王心依，王治琪，王珺，徐琴舟，夏小雨

精子形成是精子發(fā)生的重要階段。在精子形成過(guò)程中，圓形的單倍體精子細(xì)胞經(jīng)歷了顯著的核和細(xì)胞骨架修飾，以獲得精子特有的、高度極化的形態(tài)。這一過(guò)程涵蓋頂體發(fā)育、核固縮和鞭毛組裝等。其中，精子領(lǐng)（manchette）是精子形成過(guò)程中一個(gè)短暫存在的結(jié)構(gòu)，主要由細(xì)胞骨架成分微管和肌動(dòng)蛋白構(gòu)成，以精子領(lǐng)為平臺(tái)，進(jìn)行著活躍的物質(zhì)運(yùn)輸，在精子核固縮及鞭毛組裝過(guò)程中發(fā)揮重要作用。由于缺乏男性單倍體生精細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，目前與精子領(lǐng)相關(guān)的分子機(jī)制研究只能依賴(lài)于動(dòng)物模型。本文綜述了近年來(lái)有關(guān)精子領(lǐng)及精子領(lǐng)內(nèi)運(yùn)輸（intra-manchette transport，IMT）的關(guān)鍵調(diào)控蛋白的研究進(jìn)展及臨床相關(guān)性，可為理解部分男性不育的發(fā)病機(jī)制、開(kāi)發(fā)可能的治療手段提供理論依據(jù)。

1 精子領(lǐng)的形成及結(jié)構(gòu)

精子領(lǐng)是精子形成過(guò)程中短暫存在的結(jié)構(gòu)，首先出現(xiàn)于人類(lèi)第2步（Step2）精子細(xì)胞[1]和小鼠Step8精子細(xì)胞[2]。頂體生物發(fā)生的啟動(dòng)早于精子領(lǐng)的形成，且是后者正常發(fā)生的重要前提。目前，精子領(lǐng)微管的起源尚不確定，但據(jù)Lehti等[3]的綜述，在小鼠和大鼠中應(yīng)當(dāng)起源于中心粒區(qū)域；在精子領(lǐng)組裝過(guò)程中，短微管在細(xì)胞核周?chē)奂?，通過(guò)其正端末端（plus end）連接到含有δ-微管蛋白/角蛋白9的核周環(huán)（perinuclear ring），并迅速形成一個(gè)含有多達(dá)1 000條微管的裙?fàn)睿╯kirt-like）結(jié)構(gòu)[4-5]；另一方面，微管之間彼此連接形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，再通過(guò)核骨架與細(xì)胞骨架連接（linker of nucleoskeleton and cytoskeleton，LINC）復(fù)合體的中介，在多個(gè)位點(diǎn)與核膜相結(jié)合[6]。隨著核周環(huán)逐漸收縮，精子領(lǐng)逐漸向形成中的精子尾部遷移。在精子領(lǐng)發(fā)育過(guò)程中，鉤蛋白（HOOK）及其相關(guān)復(fù)合體參與精子領(lǐng)微管交聯(lián)、精子領(lǐng)遷移的調(diào)控；精子細(xì)胞特異性的LINC復(fù)合體負(fù)責(zé)精子領(lǐng)與核膜的連接，調(diào)節(jié)精子核成形（nuclear shaping）；精子相關(guān)抗原蛋白家族（sperm associated antigen，SPAG）、中心體蛋白家族（centrosomal protein，CEP）和纖毛及鞭毛相關(guān)蛋白家族（cilia- and flagellaassociated protein，CFAP）也在精子領(lǐng)的組裝及維持中發(fā)揮作用。已有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)，上述蛋白的表達(dá)異常都可能造成精子形成障礙。

1.1 HOOK1HOOK1是鉤蛋白家族成員。小鼠精子細(xì)胞通過(guò)可變剪切表達(dá)Hook1蛋白的變異體，該變異體很可能使精子領(lǐng)微管之間發(fā)生交聯(lián)，從而保證其完整性；而全長(zhǎng)Hook1蛋白可能在促進(jìn)精子領(lǐng)本身的延伸及其向尾部遷移中發(fā)揮作用。Hook1基因缺失會(huì)引起精子領(lǐng)畸形，導(dǎo)致精子頭部或尾部形態(tài)異常和斷頭，進(jìn)而導(dǎo)致雄性小鼠不育[7]。在人類(lèi)中也發(fā)現(xiàn)了由HOOK1基因突變導(dǎo)致斷頭精子癥的家系[8]。

