姚經(jīng)經(jīng) 黃晗丹 喻錦鈴 高 穎 張惠利 劉志輝

牙髓病是口腔疾病中發(fā)病率較高的一類疾病，主要包括可復(fù)性牙髓炎、不可復(fù)性牙髓炎和牙髓壞死。牙髓是位于牙髓腔內(nèi)的富含細(xì)胞、神經(jīng)和血管的疏松結(jié)締組織，具有形成、營養(yǎng)、感覺和防御的功能[1]。當(dāng)細(xì)菌感染、物理或化學(xué)刺激導(dǎo)致牙髓組織發(fā)生炎癥反應(yīng)、壞死甚至進(jìn)一步累及根尖區(qū)組織時(shí)，牙髓便喪失了生理功能，并出現(xiàn)劇烈疼痛、牙根發(fā)育停止、根尖區(qū)骨吸收等臨床癥狀，最終造成牙齒的缺失。如何有效地促進(jìn)受損牙髓的恢復(fù)和功能性牙髓的再生成為牙髓治療的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

濃縮生長因子（concentrated growth factor,CGF）是從自體血液中提取的最新一代血小板濃縮物，有良好的生物相容性和生物安全性，多孔的纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)中鑲嵌著豐富的生長因子和細(xì)胞成分，是一種理想的生物支架和生長因子儲存庫，廣泛用于骨、神經(jīng)、血管、肌肉、上皮等組織的修復(fù)和再生[2，3]。近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)CGF在牙髓治療中具有重要作用。本文就CGF的生物學(xué)特性及其在牙髓病不同發(fā)展階段中的作用和機(jī)制進(jìn)行綜述。

一、CGF的生物學(xué)特性

CGF是將血液樣品變速離心后獲得的淡黃色、不透明且富有彈性的纖維蛋白凝膠，在肉眼下類似于富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin，PRF），但其拉伸強(qiáng)度更高；與PRF相比，電鏡下CGF的纖維蛋白有著更規(guī)則、致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，生長因子和細(xì)胞成分也更穩(wěn)定，同時(shí)具有良好的粘附性[4]。致密的纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)不僅為嵌入內(nèi)部的細(xì)胞和生長因子提供保護(hù)，使其釋放接近生理模式，并且還為細(xì)胞遷移和增殖提供三維空間和機(jī)械支持[5]。變速離心增加了血小板碰撞幾率，激活后釋放出大量生長因子，如血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子-2（fibroblast growth factor-basic,FGF-2）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）等[3]，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和膠原合成，抑制炎癥反應(yīng)[6]，是CGF發(fā)揮作用的基礎(chǔ)。CGF中的細(xì)胞成分主要包括血小板、紅細(xì)胞、成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞，可以產(chǎn)生細(xì)胞因子并調(diào)節(jié)其釋放，同時(shí)發(fā)揮抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用[7]。最新的研究發(fā)現(xiàn)CGF中可能還含有內(nèi)皮祖細(xì)胞[8]和多能干細(xì)胞[3]，具有良好的分化能力，參與血管和骨組織的形成。因此，CGF中的纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)、生長因子和細(xì)胞成分三者協(xié)同作用，在組織修復(fù)和再生中有巨大的應(yīng)用潛力。

二、CGF應(yīng)用于活髓保存治療的作用與機(jī)制

當(dāng)牙髓病變局限或可逆時(shí)，通常選用蓋髓術(shù)和牙髓切斷術(shù)，將蓋髓劑置于近髓牙本質(zhì)或露髓口，發(fā)揮抗菌活性的同時(shí)，刺激牙本質(zhì)中的生物活性分子釋放，驅(qū)動第三期牙本質(zhì)形成，以修復(fù)受損牙髓并保存正常牙髓組織[1]。但臨床上常用的蓋髓材料如氫氧化鈣、三氧化礦物凝聚體（mineral trioxide aggregate,MTA），存在著細(xì)胞毒性、牙本質(zhì)橋形成缺陷、材料溶解和牙冠變色等缺點(diǎn)，因此有必要尋找一種更加安全、高效的新型蓋髓材料，最大限度地保留牙髓活力。

