黃曉麗，王慧博，竇乾明，霍堂斌

（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江流域漁業(yè)生態(tài)省野外科學(xué)觀測(cè)研究站，黑龍江 哈爾濱 150070）

由于我國(guó)人口增長(zhǎng)、工業(yè)和農(nóng)業(yè)的飛速發(fā)展，大量外源性氮的輸入，湖泊水體氮素過(guò)剩與氮素污染問(wèn)題日益突出[1,2]，水體富營(yíng)養(yǎng)化和區(qū)域環(huán)境惡化等已威脅到農(nóng)業(yè)灌溉用水，甚至居民飲用水的安全[3]。水體中過(guò)量的氮素可通過(guò)水生植物吸收或利用、根系微生物作用等方式加以去除[4,5]。沉水植物能吸收氮素，根系還能控制底泥中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的釋放，在緩解和消除湖泊氮素污染中發(fā)揮重要作用[4,6]?；謴?fù)和重建沉水植物群落是當(dāng)前國(guó)際上應(yīng)用較為廣泛的富營(yíng)養(yǎng)化水體原位生態(tài)修復(fù)技術(shù)[7]。因此，研究氮素對(duì)沉水植物的影響對(duì)于深入理解富營(yíng)養(yǎng)化水體氮素去除機(jī)理具有重要意義。

沉水植物可有效去除氨氮并吸收利用氨氮（NH4+-N）與硝酸鹽氮（NO3--N）合成自身細(xì)胞物質(zhì)[8,9]。對(duì)此已進(jìn)行了相關(guān)的研究，證實(shí)其去除效率隨氮負(fù)荷的升高而下降，且較高的氮素濃度對(duì)沉水植物有脅迫作用[10,11]。高濃度NH4+-N 均顯著影響沉水植物的生長(zhǎng)速率、光合作用速率，導(dǎo)致葉綠素含量下降，體內(nèi)活性氧或自由基超出抗氧化系統(tǒng)的清除能力，抗氧化酶活性異常，膜質(zhì)過(guò)氧化傷害[8,12,13]。

金魚(yú)藻（Ceratophyllum demersum L.）是一種全世界分布廣泛的沉水植物，也是淡水湖泊的常見(jiàn)優(yōu)勢(shì)種。金魚(yú)藻無(wú)根系，可通過(guò)改良的葉子附著在底泥上生長(zhǎng)，因其對(duì)水質(zhì)變化反應(yīng)敏感，且常出現(xiàn)在中等至高度富營(yíng)養(yǎng)化的湖泊中，被認(rèn)為是觸發(fā)淺水湖泊穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)換的先鋒種之一[9,14,15]。目前，關(guān)于NH4+-N 對(duì)金魚(yú)藻的生長(zhǎng)、水質(zhì)凈化效率、氮素吸收能力、生理指標(biāo)變化等影響已有研究[9,14-17]，但多為結(jié)合pH、磷、NO3--N 等復(fù)合污染條件下開(kāi)展，部分研究?jī)H為短期實(shí)驗(yàn)，且測(cè)定的生理指標(biāo)較為單一。關(guān)于NH4+-N 對(duì)金魚(yú)藻生長(zhǎng)、生理指標(biāo)及相應(yīng)氮素去除效率的綜合研究還鮮有報(bào)道。本研究采用靜態(tài)水培法，考察不同NH4+-N 濃度下金魚(yú)藻的生長(zhǎng)狀況，監(jiān)測(cè)水溶液中3 種無(wú)機(jī)氮濃度的梯度變化，分析培養(yǎng)前后金魚(yú)藻體內(nèi)的蛋白含量、葉綠素濃度、植物可溶性糖和脯氨酸含量的變化，旨在為富營(yíng)養(yǎng)化水體修復(fù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用金魚(yú)藻采自廣東省中山市小欖鎮(zhèn)綠森園藝培育池塘，在無(wú)污染物的溫室條件下不加氮的營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)一周以上。選取生長(zhǎng)良好、長(zhǎng)勢(shì)一致的水培植株，徑高（15.62±3.43）cm，用去離子水洗凈，然后移入實(shí)驗(yàn)玻璃缸開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，每個(gè)玻璃缸中金魚(yú)藻的初始生物量為35 g，用陶瓷環(huán)和海綿固定。

