘油磷酸-N-花生四烯乙醇胺、磷脂酰膽堿和γ-亞油酸等6 種物質(zhì)差異最為明顯，說(shuō)明上述代謝物有可能成為區(qū)分肺癌患者和正常對(duì)照人群的潛在代謝標(biāo)志物。GUO Y M 等［12］收集58 例肺癌患者和495 例健康人的血清，利用傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜分析技術(shù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有多達(dá)141種血液代謝物在肺癌患者和健康人間存在顯著差別，脂肪酸衍生物、鞘磷脂、溶血磷脂酰膽堿等組成的幾種脂類可能與肺癌的進(jìn)展相關(guān)，使用其中幾種作為生物標(biāo)志物進(jìn)行分類，可較好地將兩組進(jìn)行區(qū)分，敏感性和特異性分別為100%和91%。說(shuō)明利用血液標(biāo)本進(jìn)行質(zhì)譜分析有望開(kāi)發(fā)輔助篩查工具，用于肺癌患者的篩查。

2.1.2 尿液標(biāo)本尿液代謝組學(xué)近年已成為發(fā)現(xiàn)非侵入性生物標(biāo)志物的一個(gè)重要領(lǐng)域，這些生物標(biāo)志物可檢測(cè)特定疾病或治療干預(yù)的微妙代謝差異。與其他生物液體相比，尿液的特點(diǎn)是易于收集，代謝物豐富，能反映體內(nèi)所有生化途徑的失衡。迄今為止，在所有的分析技術(shù)中，質(zhì)譜為分析尿液中的大部分代謝物成分提供了最好的靈敏度、選擇性和識(shí)別能力。結(jié)合質(zhì)譜法的定性和定量能力，以及相關(guān)技術(shù)（如超高效液相色譜和親水作用液相色譜）的不斷改進(jìn)，液相色譜-質(zhì)譜法無(wú)疑是尿液代謝組學(xué)中應(yīng)用最廣泛、信息量最大的分析工具［13］。

親水相互作用色譜/液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)是一種很有前景的代謝組學(xué)研究工具，可揭示高度復(fù)雜樣品的更多信息，YANG Q 等［14］采用自行研制的親水相互作用色譜/液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)對(duì)肺腺癌、肺鱗癌患者的尿代謝組學(xué)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，馬尿酸、甜菜堿、肉毒堿等物質(zhì)在肺癌患者尿液中明顯升高。AN Z L 等［15］建立了電噴霧電離、大氣壓化學(xué)電離、大氣壓光電離和快速分辨液相色譜-質(zhì)譜相結(jié)合的綜合電離方法，并在液相-色譜質(zhì)譜分析中獲得全面的代謝物譜。利用該項(xiàng)技術(shù)，研究者發(fā)現(xiàn)了肺癌患者尿液中潛在的包括氨基酸、核苷和吲哚在內(nèi)的11 種生物標(biāo)志物。MATHé E A 等［16］使用無(wú)偏性液相色譜-質(zhì)譜法對(duì)469 例肺癌患者和536 例對(duì)照人群中收集的尿液進(jìn)行分析測(cè)定，發(fā)現(xiàn)肌酸核糖苷、N-乙酰神經(jīng)氨酸兩種物質(zhì)可能是腫瘤組織中較高的泌尿臨床代謝組學(xué)標(biāo)志物，與肺癌早期診斷和預(yù)后差有關(guān)。ZHAO C C 等［17］采用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)肺癌組與對(duì)照組尿液，研究結(jié)果提示，肺癌的發(fā)生發(fā)展與d-谷氨酰胺及d-谷氨酸代謝紊亂、氨基酸失衡密切相關(guān)。