1.2 鉤蛋白相關(guān)復(fù)合體神經(jīng)元突觸膜結(jié)合蛋白3（Rab3 interacting molecule binding protein 3，RIMBP3）在人和小鼠中高度同源，該蛋白在小鼠精子細(xì)胞中特異表達(dá)。富亮氨酸重復(fù)序列和鳥(niǎo)苷酸激酶結(jié)構(gòu)域蛋白（leucine-rich repeats and guanylate kinase domain containing，LRGUK）高表達(dá)于小鼠精子形成階段。在小鼠中，Hook1/2/3可與RIMBP3、LRGUK以及驅(qū)動(dòng)蛋白輕鏈3（kinesin light chain 3，KLC-3）共同形成蛋白復(fù)合體，參與頂體附著、精子領(lǐng)發(fā)育及IMT、精子核成形和精子尾部軸絲延伸等多個(gè)環(huán)節(jié)的調(diào)控。小鼠中Rimbp3基因的缺失[9]或Lrguk基因的突變均可導(dǎo)致雄性小鼠不育[10-11]。

1.3 Sad1/UNC84結(jié)構(gòu)域（Sad1-UNC84 homology domain，SUN）蛋白家族在人和小鼠等哺乳動(dòng)物中，LINC復(fù)合體的組分主要包括定位于核內(nèi)膜SUN蛋白家族及定位于核外膜的Nesprin蛋白家族。在小鼠精子發(fā)生中，精子領(lǐng)通過(guò)LINC復(fù)合體與核膜連接，這對(duì)精子領(lǐng)的遷移及精子的最終形態(tài)至關(guān)重要。SUN蛋白家族成員SUN3和SUN4是小鼠睪丸特異性核膜蛋白，二者存在直接結(jié)合；由SUN3/SUN4參與形成的LINC復(fù)合體負(fù)責(zé)將精子領(lǐng)連接到核膜[12]。在Sun4敲除小鼠的精子細(xì)胞中，精子領(lǐng)從核周環(huán)上解離，最終長(zhǎng)形精子無(wú)法形成，雄性小鼠不育，其表型與人類(lèi)圓頭精子癥（globozoospermia）類(lèi)似。Sun3敲除雄性小鼠的表型與之相似且更加嚴(yán)重，表現(xiàn)為精子領(lǐng)缺失、核固縮異常、頂體和鞭毛結(jié)構(gòu)紊亂、精子數(shù)量顯著下降[6]。

1.4 SPAG17小鼠的SPAG諸多成員參與單倍體精子細(xì)胞形變過(guò)程的調(diào)控。其中，SPAG17蛋白與精子領(lǐng)微管結(jié)構(gòu)共定位；而在成熟精子中，SPAG17蛋白信號(hào)出現(xiàn)在頂體和尾部。敲除小鼠的Spag17基因會(huì)引起精子領(lǐng)結(jié)構(gòu)異常、頭部形態(tài)缺陷和IMT障礙，最終導(dǎo)致雄性小鼠不育[13]。

1.5 CEPCEP70和CEP131參與調(diào)控纖毛的形成、中心粒的復(fù)制及基因組的穩(wěn)定性。在小鼠中敲除這2種基因后均可導(dǎo)致雄鼠不育，但表型存在差異。Cep70基因缺失小鼠精子頂體和鞭毛形成出現(xiàn)異常，但仍有精子形成[14]；而Cep131基因缺失會(huì)導(dǎo)致精子發(fā)生停滯于Step9的單倍體精子細(xì)胞，主要是由于精子領(lǐng)結(jié)構(gòu)不能正確組裝，導(dǎo)致IMT障礙[15]。