1.體外研究

CGF可以釋放多種生長因子，創(chuàng)造一種修復(fù)微環(huán)境，是潛在的蓋髓材料。其中發(fā)揮作用的生長因子主要有TGF-β1、VEGF、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7（bone morphogenetic proteins,BMP-7），調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，刺激牙源性干細(xì)胞增殖及成牙本質(zhì)向分化，誘導(dǎo)牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體的形成[9]。Tian等[10]發(fā)現(xiàn)，CGF在體外可以促進(jìn)牙髓細(xì)胞粘附、增殖和遷移，上調(diào)牙髓細(xì)胞的成牙本質(zhì)向分化標(biāo)志物水平,并通過骨形態(tài)發(fā)生蛋 白-2（bone morphogenetic proteins,BMP-2）/Smad5信號通路促進(jìn)牙髓細(xì)胞的礦化。Dou等[11]將人牙髓細(xì)胞與CGF、氫氧化鈣、MTA、i Root BP plus等傳統(tǒng)蓋髓材料浸提液分別共培養(yǎng)后，顯示氫氧化鈣抑制牙髓細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其壞死和凋亡，有一定的細(xì)胞毒性，而CGF、MTA和i Root BP plus對牙髓細(xì)胞的遷移和礦化具有相似的促進(jìn)作用，且CGF對牙髓細(xì)胞的促增殖作用更為顯著。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與MTA[12]或者i Root BP plus[13]相比，CGF能調(diào)控人牙髓細(xì)胞的細(xì)胞周期，增加S期細(xì)胞百分比，減少細(xì)胞凋亡，顯著增加堿性磷酸酶、牙本質(zhì)涎磷蛋白、骨鈣蛋白等成骨/成牙相關(guān)基因表達(dá)水平，更有利于牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體的形成。

2.體內(nèi)研究

在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，有學(xué)者將CGF、MTA和氫氧化鈣分別置于比格犬機(jī)械露髓的牙髓表面，3個月后各組牙髓斷面均形成了牙本質(zhì)橋，髓腔變窄，根管內(nèi)牙本質(zhì)層增厚，MTA和氫氧化鈣組的牙髓組織中纖維增生、充血，成牙本質(zhì)細(xì)胞消失，但CGF組的牙髓樣組織周圍可見排列規(guī)則的成牙本質(zhì)細(xì)胞和前期牙本質(zhì)的形成[10]，提示CGF有利于牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體的再生。CGF用于活髓保存的臨床研究較少，但有系統(tǒng)評價(jià)[14,15]顯示，PRF等血小板濃縮物與MTA、氫氧化鈣在人體內(nèi)具有相似的蓋髓效果，成功率達(dá)88%～100%，臨床表現(xiàn)和影像學(xué)檢查均未見明顯異常。綜上所述，CGF用于活髓保存的體內(nèi)研究和臨床研究數(shù)量少，且各個實(shí)驗(yàn)的異質(zhì)性高，難以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，需要大量的動物研究明確其在活髓保存治療中的作用效果，為臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

三、CGF應(yīng)用于再生性牙髓治療的作用與機(jī)制

當(dāng)牙髓病變是不可逆或無法修復(fù)時(shí)，臨床上通常選用根管治療，但根管治療后的牙齒由于缺少血管、神經(jīng)的滋養(yǎng)，牙體組織變脆，易折裂，且無感覺功能，而再生性牙髓治療旨在通過組織工程學(xué)原理，生成新的牙髓樣組織，恢復(fù)牙齒的生理功能，成為一種新的治療選擇。再生性牙髓治療的方法主要包括牙髓血運(yùn)重建術(shù)、細(xì)胞移植技術(shù)和細(xì)胞歸巢技術(shù)。牙髓血運(yùn)重建術(shù)是目前唯一用于臨床的牙髓再生技術(shù)，但再生組織為骨樣和牙周樣組織，并非真正意義上的牙髓再生[16]；細(xì)胞移植技術(shù)需要遵循復(fù)雜的干細(xì)胞選擇、擴(kuò)增、儲存、運(yùn)輸?shù)瘸绦?，存在病原體傳播和免疫排斥的風(fēng)險(xiǎn)，臨床應(yīng)用較為困難；而細(xì)胞歸巢技術(shù)是利用生物信號分子使內(nèi)源性干細(xì)胞遷移、增殖和分化，可規(guī)避上述風(fēng)險(xiǎn)，易操作和實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化[17]。