2.1.3 呼出氣體標(biāo)本直接離子化質(zhì)譜技術(shù)可直接對(duì)樣品進(jìn)行分析，檢測(cè)結(jié)果受可變因素影響較?。?］。而高壓光子電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)具有電離效率高、分子離子產(chǎn)率高、碎裂程度低等特點(diǎn)，是目前最有效、最受歡迎的在線監(jiān)測(cè)痕量揮發(fā)性有機(jī)化合物的軟電離技術(shù)之一［18-19］。

劉曉妮［20］通過(guò)電噴霧萃取電離聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)了內(nèi)源性肺癌特征性揮發(fā)性有機(jī)化合物，分別為丁二烯、乳清酸、四氫生物蝶呤、N-苯乙酰谷氨酰胺等，并對(duì)這4種進(jìn)行了深入研究，闡明了其產(chǎn)生機(jī)制。郭冰清［21］則利用質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)質(zhì)譜檢測(cè)呼出氣體，共檢出8種內(nèi)源性揮發(fā)性有機(jī)化合物，并在其中找到甲醇、異戊二烯、乙醛等3種肺癌患者呼氣中特征性揮發(fā)性有機(jī)化合物。MENG S S 等［22］采集139例肺癌患者和289例健康成人的呼氣樣本，利用高壓光子電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，并建立肺癌檢測(cè)模型，該模型能區(qū)分肺癌患者和健康人，具有高度的敏感性和特異性。這項(xiàng)診斷性研究的結(jié)果表明，呼出氣體測(cè)試可能是肺癌檢測(cè)的可靠方法，而高壓光子電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)可能提供快速而準(zhǔn)確的呼氣檢測(cè)方法。

2.1.4 胸腔積液標(biāo)本根據(jù)檢測(cè)目標(biāo)物質(zhì)的不同，胸水樣本可同時(shí)采用氣相-色譜質(zhì)譜聯(lián)用及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用兩種方法。劉會(huì)君［23］運(yùn)用頂空固相微萃取-氣相色譜/質(zhì)譜技術(shù)分析肺癌患者、非肺癌（肺部良性疾?。┗颊咝厍环e液樣本的揮發(fā)性代謝物。研究發(fā)現(xiàn)，兩組胸腔積液樣本中均存在酮類、苯系衍生物這兩種主要代謝物，而酮類、醇類和酚類在兩組患者中有明顯區(qū)別，可能為惡性胸水中特異性揮發(fā)性代謝物，最終篩選得到環(huán)己酮、2-乙基-1-己醇兩種差異性代謝物。冶學(xué)燕等［24］應(yīng)用非靶向超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，研究探討了惡性胸腔積液與結(jié)核性胸腔積液中的代謝組學(xué)特征。發(fā)現(xiàn)結(jié)核性胸腔積液中1-油酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿、替普瑞酮、亞油酸甲酯和1-十七烷酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿顯著升高，提示上述物質(zhì)有可能是潛在的用于鑒別兩種胸腔積液的標(biāo)志物。

2.1.5 支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本目前質(zhì)譜技術(shù)用于支氣管肺泡灌洗液代謝標(biāo)志物研究相對(duì)較少。CALLEJóN-LEBLIC B 等［4］收集來(lái)自24 例肺癌患者和31例對(duì)照患者的支氣管肺泡灌洗液樣本，基于直接注入三重四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)合技術(shù)進(jìn)行代謝組學(xué)分析，在肺癌患者的支氣管肺泡灌洗液中共發(fā)現(xiàn)42種改變的代謝物，其中谷氨酸和谷氨酰胺代謝途徑受主要影響。研究表明，甘油和磷酸對(duì)肺癌診斷和預(yù)后具有敏感性和特異性生物標(biāo)志物的潛力。