儀器與試劑有：TU-1901 型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)（北京普析通用公司）；PHS-25 型pH 計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司雷磁儀器廠）；GFL-70 烘箱（天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司）；FA2104B 電子天平（上海精密儀器儀表有限公司）。NH4+-N、NO3--N 和亞硝酸鹽氮（NO2--N）標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心。硫酸銨、霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液配制和三種無(wú)機(jī)氮分析實(shí)驗(yàn)所用的試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。蛋白含量、葉綠素濃度、植物可溶性糖和脯氨酸含量測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

實(shí)驗(yàn)容器為長(zhǎng)35 cm、寬15 cm、高25 cm 的玻璃缸。NH4+-N 濃度設(shè)置2.00 mg·L-1、4.00 mg·L-1、8.00 mg·L-1、16.00 mg·L-1和20.00 mg·L-15 個(gè)梯度（EG 1～EG 5）。在玻璃缸中加入10.0 L 含不同濃度NH4+-N 的霍格蘭氏培養(yǎng)液中，總磷濃度均為0.5 mg·L-1，移入經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)的金魚(yú)藻。實(shí)驗(yàn)期間水溫為（25±1.0）℃，各實(shí)驗(yàn)組營(yíng)養(yǎng)液初始pH 為7.25±0.37。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后每天測(cè)定培養(yǎng)液的pH，利用0.01 mol/L 的HCl 和NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 在7.00～7.50 范圍內(nèi)。利用專業(yè)的水草燈補(bǔ)光，白日光照強(qiáng)度為40～60 μmol·m-2·s-1，補(bǔ)光時(shí)間為12 h，晚上不照明。實(shí)驗(yàn)設(shè)置不加植物無(wú)NH4+-N 的溶液空白（BC），對(duì)比分析金魚(yú)藻對(duì)水溶液中NH4+-N 的去除情況；設(shè)置不加NH4+-N 只加植物的對(duì)照組（PC），對(duì)比金魚(yú)藻在有無(wú)NH4+-N 條件下的生長(zhǎng)狀況，每個(gè)處理組設(shè)3 個(gè)平行。每24 h 向各處理組補(bǔ)充自來(lái)水并混合均勻，保持培養(yǎng)液體積不變。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，分別在培養(yǎng)的第1 d、2 d、5 d、7 d、9 d、12 d、14 d、16 d、19 d 和21 d 上午8：00～9：00，采集水體樣品，測(cè)定水體中NH4+-N、NO2--N 和NO3--N 的濃度，比較金魚(yú)藻對(duì)NH4+-N 的去除效果。在培養(yǎng)第1 d 和第21 d，測(cè)定金魚(yú)藻的生物量，然后取一部分用去離子水沖洗干凈，吸干表面水分，剪碎后取樣測(cè)定蛋白含量、葉綠素濃度、植物可溶性糖和脯氨酸含量。所有分析指標(biāo)測(cè)定3 次平行取平均值。

根據(jù)《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法（第四版）》中規(guī)定的方法測(cè)定水體中三種無(wú)機(jī)氮的濃度。采用納氏試劑分光光度法測(cè)定NH4+-N 濃度，采用N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法測(cè)定NO2--N 濃度，采用分光光度法測(cè)定NO3--N 濃度，利用pH 計(jì)測(cè)定溶液的pH。

