何向東

（巴中市南江黃羊科學(xué)研究所 636600）

傳染病能降低羊生產(chǎn)性能，目前在畜牧業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中控制措施基本應(yīng)用抗菌藥物，這往往會(huì)導(dǎo)致抗生素耐藥菌株的發(fā)生。因此，動(dòng)物疫苗接種，這必是行之有效的管理措施。對(duì)于動(dòng)物而言，先天免疫系統(tǒng)是防御微生物感染的屏障，而絕大多數(shù)動(dòng)物對(duì)病原體的處理完全依賴于先天免疫識(shí)別。脊椎動(dòng)物已經(jīng)進(jìn)化出一個(gè)更復(fù)雜的防御系統(tǒng)，稱為適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，以對(duì)病原體形成先天抵抗力。先天免疫系統(tǒng)能夠識(shí)別微生物及其微生物代謝產(chǎn)物，通過(guò)編碼的受體識(shí)別而發(fā)揮作用[1]。Toll樣受體(Toi-like receptors，TLRs)是參與天然免疫過(guò)程中病原相關(guān)分子模式(Pathogen associtated molecular patterns, PAMPs)的特異性模式識(shí)別受體(Pathogen recognition receptors, PRRs),當(dāng)與其相應(yīng)PAMPs分子結(jié)合后，以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)的生物學(xué)功能。TLRs作為研究PRRs的熱點(diǎn)之一，目前羊的TLRs已克隆出10個(gè)類型[2]。先天免疫系統(tǒng)的PRR中，尤其是Toll樣受體(TLR)家族負(fù)責(zé)啟動(dòng)急性炎癥反應(yīng)，通過(guò)誘導(dǎo)抗微生物以對(duì)抗入侵的病原體基因和炎癥細(xì)胞因子[3]。TLR信號(hào)可活化吞噬細(xì)胞和直接殺死傳染性微生物，脊椎動(dòng)物的免疫系統(tǒng)識(shí)別特定序列環(huán)境（CpG基序）中未甲基化的CpG，這在細(xì)菌基因組中比在脊椎動(dòng)物基因組中更為普遍[4]。鑒于TLRs基因的表達(dá)和突變與炎癥病理具有較高的相關(guān)性。因此，本文對(duì)羊的TLR家族進(jìn)行綜述，以期為羊的抗病育種提供重要理論支撐。

1 TLRs生物學(xué)結(jié)構(gòu)及功能

TLRs作為I型跨膜糖蛋白，由胞外區(qū)、胞內(nèi)信號(hào)區(qū)和跨膜區(qū)組成，其中胞外區(qū)特點(diǎn)在于其具有富含亮氨酸重復(fù)序列。該序列與宿主抗感染反應(yīng)特異性相關(guān)，生理學(xué)功能在于可實(shí)現(xiàn)空間結(jié)構(gòu)的變化來(lái)達(dá)到TLRs對(duì)病原成分進(jìn)行識(shí)別。此外，跨膜區(qū)其特點(diǎn)在于富含半胱氨酸，該結(jié)構(gòu)域生物學(xué)功能在于可決定TLRs分子的亞細(xì)胞定位。胞內(nèi)信號(hào)區(qū)也被稱為稱Toll-IL-1受體(Tol-IL-1 receptor, TIR)結(jié)構(gòu)域，與白介素-1受體家族的胞內(nèi)區(qū)具有高度同源性，結(jié)合部位位于細(xì)胞內(nèi)的髓樣分化因子接頭，誘導(dǎo)對(duì)應(yīng)的免疫應(yīng)答，阻止病原微生物的侵襲[5]。

激發(fā)TLR配體至少包括兩個(gè)重要的信號(hào)通路，一是涉及MyD88的神經(jīng)節(jié)蛋白由TLR激發(fā)，從而導(dǎo)致激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和促炎-釋放傳導(dǎo)性細(xì)胞因子。二是驅(qū)動(dòng)第二種途徑抗原呈遞細(xì)胞的成熟并增加MHC分子，共同刺激分子CD40和趨化因子受體CCR7的表達(dá)。以上信號(hào)均是被認(rèn)為對(duì)T細(xì)胞介導(dǎo)的啟動(dòng)起著至關(guān)重要的免疫信號(hào)通路[6]。

2 羊TLRs研究現(xiàn)狀

2.1 TLR4

Toll 樣受體 4 (TLR4) 是一種模式識(shí)別受體(PRR) 在先天免疫和宿主中起關(guān)鍵防御作用。TLR4是脂多糖 (LPS) 的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)器，LPS 是革蘭氏陰性菌的主要胞外成分。TLR4的激活可以促進(jìn)細(xì)胞增殖和凋亡[7]。