2.1.6 肺組織標(biāo)本在進(jìn)行肺腫瘤切除手術(shù)時(shí)，常通過(guò)冰凍切片快速明確組織的良惡性，但這種方法準(zhǔn)確度不高。因此，若能尋找到更快速、更準(zhǔn)確的檢驗(yàn)方法用于確定肺癌組織的侵襲邊界，將更有助于確定手術(shù)切除范圍，從而避免因此造成的腫瘤復(fù)發(fā)或二次手術(shù)的發(fā)生。歐陽(yáng)永中等［25］以未經(jīng)處理的肺鱗癌患者的腫瘤切片和正常組織切片作為樣本，利用結(jié)合隨機(jī)森林算法構(gòu)建的DAPCI-MS 進(jìn)行檢測(cè)，可實(shí)現(xiàn)兩組切片的準(zhǔn)確鑒別，該研究還提出磷脂酰膽堿、鞘磷脂類化合物可作為區(qū)分兩組切片的潛在特征性標(biāo)志物。

2.2 蛋白標(biāo)志物生物樣本蛋白標(biāo)志物的質(zhì)譜檢測(cè)，通常需通過(guò)雙向凝膠電泳（2-DE）或液相色譜進(jìn)行預(yù)分離以降低分析物的復(fù)雜性，提取出所需蛋白。相關(guān)研究也將蛋白芯片、磁珠分離等技術(shù)用于血液、尿液、胸水等樣本中蛋白的預(yù)分離。2-DE 由于分辨率和準(zhǔn)確率低、蛋白質(zhì)重疊等缺點(diǎn)，逐漸被質(zhì)譜技術(shù)所取代。經(jīng)過(guò)預(yù)分離的樣品經(jīng)離子源電離成離子，或是不經(jīng)過(guò)預(yù)分離直接經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸電離離子化。離子在磁場(chǎng)中發(fā)生偏轉(zhuǎn)，在質(zhì)量分析器中根據(jù)質(zhì)荷比的不同進(jìn)行分離后，得到質(zhì)譜圖。飛行時(shí)間質(zhì)量分析器適用于生物大分子。電離技術(shù)中MALDI、ESI、SELDI 均適合分析大分子化合物。因此，MALDI-TOF-MS、SELDI-TOF-MS 等質(zhì)譜技術(shù)，適宜分析蛋白、肽、核酸等物質(zhì)。用于肺癌蛋白標(biāo)志物質(zhì)譜檢測(cè)的生物樣本來(lái)源廣泛。

2.2.1 血液標(biāo)本HUANG W 等［26］收集了37 例非小細(xì)胞肺癌患者放化療前后的血清，并根據(jù)放化療敏感性將患者分為兩組，利用LC-MS對(duì)兩組間差異表達(dá)的蛋白進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Alpha-1抗胰蛋白酶（a1-AT）水平在兩組間存在差異（P＜0.05），說(shuō)明質(zhì)譜蛋白組學(xué)方法或可找到判定放化療預(yù)后的肺癌標(biāo)志物。楊拴盈等［27］則采用液體芯片-飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)肺癌患者、良性疾病患者及健康人的血清樣本檢測(cè)，同時(shí)應(yīng)用相關(guān)分析工具分析數(shù)據(jù)并建立判別模型，該模型對(duì)肺癌及對(duì)照組的識(shí)別率分別為82.22%和80.00%，對(duì)早期肺癌的識(shí)別率為76.92%，可用于鑒別肺癌與非肺癌患者，待大規(guī)模驗(yàn)證后可進(jìn)一步對(duì)潛在的標(biāo)志蛋白進(jìn)行鑒定。