金魚(yú)藻生物量測(cè)定方法：培養(yǎng)前后，用去離子水沖洗干凈金魚(yú)藻，吸干水分后，稱取濕重（Wet weight，ww）。取部分樣品，在105℃下烘干，測(cè)定金魚(yú)藻的含水率，以計(jì)算干重（Dry weight，dw）。金魚(yú)藻中蛋白含量、葉綠素濃度、植物可溶性糖和脯氨酸含量均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定，蛋白含量為10%組織勻漿蛋白濃度，單位為gprot·L-1，葉綠素濃度單位為mg·g-1ww，植物可溶性糖和脯氨酸以μg·g-1ww為單位。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用Microsoft Excel 2016 軟件處理數(shù)據(jù)、作圖；采用SPSS 軟件（25.0 版，SPSS Inc.）對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)分別進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)和方差齊性分析。對(duì)金魚(yú)藻生物量、水中三種無(wú)機(jī)氮含量、金魚(yú)藻生理指標(biāo)的相關(guān)參數(shù)，以NH4+-N 濃度為控制因子進(jìn)行單因素方差分析，如果處理間有顯著差異，進(jìn)一步利用Turkey HSD 法進(jìn)行多重比較。利用獨(dú)立樣本t-檢驗(yàn)分析兩個(gè)不同處理組的差異顯著性。以P＜0.05 為差異顯著水平，P＜0.01 為差異極顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 金魚(yú)藻在不同濃度NH4+-N 溶液中的生長(zhǎng)情況

在21 d 的培養(yǎng)中，不含NH4+-N 的對(duì)照組金魚(yú)藻能夠正常生長(zhǎng)，但有部分葉片脫落；在不同NH4+-N 濃度溶液中金魚(yú)藻長(zhǎng)勢(shì)良好，生長(zhǎng)旺盛，無(wú)葉片枯黃或死亡現(xiàn)象。各濃度組中金魚(yú)藻的總生物量均有增加（圖1）。在2.00 mg·L-1濃度組中總生物量增長(zhǎng)最高，濕重增加23.86 g，干重增加0.45 g；其次為4.00 mg·L-1和8.00 mg·L-1濃度組，總生物量的增加量按干重計(jì)分別為0.27 g 和0.22 g，按濕重計(jì)分別為9.01 g 和16.28 g；最小值出現(xiàn)在20.00 mg·L-1濃度組，干重增長(zhǎng)量?jī)H為0.073 g，濕重增長(zhǎng)量為11.03 g。

培養(yǎng)21 d 時(shí)，不同濃度的NH4+-N 溶液培養(yǎng)下金魚(yú)藻的總生物量增長(zhǎng)量具有極顯著性差異（P＜0.0001）（圖1）。在2.00 mg·L-1NH4+-N 濃度下，金魚(yú)藻總生物量增長(zhǎng)量顯著高于對(duì)照組和8.00～20.00 mg·L-1NH4+-N 濃度組（P＜0.05）。在4.00mg·L-1NH4+-N 濃度下，金魚(yú)藻總生物量增長(zhǎng)量均顯著高于8.00～20.00 mg·L-1NH4+-N 濃度組（P＜0.05）。較高濃度NH4+-N（16～20 mg·L-1）抑制了金魚(yú)藻的生長(zhǎng)，總生物量增長(zhǎng)量均低于對(duì)照組，但差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 不同NH4+-N 濃度培養(yǎng)下金魚(yú)藻總生物量變化Fig.1 Total biomass of hornwort C.demersum exposed to different ammonia concentrations

2.2 金魚(yú)藻對(duì)水溶液中NH4+-N 的去除

在培養(yǎng)期間，溶液空白（BC）中NH4+-N 濃度變化不大（0.018～0.25 mg·L-1），可能為配置溶液過(guò)程中帶入的NH4+-N；對(duì)照組（EC）中NH4+-N 濃度略低于溶液空白（BC）且偶爾有波動(dòng)（0.0041～0.24 mg·L-1）?？傮w而言，不同處理組中的NH4+-N 濃度均隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而下降。經(jīng)過(guò)21 d 的培養(yǎng)（圖2），金魚(yú)藻對(duì)不同處理組（2.00～20 mg·L-1）中NH4+-N 的平均去除率分別為97.96%、99.30%、81.44%、57.46%和47.21%。隨著水溶液中NH4+-N 濃度的增加，金魚(yú)藻對(duì)NH4+-N 的平均去除率逐漸降低（圖2）。在2.00 mg·L-1、4.00 mg·L-1和8.00 mg·L-1NH4+-N 濃度下，金魚(yú)藻對(duì)NH4+-N 的平均去除率達(dá)到80%的時(shí)間分別為9 d、14 d 和21 d。在16.00 mg·L-1濃度下，金魚(yú)藻對(duì)NH4+-N 的去除率顯著降低（P＜0.05），當(dāng)溶液濃度達(dá)到20 mg·L-1時(shí)，去除率僅為47.21%。