1.體外研究

CGF作為一種富含生長因子的天然支架，主要通過細(xì)胞歸巢的策略實(shí)現(xiàn)牙髓組織的再生。FGF-2是牙髓再生治療中研究最多的生長因子，已被證明參與牙髓組織修復(fù)和再生的所有階段，包括牙源性干細(xì)胞的遷移、增殖、細(xì)胞干性的維持以及血管和神經(jīng)形成，其中FGF-2通過BMP和Wnt信號通路調(diào)節(jié)牙源性干細(xì)胞的成牙本質(zhì)向分化；通過刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及增強(qiáng)牙髓干細(xì)胞的特性以促進(jìn)新生血管的形成；FGF-2不僅是一種重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，還誘導(dǎo)牙髓干細(xì)胞分化為神經(jīng)元細(xì)胞，有利于神經(jīng)的修復(fù)和再生[18]。

促進(jìn)牙髓再生的干細(xì)胞主要有牙髓干細(xì)胞和根尖乳頭干細(xì)胞[19]。Jin[20]等用不同濃度（5%、10%、20%、50%和80%）的CGF條件培養(yǎng)基培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)CGF促進(jìn)牙髓干細(xì)胞增殖且成劑量依賴性，但是較低濃度（10%和20%）的CGF對牙髓干細(xì)胞的遷移和礦化作用更為明顯，原因可能為高濃度的CGF中含有較多的炎癥因子從而產(chǎn)生了負(fù)性作用。Xu[21]等用脂多糖和CGF條件培養(yǎng)基共同培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞，與對照組相比，CGF對炎癥狀態(tài)下的牙髓干細(xì)胞仍具有顯著的促增殖和遷移作用，并上調(diào)牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1、骨鈣蛋白等成牙/成骨相關(guān)基因水平，為臨床上牙髓炎癥時(shí)CGF的應(yīng)用提供了理論支持。與牙髓干細(xì)胞相似，CGF對根尖乳頭干細(xì)胞的增殖、遷移同樣具有明顯的促進(jìn)作用，上調(diào)堿性磷酸酶、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1等基因的表達(dá)[22，23]，提示當(dāng)牙髓完全壞死缺乏牙髓干細(xì)胞時(shí)，CGF作用于根尖乳頭干細(xì)胞發(fā)揮功能。

改善局部缺血微環(huán)境和促進(jìn)神經(jīng)形成是再生性牙髓治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。CGF中富含VEGF、基質(zhì)金屬蛋白酶等必要促血管生成因子和內(nèi)皮祖細(xì)胞樣細(xì)胞，有利于多種血管生成介質(zhì)的表達(dá)，增加毛細(xì)血管通透性，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和小管樣結(jié)構(gòu)的形成[8，19]。分別用含有CGF和VEGF的內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞7天后，與二者單獨(dú)應(yīng)用相比，CGF和VEGF聯(lián)合應(yīng)用產(chǎn)生協(xié)同作用，形成了更為廣泛、成熟的小管樣結(jié)構(gòu)[20]。Qin[24]等用CGF條件培養(yǎng)基培養(yǎng)雪旺細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其神經(jīng)生長因子和膠質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)營養(yǎng)因子的基因和蛋白表達(dá)水平均提高約1.5倍，極大地促進(jìn)了周圍神經(jīng)的功能性修復(fù)。因此，CGF不僅對牙源性干細(xì)胞具有趨化、增殖和成牙本質(zhì)向分化的作用，還可以促進(jìn)血管和神經(jīng)的形成，為CGF在牙髓再生治療的體內(nèi)研究提供了理論基礎(chǔ)。

2.體內(nèi)研究

Xu[21]等將比格犬未成熟前牙摘除牙髓后，CGF導(dǎo)入根管，嚴(yán)密封閉，8周后拔除患牙，可見根管壁增厚，根尖正常閉合，根管內(nèi)新形成的牙髓樣組織不僅高表達(dá)VEGF和巢蛋白，其周圍還伴有柵欄狀排列的類成牙本質(zhì)細(xì)胞，提示功能性牙髓再生的可能。而Zhang[25]等將CGF和血凝塊分別導(dǎo)入人離體牙根管后，植于裸鼠皮下，結(jié)果顯示二者誘導(dǎo)的新生組織結(jié)構(gòu)類似，CGF組的神經(jīng)纖維和血管數(shù)量更多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但均未發(fā)現(xiàn)類成牙本質(zhì)細(xì)胞及新生牙本質(zhì)，原因可能為皮下組織的微環(huán)境不利于牙本質(zhì)的形成。CGF能否再生功能性牙髓組織尚存爭議，需要更多高質(zhì)量的動物研究予以證明。