2.2.2 尿液標(biāo)本LV P P 等［28］以72 例小細(xì)胞肺癌患者和72例健康人血清和尿液樣本為研究對(duì)象，用銅離子螯合納米磁珠提取血清和尿肽，并用MALDI-TOF-MS 進(jìn)行分析，該研究強(qiáng)調(diào)了小細(xì)胞肺癌患者與健康人之間血清和尿肽的差異。利用MALDI-TOF-MS 可建立靈敏度和特異性均較高的血、尿肽診斷分類模型。但該研究對(duì)小細(xì)胞肺癌相關(guān)多肽只進(jìn)行了小規(guī)模驗(yàn)證，在未來(lái)還需進(jìn)行大規(guī)模臨床操作驗(yàn)證，有望為開(kāi)發(fā)快速、無(wú)創(chuàng)、小樣本量的基于血清和尿液的診斷方法奠定基礎(chǔ)。ZHOU M R等［29］利用LC-MS 分析了不同分期的肺腺癌患者和健康人的血清和尿液，分別在血清和尿液中鑒定出441、1 161 種蛋白質(zhì)。其中血清中延伸因子1-α2、蛋白酶體亞基α 型和生精相關(guān)蛋白水平，肺癌患者明顯高于健康對(duì)照組；跨膜蛋白143、鈣黏附素5、纖維連接蛋白1和集合素-11 水平，轉(zhuǎn)移性肺癌患者顯著低于非轉(zhuǎn)移性肺癌患者。前列腺特異性抗原、前列腺酸性磷酸酶在Ⅲ、Ⅳ期肺癌患者尿液中顯著降低，中性粒細(xì)胞防御素1明顯升高。上述蛋白可能是肺腺癌早期診斷、轉(zhuǎn)移的潛在特異性生物標(biāo)志物。此外，該研究還指出，血清和尿液中這些標(biāo)志物的相對(duì)含量可用來(lái)判斷肺腺癌的進(jìn)展，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確分期和診斷。

2.2.3 胸腔積液標(biāo)本許晶［30］采集65 例晚期肺腺癌患者及32例結(jié)核性胸膜炎患者的胸腔積液，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法（磁珠聯(lián)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜）進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩組患者胸腔積液中存在明顯的多肽差異，這種差異多肽可能為肺癌患者胸腔積液中潛在的特異性分子標(biāo)志物。該研究還通過(guò)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)建立了肺癌惡性胸腔積液診斷模型，并與傳統(tǒng)胸水診斷方法進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)其較胸水細(xì)胞涂片檢出率高；與胸水傳統(tǒng)標(biāo)志物癌胚抗原檢測(cè)相比兩者敏感性與特異性相當(dāng)，但前者的檢測(cè)較后者更加簡(jiǎn)便、快速。張文雄等［31］則采用SELDI-TOF-MS 技術(shù)分析良、惡性胸腔積液，結(jié)果顯示，兩組胸腔積液間存在多個(gè)差異蛋白波峰，選用其中兩種差異蛋白為標(biāo)志物建立了診斷模型，有望用于鑒別良惡性胸腔積液。

2.2.4 痰液標(biāo)本痰液檢測(cè)敏感度及特異度低，且易受人為因素影響，質(zhì)譜技術(shù)可彌補(bǔ)上述不足。中性解吸電噴霧萃取電離質(zhì)譜（ND-EESI-MS）是痰液質(zhì)譜檢測(cè)的新方法，可檢測(cè)未經(jīng)預(yù)處理的痰液標(biāo)本。ZHANG J Y 等［32］采用ND-EESI-MS 檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌、肺良性疾病患者及健康人的痰液發(fā)現(xiàn)，可明顯區(qū)分肺癌組與對(duì)照組的質(zhì)譜峰。魏益平等［33］利用ND-EESI-MS 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌患者的痰液樣品的指紋譜圖明顯區(qū)別于非肺癌患者痰液。說(shuō)明ND-EESI-MS 能較好區(qū)分非小細(xì)胞肺癌和非肺癌患者，對(duì)于非小細(xì)胞肺癌的診斷可做到速度快且無(wú)創(chuàng)傷。但該研究所納入的樣本量過(guò)小，且未進(jìn)一步研究差異質(zhì)譜峰的具體物質(zhì)。