圖2 金魚(yú)藻培養(yǎng)水溶液中NH4+-N 的去除效率Fig.2 Removal efficiency of NH4+-N in the water with hornwort C.demersum cultivation

2.3 水溶液中NO3--N 和NO2--N 濃度的變化

溶液空白（BC）和對(duì)照組（EC）中NO3--N 和NO2--N 濃度均呈波動(dòng)變化，數(shù)值范圍分別為0.19～0.72 mg·L-1和0.019～0.74 mg·L-1（圖3-a）。因在配制溶液過(guò)程中未加入NO3--N 和NO2--N，因此，溶液中測(cè)到的NO3--N 和NO2--N 可能為初始配置溶液時(shí)帶入，或是由NH4+-N 轉(zhuǎn)化而來(lái)。各處理組中NO3--N 濃度整體呈先升高后降低的趨勢(shì)，最高平均值出現(xiàn)在16 mg·L-1條件下第14 d，為1.88 mg·L-1。隨著NH4+-N 濃度的升高，水體中的NO3--N 累積的濃度也隨之增加。在培養(yǎng)2～14 d 后，高濃度NH4+-N（16～20 mg·L-1）組的NO3--N 濃度顯著高于溶液空白、對(duì)照組和低濃度組（2～4 mg·L-1）。

各處理組和對(duì)照組的NO2--N 濃度變化趨勢(shì)差異顯著，溶液空白（BC）和對(duì)照組（EC）中NO2--N 平均含量均低于0.5 mg·L-1（圖3-b）。在培養(yǎng)5 d 時(shí)，部分處理組中NO2--N 顯著升高，最大值達(dá)2.13 mg·L-1。在培養(yǎng)的21 d 內(nèi)，與NO3--N 相似，各處理組中NO2--N 濃度整體也呈先升高后降低的趨勢(shì)。不同濃度組累積NO2--N 最高濃度出現(xiàn)的時(shí)間無(wú)明顯規(guī)律。金魚(yú)藻能夠促進(jìn)水體NO3--N 和NO2--N 的去除，在16 d 時(shí)，各處理組中NO3--N 和NO2--N 均顯著下降。結(jié)合NH4+-N 去除情況分析，在同一處理組，NH4+-N 的去除量大于NO3--N 和NO2--N 之和，表明金魚(yú)藻能夠吸收利用NH4+-N 維持生長(zhǎng)。

圖3 金魚(yú)藻培養(yǎng)水溶液中NO3--N 和NO2--N 濃度的變化Fig.3 The changes in NO2--N and NO3--N concentrations in the culture water of hornwort C.demersum

2.4 金魚(yú)藻生理指標(biāo)的變化

培養(yǎng)21 d 時(shí)對(duì)照組（EC）和各處理組的葉綠素含量、植物可溶性糖含量和脯氨酸含量均顯著增加（P＜0.05）（表1）。與培養(yǎng)前相比，培養(yǎng)21 d 各處理組中金魚(yú)藻的10%組織勻漿蛋白濃度顯著增加，而對(duì)照組的蛋白濃度顯著降低。各處理組之間，隨著NH4+-N 濃度的增加，金魚(yú)藻的10%組織勻漿蛋白濃度、葉綠素a、總?cè)~綠素、植物可溶性糖和脯氨酸含量均逐漸降低，最大值均出現(xiàn)在2.00 mg·L-1濃度組（表1）。不同濃度NH4+-N 對(duì)金魚(yú)藻生理指標(biāo)的影響存在一定的差異。2.00 mg·L-1濃度組的各項(xiàng)指標(biāo)顯著高于對(duì)照組與其他濃度組（P＜0.05）。高NH4+-N濃度（16～20 mg·L-1）組的葉綠素a、總?cè)~綠素、植物可溶性糖和脯氨酸含量顯著低于其他濃度組（P＜0.05），兩者之間無(wú)顯著性差異。較高NH4+-N 濃度對(duì)葉綠素含量影響較大，大于8.00 mg·L-1時(shí)，三種葉綠素濃度均低于對(duì)照組。