3.臨床研究

Wang[26]等報(bào)道了一例CGF用于年輕恒牙牙髓再生的臨床研究，徹底消除根管內(nèi)感染后，將CGF凝膠剪碎置于根管全段，然后用MTA嚴(yán)密封閉根管口，術(shù)后10個月根尖孔閉合，根尖區(qū)大面積暗影消失，但牙髓活力溫度測試無反應(yīng)。最新的一項(xiàng)回顧性研究[27]總結(jié)了CGF和血凝塊用于因外傷導(dǎo)致牙髓壞死的年輕恒牙的牙髓再生治療，以牙根是否進(jìn)一步發(fā)育作為評判成功或失敗的標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示80.6%的牙齒發(fā)生了牙根的進(jìn)一步發(fā)育，其中血凝塊成功率明顯高于CGF，牙齒撕脫性損傷的成功率最低，僅為33.3%，提示不同原因?qū)е碌难浪鑹乃罆绊懷浪柙偕男Ч?，不同血小板濃縮物的作用效果也存在差異。目前CGF用于牙髓再生的臨床研究大多為年輕恒牙的病例報(bào)道，大部分病例都有牙根的進(jìn)一步發(fā)育，但未見牙髓活力恢復(fù)的報(bào)道。

四、CGF應(yīng)用于根尖區(qū)骨修復(fù)的作用與機(jī)制

當(dāng)牙髓病變繼續(xù)發(fā)展累及根尖區(qū)時(shí)，若長時(shí)間未得到控制則會進(jìn)展成根尖周炎或根尖周囊腫等疾病，損傷根尖區(qū)牙骨質(zhì)、牙周膜和牙槽骨，進(jìn)而造成大面積的骨缺損。臨床上常需輔以根尖手術(shù)治療，徹底清除感染，單獨(dú)或聯(lián)合填塞骨粉和CGF等血小板濃縮物，以加快根尖區(qū)骨缺損的修復(fù)和提升骨再生的質(zhì)量。

1.體外研究

根尖區(qū)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，CGF可以作用于多種根尖區(qū)細(xì)胞實(shí)現(xiàn)骨組織的修復(fù)，發(fā)揮作用的生長因子主要有TGF-β1、BMP-2、VEGF[28]，已報(bào)道的細(xì)胞包括成骨細(xì)胞[29]、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞[30]、牙髓干細(xì)胞[21]、根尖乳頭干細(xì)胞[22]、牙周膜成纖維細(xì)胞[31]、牙周膜細(xì)胞[32]等。Dong[29]等發(fā)現(xiàn)CGF不僅可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和遷移，還通過激活磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）信號通路，增加成骨細(xì)胞的礦化。Qiao[32]等將不同濃度（1CGF、3CGF、5CGF）的CGF處理牙周膜細(xì)胞，TGF-β1和血小板衍生生長因子-AB（platelet derived growth factor,PDGFAB）處理作為陽性對照組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)取自3 ml全血的CGF，即3CGF組中牙周膜細(xì)胞的增殖、堿性磷酸酶活性和Wnt3a基因的表達(dá)均明顯高于其他實(shí)驗(yàn)組和陽性對照組，表明CGF中多種活性成分協(xié)同作用，且3CGF成骨作用最為突出。有學(xué)者[3]將CGF中提取的原代細(xì)胞成骨誘導(dǎo)21天后，茜素紅染色顯示強(qiáng)陽性，矮小相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2、骨鈣蛋白等成骨標(biāo)志物的表達(dá)增強(qiáng)7~11倍。以上研究表明CGF不僅可以促進(jìn)多種根尖周細(xì)胞成骨分化，CGF中的原代細(xì)胞也具有強(qiáng)大的成骨潛力。另一方面，控制炎癥反應(yīng)也是根尖周骨修復(fù)的重要環(huán)節(jié)。最近的一項(xiàng)研究[33]發(fā)現(xiàn)，CGF可以促進(jìn)單核細(xì)胞遷移，誘導(dǎo)其成熟分化為巨噬細(xì)胞，并激活PKB信號通路促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，為炎癥狀態(tài)下組織的修復(fù)創(chuàng)造一個有利微環(huán)境。