1.6 CFAPCFAP43和CFAP44均在睪丸中特異性高表達(dá)。2017年以來(lái)的多篇文章證實(shí)，人類(lèi)CFAP43及CFAP44基因的突變與精子鞭毛多種形態(tài)異常（multiple morphological abnormalities of the flagella，MMAF）有關(guān)[16]。Cfap43或Cfap44敲除小鼠均出現(xiàn)MMAF表型。Cfap43敲除小鼠的精子細(xì)胞還可以觀察到形態(tài)異常的精子領(lǐng)，提示CFAP43不僅參與調(diào)控鞭毛組分運(yùn)輸和組裝，還參與正常精子領(lǐng)結(jié)構(gòu)的維持[17]。這一家族的另一成員CFAP65蛋白定位于人類(lèi)精子頂體區(qū)域和鞭毛中部，人類(lèi)CFAP65基因突變可導(dǎo)致頂體發(fā)育不全、鞭毛畸形，最終表現(xiàn)為嚴(yán)重的弱精子癥。Cfap65敲除雄鼠同樣表現(xiàn)為嚴(yán)重的弱精子癥，其精子細(xì)胞的部分細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白表達(dá)量下調(diào)，精子領(lǐng)發(fā)育及IMT出現(xiàn)障礙，精子形成過(guò)程受阻[18]。

1.7 CAP-Gly結(jié)構(gòu)域連接蛋白1（CAP-Gly domain containing linker protein 1，CLIP1）CLIP1是一種微管正端追蹤（plus-end-tracking）蛋白，參與微管動(dòng)力學(xué)的調(diào)控、動(dòng)力蛋白激活蛋白（dynactin）的定位以及內(nèi)體與微管之間的連接。在小鼠睪丸中，CLIP1蛋白高表達(dá)于精原細(xì)胞與早期精母細(xì)胞，并出現(xiàn)在精子形成階段的中心體和精子領(lǐng)上。Clip1基因敲除雄鼠精子頭部異常、生育力低下[19]。

1.8 前纖維蛋白3（profilin 3，PFN3）PFN是細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白聚合的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，包括PFN1～PFN4。在小鼠精子細(xì)胞中，PFN3特異性定位于高爾基體、頂體前體小泡、頂質(zhì)體-精子領(lǐng)復(fù)合體和線(xiàn)粒體。在Pfn3基因敲除小鼠中，包括絲切蛋白1/2（cofilin1/2）、肌動(dòng)蛋白解聚因子（actin depolymerizing factor）在內(nèi)的重要的細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而出現(xiàn)精子領(lǐng)發(fā)育異常、頂體及鞭毛畸形，最終產(chǎn)生圓頭精子癥表型，雄性生育力下降[20]。

1.9 SEPT14-ACTN4蛋白復(fù)合體隔蛋白（septin）是高度保守的三磷酸鳥(niǎo)苷（guanosine triphosphate，GTP）結(jié)合蛋白，聚合的隔蛋白通過(guò)與微管、肌動(dòng)蛋白和其他細(xì)胞成分的相互作用，參與細(xì)胞骨架的調(diào)控。在小鼠中，隔蛋白SEPT14與輔肌動(dòng)蛋白ACTN4（alpha-Actinin-4）共同定位在早期延長(zhǎng)型精子細(xì)胞中的精子領(lǐng)及核周區(qū)域，參與精子領(lǐng)結(jié)構(gòu)的維持。攜帶SEPT14突變的男性精子樣本中，ACTN4的定位及分布異常，并伴有精子頭部畸形[21]。

1.10 軸絲動(dòng)力蛋白輕鏈結(jié)構(gòu)域蛋白1（axonemal dynein light chain domain containing 1，AXDND1）AXDND1在人與小鼠中高度同源，僅在睪丸中單倍體精子細(xì)胞中特異性高表達(dá)，并與微管蛋白結(jié)合。測(cè)序結(jié)果證實(shí)，人類(lèi)AXDND1基因突變與男性非梗阻性無(wú)精子癥有關(guān)。Axdnd1敲除的雄鼠雖然可以形成精子領(lǐng)，但其結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)變化異常，最終導(dǎo)致晚期精子細(xì)胞大量凋亡、雄鼠不育[22]。