2.2.5 唾液標(biāo)本XIAO H等［34］將肺癌患者及健康人的唾液作為研究樣本，利用雙向差示凝膠電泳和質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，肺癌患者唾液中代謝物改變，說(shuō)明肺癌發(fā)生時(shí)，唾液中存在蛋白組生物標(biāo)志物。該研究證實(shí)，唾液質(zhì)譜檢測(cè)區(qū)分肺癌與非肺癌患者的可行性，為肺癌患者唾液檢測(cè)提供了一種新方法。

2.2.6 支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本支氣管肺泡灌洗液具有創(chuàng)傷較小、干擾蛋白少、組分特異性高等優(yōu)點(diǎn)，能更好用于肺癌臨床診斷研究。PASTOR M D等［35］采用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)慢性阻塞性肺疾病及肺癌患者肺泡灌洗液中的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，然后利用MALDI-TOF-MS 進(jìn)行檢測(cè)，確定了能夠區(qū)分這兩種病理實(shí)體的不同蛋白質(zhì)組圖譜。CARVALHO A S 等［36］對(duì)90 例可疑肺癌患者進(jìn)行了為期兩年的前瞻性觀察，利用LC-MS 對(duì)這些患者的支氣管肺泡灌洗液進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，最終確診為肺癌患者的肺泡灌洗液與非肺癌患者相比，共存在130 個(gè)有顯著差異的表達(dá)蛋白，與相關(guān)研究進(jìn)行比較，可作為肺癌診斷的有利實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2.2.7 肺組織標(biāo)本肺組織是含有腫瘤相關(guān)信息最為豐富的研究材料。因此，研究者們針對(duì)肺組織的蛋白標(biāo)志物進(jìn)行了大量相關(guān)研究。質(zhì)譜檢測(cè)方法具有免標(biāo)記、高靈敏性、高特異性、同組分同時(shí)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)[37]。在LI B R 等［38］的研究中，將無(wú)轉(zhuǎn)移的鱗狀細(xì)胞肺癌的腫瘤組織、腫瘤鄰近的正常支氣管上皮組織細(xì)胞膜中提取的蛋白質(zhì)，經(jīng)2-DE 預(yù)分離后，采用MALDI-TO-MS 對(duì)25 個(gè)差異顯著的蛋白斑點(diǎn)進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)了一些在肺癌鱗癌組織和相鄰正常組織中有差異表達(dá)的候選生物標(biāo)志物蛋白。

2.3 核酸標(biāo)志物MALDI-TOF-MS的出現(xiàn)，使得質(zhì)譜檢測(cè)核酸、蛋白等生物大分子成為可能［39］?；驹恚簶颖驹诨|(zhì)的輔助作用下，核酸分子解析為單電荷離子，飛行時(shí)間質(zhì)量分析器可通過(guò)離子到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間對(duì)其進(jìn)行分離后，得到所需圖譜。目前用于肺癌核酸標(biāo)志物質(zhì)譜檢測(cè)的生物樣本有尿液、血液、肺腫瘤組織等。

2.3.1 尿液標(biāo)本修飾核苷是機(jī)體RNA 轉(zhuǎn)錄后修飾產(chǎn)物，不能被細(xì)胞再利用，經(jīng)血液隨尿液排出體外。由于腫瘤細(xì)胞RNA 周轉(zhuǎn)速度快，因此修飾核苷在很多種惡性腫瘤患者尿液中明顯較健康人高［40］。MCENTIRE J E 等［41］通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定了49例男性肺癌患者、35例其他癌癥患者和48例非腫瘤性疾病住院患者血清中的廣譜修飾核苷。研究發(fā)現(xiàn)，假尿嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、1-甲基腺嘌呤核苷等13 種修飾核苷在肺癌患者血清中的濃度水平明顯區(qū)別于非腫瘤性疾病患者。吳逸明等［42］利用高效液相色譜法檢測(cè)出肺癌患者尿液中假尿嘧啶核苷和肌苷量比值明顯高于健康人。王文昭等［43］采用二維液相色譜在線分析系統(tǒng)檢測(cè)的尿修飾核苷代謝輪廓譜，可快速準(zhǔn)確地區(qū)分肺癌與非肺癌患者。馮璐［40］應(yīng)用高效液相色譜在線系統(tǒng)分別檢測(cè)肺癌患者與健康人尿中Pseu、mlA、mlI、mlG 及m2G五種核苷，同時(shí)應(yīng)用液相色譜法檢測(cè)尿中肌酐，以兩者比值表示核苷濃度，分析其與肺癌發(fā)生、病理分型及腫瘤分期間的關(guān)系。結(jié)果提示，尿中Pseu、mlA、mlI、mlG及m2G可能成為肺癌診斷的分子標(biāo)志物，其中mlA 對(duì)肺癌診斷的準(zhǔn)確性最高，mlI 可能有助于肺癌的病理分型；mlA、mlI 和Pseu 三者聯(lián)合檢測(cè)即可保證對(duì)肺癌患者檢測(cè)的極高敏感度，可能有助于確定肺癌的高危人群。