2.體內(nèi)研究

CGF作為最新一代的血小板濃縮物，Li[34]等比較了CGF與PRF、貧血小板血漿（platelet-poor plasma,PPP）對新西蘭兔拔牙后骨再生的作用效果，發(fā)現(xiàn)CGF組牙槽骨的吸收明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且新生骨小梁比其他組粗大、排列緊密，提示相比于其他血小板濃縮物，CGF有著更加優(yōu)異的骨誘導(dǎo)和骨再生能力。有學(xué)者將CGF與納米羥基磷灰石/膠原蛋白支架聯(lián)合或單獨(dú)植于兔下頜骨缺損區(qū)，結(jié)果顯示二者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)新骨生成速度和生成量明顯大于單獨(dú)應(yīng)用，新生骨組織在組織學(xué)和影像學(xué)表現(xiàn)與正常骨組織相似，且有良好的抗壓強(qiáng)度和彈性模量，復(fù)合材料在24周時(shí)幾乎完全降解，表明CGF與骨修復(fù)材料聯(lián)合應(yīng)用可以獲得較為理想的骨修復(fù)效果[35]。

3.臨床研究

由于CGF優(yōu)異的成骨作用，其在根尖周炎骨修復(fù)治療的臨床研究中受到越來越多的青睞。Sureshbabu等[36]報(bào)道了患有慢性根尖周炎的4顆前牙行根尖手術(shù)后，在根尖骨缺損處放置CGF纖維蛋白塊，并覆蓋CGF膜，6個月后即形成了理想的骨愈合，明顯縮短了廣泛性根尖周病變愈合的時(shí)間。Jiang[37]等比較了CGF聯(lián)合根尖刮治術(shù)和單一行根尖刮治術(shù)治療慢性竇道型根尖周炎的臨床療效，發(fā)現(xiàn)用CGF覆蓋根尖區(qū)創(chuàng)面的患牙，其牙槽骨密度明顯增高，根尖新骨形成量較多，臨床有效率達(dá)95%，明顯高于未使用CGF組。當(dāng)根尖周炎比較嚴(yán)重，需要拔除患牙時(shí)，CGF仍具有應(yīng)用價(jià)值。Keranmu[38]等將CGF置于因根尖周炎而微創(chuàng)拔除的磨牙牙槽窩底部，然后將第三磨牙移植于牙槽窩，隨訪發(fā)現(xiàn)CGF組顯著減輕了術(shù)后疼痛和初期愈合的反應(yīng)，縮短愈合周期，2年后患者根尖周病變完全愈合，咀嚼功能正常，臨床檢查和影像學(xué)檢查均未見異常，移植成功率高達(dá)100%。綜上，CGF在根尖周炎骨修復(fù)治療中具有良好的臨床效果。

五、總結(jié)與展望

CGF來源豐富，制取方便，生物相容性和生物安全性高，免疫原性低，多種生物活性成分協(xié)同作用，在活髓保存、牙髓再生、根尖周炎骨再生中已被證明具有良好的潛能，但仍具有一定的局限性。首先，單純CGF釋放生長因子過快，局部生長因子濃度過低，無法作用于組織修復(fù)的全程，特別是修復(fù)時(shí)間較長的骨組織工程。其次，CGF發(fā)揮作用的機(jī)制尚未明確，各種生長因子之間相互作用復(fù)雜，再生的組織是否具有生物學(xué)功能也存在爭議。最后，CGF中活性成分是否會對全身其他細(xì)胞產(chǎn)生作用未見報(bào)道，不同患者的內(nèi)源性干細(xì)胞活力差異較大，CGF的適用條件及適宜濃度也需要考慮。因此，未來的研究應(yīng)著重于CGF局部生長因子緩釋系統(tǒng)的構(gòu)建，并使其在特定部位可以精準(zhǔn)調(diào)控生長因子的釋放順序和釋放劑量，滿足不同階段組織修復(fù)和再生的需求。雖然目前尚未實(shí)現(xiàn)真正意義上的牙髓再生，但不可否認(rèn)的是生長因子是牙髓再生的關(guān)鍵，CGF作為生長因子儲存庫和天然支架，在牙髓治療中有著巨大的應(yīng)用潛力，應(yīng)進(jìn)行更深層次的基礎(chǔ)研究和大量的隨機(jī)對照體內(nèi)及臨床實(shí)驗(yàn)，為CGF的臨床應(yīng)用提供更高質(zhì)量科學(xué)證據(jù)，加快再生牙髓病學(xué)的發(fā)展。