2 IMT及其調(diào)控

小鼠的精子領(lǐng)存在于Step8～Step14精子細(xì)胞。在此期間，各種貨物蛋白（cargo protein）依賴(lài)IMT到達(dá)特定位點(diǎn)，這對(duì)核固縮及精子尾部鞭毛的組裝都十分重要。值得注意的是，精子領(lǐng)內(nèi)微管的正端末端指向頂體，與尾部鞭毛中微管的極性相反[3]。因此，向頂體方向進(jìn)行的IMT需要順向馬達(dá)蛋白，如驅(qū)動(dòng)蛋白（kinesin）；而向遠(yuǎn)離頂體的方向運(yùn)輸需要逆向馬達(dá)蛋白，如動(dòng)力蛋白（dynein）；此外，F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白（F-actin）和肌球蛋白（myosin）也在精子領(lǐng)上有定位[23-25]。除上述細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白外，鉤蛋白家族、鞭毛內(nèi)運(yùn)輸?shù)鞍祝╥ntraflagellar transport，IFT）家族等也在IMT中發(fā)揮作用，各蛋白家族成員往往彼此結(jié)合組成特定的蛋白復(fù)合體。

2.1 驅(qū)動(dòng)蛋白家族（kinesin family）驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員KIF3A、KIF3B、KIF17b、KIF27、KIF5CA[1,3,23]等在精子領(lǐng)上均有定位，推測(cè)其參與IMT過(guò)程。其中，KIF3B可與HOOK1-RIMBP3形成復(fù)合體[9]。KIF3A可與KIF3B或KIF1結(jié)合蛋白（KIF1-binding protein，KBP）相互結(jié)合，并負(fù)責(zé)減數(shù)分裂特異性核結(jié)構(gòu)蛋白1（meiosis specific nuclear structural 1，MNS1）的IMT[26]。在小鼠生精細(xì)胞中條件性敲除Kif3a會(huì)導(dǎo)致精子領(lǐng)功能異常，進(jìn)而導(dǎo)致精子頭部畸形[27]。

2.2 IFT復(fù)合體-B在精子形成過(guò)程中，鞭毛組裝早于精子領(lǐng)的形成，由基粒微管延伸形成軸絲。以軸絲為基礎(chǔ)的鞭毛內(nèi)運(yùn)輸主要由IFT復(fù)合體負(fù)責(zé)[28]。其中，IFT復(fù)合體-A含有6個(gè)亞基，負(fù)責(zé)逆向運(yùn)輸（負(fù)端定向運(yùn)輸）；IFT復(fù)合體-B含有16個(gè)亞基，負(fù)責(zé)順向運(yùn)輸（正端定向運(yùn)輸）。研究發(fā)現(xiàn)，除了定位于發(fā)育中的鞭毛，IFT復(fù)合體-B還定位于精子領(lǐng)。敲除小鼠的編碼IFT-B亞基的基因，包括Ift20、Ift25、Ift27、Ift74和Ift88等，可導(dǎo)致雄鼠不育[28-31]，這也體現(xiàn)出IMT與IFT的共性。

2.3 絲氨酸/蘇氨酸激酶36（serine/threonine kinase 36，STK36）在小鼠睪丸中，STK36蛋白定位于精子領(lǐng)和頂體-頂質(zhì)體復(fù)合體，并與KIF27蛋白以及鞭毛中外周致密纖維蛋白（outer dense fiber 1，ODF1）形成蛋白復(fù)合體。在雄鼠生殖細(xì)胞中條件性敲除Stk36基因會(huì)導(dǎo)致精子數(shù)量減少、頭部畸形、斷頭和精子運(yùn)動(dòng)缺陷，進(jìn)而導(dǎo)致不育[32]。

2.4 Parkin共調(diào)基因（Parkin co-regulated gene，PACRG）-減數(shù)分裂表達(dá)基因1（meiosis-expressed gene 1，MEIG1）蛋白復(fù)合體在小鼠精子形成過(guò)程中，PACRG蛋白可以招募MEIG1蛋白到精子領(lǐng)，兩者的結(jié)合可以穩(wěn)定PACRG蛋白使其免于降解。PACRG-MEIG1蛋白復(fù)合體負(fù)責(zé)部分貨物蛋白（如精子鞭毛蛋白SPAG16L）在精子領(lǐng)內(nèi)的運(yùn)輸。當(dāng)小鼠MEIG1 蛋 白Y68 氨 基 酸 突 變 時(shí)，MEIG1 無(wú) 法 與PACRG結(jié)合，IMT功能出現(xiàn)異常[33]。Meig1突變或缺失的雄鼠表現(xiàn)出精子細(xì)胞核固縮及鞭毛發(fā)生障礙，雄性不育。PACRG-MEIG1蛋白復(fù)合體在小鼠與人類(lèi)之間高度保守，人類(lèi)PACRG基因啟動(dòng)子的突變是與男性無(wú)精子癥相關(guān)的危險(xiǎn)因素[34]。