2.3.2 血液標(biāo)本臨床上現(xiàn)有的用于非小細(xì)胞肺癌病理分型診斷方法有限，研究者們嘗試尋找可用于指導(dǎo)病理分型的特異標(biāo)志物。DNA 甲基化是近年研究熱點(diǎn)，朱劍武等［44］采用MassARRAY 質(zhì)譜甲基化測(cè)序方法，檢測(cè)血清樣本，發(fā)現(xiàn)與健康人相比，IGSF4 基因在非肺癌患者中呈高甲基化狀態(tài)。說(shuō)明該檢測(cè)方法可在無(wú)創(chuàng)的情況下，對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行早期診斷。

2.3.3 肺組織標(biāo)本EGFR 和ALK 基因突變陽(yáng)性的非小細(xì)胞肺癌患者，經(jīng)靶向藥物治療后可獲得較好的療效，研究者們嘗試尋找更多突變基因以輔助肺癌患者的診治。TIAN H X 等［45］建立了一種在MassARRAY 質(zhì)譜平臺(tái)上，通過(guò)AgenaIPLEX 化學(xué)和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析，可以對(duì)中國(guó)人肺癌組織標(biāo)本中的基因突變進(jìn)行高度平行多重檢測(cè)的方法。傳統(tǒng)直接測(cè)序法因靈敏度低導(dǎo)致假陽(yáng)性率高，而該檢測(cè)方法顯示了質(zhì)譜檢測(cè)高靈敏性的特點(diǎn)，可彌補(bǔ)直接測(cè)序法的不足。

3 小結(jié)與展望

質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)目前廣泛應(yīng)用于肺癌分子標(biāo)志物的研究中，研究樣本包括血液、痰液、呼出氣體、尿液、胸水、唾液、支氣管肺泡灌洗液、肺組織等，相關(guān)標(biāo)志物包括代謝標(biāo)志物、蛋白標(biāo)志物、核酸標(biāo)志物等，有望作為肺癌診斷方法的有力補(bǔ)充，在將來(lái)成為肺癌的無(wú)創(chuàng)性篩查或診斷手段。

質(zhì)譜檢測(cè)在肺癌診斷方面的研究雖取得一定成果，但尚有待解決的問(wèn)題存在，比如上述樣本的收集、處理以及檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)化尚未統(tǒng)一，儀器操作人員技術(shù)水平參差不齊，均可能導(dǎo)致得到的標(biāo)志物診斷價(jià)值存在差異。但不可否認(rèn)，一旦質(zhì)譜檢測(cè)廣泛應(yīng)用于臨床，將極大提高診斷效率，節(jié)約時(shí)間及人力、物力成本，期待質(zhì)譜技術(shù)在將來(lái)能檢測(cè)出更多的特異性肺癌分子標(biāo)志物，從而能早期診斷肺癌患者，以指導(dǎo)并改善目前肺癌的臨床診治現(xiàn)狀。