TLR4通過(guò)下游適配器來(lái)激活主要反應(yīng)基因88（MyD88）和含TIR結(jié)構(gòu)域的銜接子-誘導(dǎo)干擾素-α-（TRIF-α）依賴的途徑，通過(guò)核因子-kβ-（NF-kβ-）起作用的生理機(jī)制[8]。TLR4在轉(zhuǎn)基因綿羊中的過(guò)表達(dá)可能會(huì)加速刺激脂多糖分泌，通過(guò)NO生成來(lái)清除入侵微生物。此外，TLR4過(guò)表達(dá)也增強(qiáng)鳥(niǎo)苷三磷酸環(huán)水解酶（GCHI）活性，該酶是四氫生物蝶呤的限速酶（BH4）合成酶，這對(duì)于生產(chǎn)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶來(lái)說(shuō)必不可少[9]。急慢性呼吸道引起羊生產(chǎn)性能降低甚至死亡，呂偉麗[10]選擇TLR4、TLR9基因作為研究對(duì)象，分析該基因的遺傳多態(tài)性及變異特征，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)對(duì)山丹縣、隴西縣和永昌縣表型正常作為對(duì)照組和患有呼吸道疾病作為試驗(yàn)組的小尾寒羊TLR4基因外顯子3和TLR9基因的多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小尾寒羊TLR4外顯子3的AA、AB基因型與抗呼吸道疾病感染的遺傳潛力有關(guān)。這些依據(jù)對(duì)小尾寒羊的遺傳特性和生產(chǎn)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

2.2 TLR7

梁田等[11]對(duì)新疆薩?？搜騎oll樣受體7基因單核苷酸進(jìn)行多態(tài)性分析，采集新疆地區(qū)種羊場(chǎng)薩?？搜蜓?，采用PCR-SSCP方法進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序分析，序列比對(duì)分析存在A343G、A350G、A1244G的錯(cuò)義突變,氨基酸改變分別是Lys→Gln, Asp→Ser, Glu→Arg，且突變都發(fā)生在胞外區(qū)亮氨酸重復(fù)區(qū)內(nèi)；帶型AB是位點(diǎn)A343G和A350G同時(shí)發(fā)生突變；以上突變可能改變TLR7基因的功能，進(jìn)而影響免疫應(yīng)答，為探索綿羊TLR7基因多態(tài)性與抗病力的關(guān)系和提高羊抗病育種提供候選分子標(biāo)記。

2.3 TLR9

Zhou等[12]共發(fā)現(xiàn)羊4個(gè)SNP位點(diǎn)，其中1323 C/T 、1340 G/A、1384 G/T 和1452 G/A，其中第2個(gè)和第3個(gè)分別發(fā)生Arg/Gln 447 和Ala/Ser 462 氨基酸變化，這種替代會(huì)影響TLR9的功能，因而對(duì)疾病有易感性。TLR9基因可以作為小尾寒羊抗呼吸道疾病的候選基因，AA型可以作為小尾寒羊抗呼吸道疾病的標(biāo)記基因型[10]。

回腸或空腸中TLR1-5和8的表達(dá)增加，腸系膜淋巴結(jié)中TLR1-4、6和8的表達(dá)增加。與未暴露的動(dòng)物相比，暴露的周邊血液?jiǎn)魏思?xì)胞中TLR1、2和6-8的表達(dá)有增加的趨勢(shì)。這些差異結(jié)果有助于探明反芻動(dòng)物約翰氏病中TLR表達(dá)的情況和助于解釋發(fā)病機(jī)理，在將來(lái)診斷副結(jié)核病感染中有重要作用[13]。以塔什庫(kù)爾干羊、和田羊和多浪羊共107個(gè)樣本為研究對(duì)象，采用PCR、測(cè)序法和生物信息學(xué)方法分析TLR9基因的SNP及氨基酸差異。發(fā)現(xiàn)7個(gè)SNP，其中3個(gè)位點(diǎn)為同義突變，4個(gè)位點(diǎn)為非同義突變，確定為12個(gè)等位基因，其中新發(fā)現(xiàn)6個(gè)等位基因。首次發(fā)現(xiàn)氨基酸G437R的突變，可能影響機(jī)體對(duì)PAMP的識(shí)別。綿羊TLR9基因外顯子2具有較高的多態(tài)性，導(dǎo)致LRR空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)一步影響機(jī)體對(duì)疾病的感受性，這為新疆南疆地區(qū)綿羊抗病育種提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)[14]。

PCR-SSCP分析來(lái)研究綿羊TLR9基因關(guān)鍵區(qū)域的遺傳變異，確定了代表三種不同序列的三種新型SSCP 模式。在單個(gè)綿羊中檢測(cè)到存在不同的序列，并且所有鑒定的序列與來(lái)自多種物種的TLR9序列具有高度同源性，表明這些序列代表了綿羊TLR9 基因的等位基因變體。在擴(kuò)增的區(qū)域中檢測(cè)到四個(gè)單核苷酸多態(tài)性 (SNP)，其中兩個(gè)是會(huì)導(dǎo)致氨基酸變化的非同義替換。這里檢測(cè)到的變異可能對(duì) TLR9 的結(jié)構(gòu)和/或功能產(chǎn)生影響，從而影響對(duì)病原體的免疫反應(yīng)[14]。

3 展望

TLRs在作為識(shí)別、啟動(dòng)、激發(fā)病原體的重要免疫應(yīng)答調(diào)控分子，已成為羊抗病育種的研究熱點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)TLRs的研究主要集中于消化道和呼吸道疾病，對(duì)其他疾病研究還知之甚少。因此，TLRs抗病的分子機(jī)制是否與其他降低羊生產(chǎn)性能疾病有效，且在遺傳選育中作為抗病標(biāo)記分子還需要做一步研究。