2.5 精子鞭毛蛋白2（sperm flagellar 2，SPEF2）在小鼠睪丸中，SPEF2可作為動(dòng)力蛋白1的接頭蛋白（linker protein），將IFT20連接到精子領(lǐng)結(jié)構(gòu)上，而IFT20蛋白又與HOOK及其他IMT功能蛋白相互結(jié)合。在雄性小鼠生殖細(xì)胞中條件性敲除Spef2基因會(huì)導(dǎo)致IMT障礙，致使小鼠精子頭部和尾部畸形、精子數(shù)量下降[35]。

2.6 末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶5C（terminal nucleotidyltransferase 5C，TENT5C）TENT5C屬于高度保守的非經(jīng)典RNA多腺苷聚合酶（non-canonical RNApolyadenylation polymerase）家族，在人和小鼠的睪丸中大量表達(dá)，并精確定位于精子領(lǐng)。TENT5C基因敲除雄性小鼠不育，雖然其精子形成過(guò)程中精子領(lǐng)結(jié)構(gòu)是正常的，但產(chǎn)生大量無(wú)頭精子；也可產(chǎn)生少量形態(tài)無(wú)異常的精子，但卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)精子注射實(shí)驗(yàn)顯示，它們的受精能力受到了嚴(yán)重?fù)p害[36]。

3 精子領(lǐng)的消除

小鼠精子領(lǐng)的消除發(fā)生在精子形成的Step13～Step14，精子領(lǐng)以類(lèi)似拉鏈狀的運(yùn)動(dòng)方式向精子尾部移動(dòng)，與此同時(shí)，核周環(huán)收縮，幫助精子頭部延伸及固縮[3]。隨后，由微管切割蛋白Katanin主導(dǎo)了精子領(lǐng)的消除。Katanin定位于精子領(lǐng)微管的負(fù)端（minus end），也就是伸向尾部的一端。Katanin由催化亞基p60和調(diào)節(jié)亞基p80構(gòu)成，突變的p80蛋白將導(dǎo)致精子領(lǐng)消除的延遲及精子尾部結(jié)構(gòu)的畸形[37]。在此過(guò)程中，WD40 重 復(fù) 蛋 白62 （WD40 repeat protein 62，WDR62）參與招募Katanin到精子領(lǐng)，因此，Wdr62基因突變小鼠的精子領(lǐng)消除出現(xiàn)障礙，進(jìn)而導(dǎo)致少弱畸形精子癥表型[38]。KATNAL2（Katanin-like 2）蛋白也是微管切割蛋白Katanin家族的成員，Katnal2突變或條件性敲除的雄性小鼠精子領(lǐng)結(jié)構(gòu)異常，并最終導(dǎo)致不育[39]。

4 結(jié)語(yǔ)

精子變形過(guò)程機(jī)制復(fù)雜，精子領(lǐng)及IMT在其中發(fā)揮重要作用。干擾精子領(lǐng)的組裝、維持、消除以及IMT的正常調(diào)控，都可能導(dǎo)致不同程度的生精障礙。除正文中所列因子外，還有一些蛋白也被發(fā)現(xiàn)定位于小鼠或人類(lèi)精子領(lǐng)上[40-47]，若功能缺失則會(huì)導(dǎo)致生精障礙，但具體機(jī)制仍有待研究。隨著基因敲除等生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，將有越來(lái)越多的精子領(lǐng)功能相關(guān)蛋白被驗(yàn)證。這也將為臨床上因精子形成障礙所引起的男性不育的診治以及未來(lái)男性新避孕靶點(diǎn)的研發(fā)提供重要的理論參考。