表1 不同濃度NH4+-N 溶液中金魚(yú)藻生理指標(biāo)的變化Tab.1 Changes in physiological indices in culture water of hornwort C.demersum exposed to different NH4+-N concentrations

3 討論

金魚(yú)藻在0～20 mg·L-1的NH4+-N 溶液中能正常生長(zhǎng)，外觀無(wú)明顯變化。低濃度（＜4.00 mg·L-1）的NH4+-N 促進(jìn)了金魚(yú)藻的生長(zhǎng)，總生物量增長(zhǎng)量、可溶性蛋白、葉綠素a、植物可溶性糖和脯氨酸含量均高于無(wú)NH4+-N 的對(duì)照組，且變化趨勢(shì)相同。這表明在低濃度NH4+-N 脅迫下，金魚(yú)藻的生長(zhǎng)不受影響，能夠利用NH4+-N 合成自身細(xì)胞物質(zhì)[18,19]。這一結(jié)果與前人研究結(jié)論相似，在低濃度NH4+-N 培養(yǎng)下，金魚(yú)藻可溶性蛋白、總氮的含量增加[20]，促進(jìn)金魚(yú)藻片段萌發(fā)[15]。氮素是沉水植物生長(zhǎng)的必需營(yíng)養(yǎng)元素之一，是合成植物生理代謝活動(dòng)中蛋白質(zhì)、葉綠素、核酸等有機(jī)化合物的重要組分。對(duì)于有根的沉水植物，可以通過(guò)根和莖葉從水體和底泥中吸收養(yǎng)分[21]，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的同化作用取決于周圍水體和底泥中營(yíng)養(yǎng)元素的可利用性。金魚(yú)藻無(wú)根，營(yíng)養(yǎng)吸收主要依賴于葉片[22]。其葉生物量比率高，葉裂片呈細(xì)絲狀，表皮較薄或缺失等，均利于其與周圍水體進(jìn)行物質(zhì)交換[22,23]。本研究結(jié)果證實(shí)，金魚(yú)藻在無(wú)NH4+-N 的貧營(yíng)養(yǎng)條件下仍然可以累積生物量，這可能有賴于其較高的葉生物量比率獲取更多光照。

金魚(yú)藻吸收利用水體中的氮素，實(shí)現(xiàn)了對(duì)水體的凈化[9,23,24]。本實(shí)驗(yàn)中，低濃度組（＜4.00 mg·L-1）的NH4+-N 去除效率顯著高于其他組，結(jié)合植物生物量變化，表明金魚(yú)藻去除NH4+-N 的能力與植物的生長(zhǎng)狀況密切相關(guān)。在相同NH4+-N 濃度條件下，金魚(yú)藻總生物量增長(zhǎng)越大，相應(yīng)的NH4+-N 去除效率越高?？紤]到本研究未添加抑菌劑，實(shí)驗(yàn)體系內(nèi)可能存在微生物的作用，如氨氧化微生物將NH4+-N 轉(zhuǎn)化為NO3--N 和NO2--N。在同一處理組中，NH4+-N的最終去除量遠(yuǎn)大于NO3--N 和NO2--N 之和，結(jié)合溶液空白中兩者濃度的波動(dòng)變化，表明微生物對(duì)氮素去除貢獻(xiàn)率相對(duì)較小，金魚(yú)藻仍起主導(dǎo)作用。

本研究中，低濃度（2.00～4.00 mg·L-1）的NH4+-N溶液促進(jìn)了金魚(yú)藻的生長(zhǎng)，但隨著NH4+-N 實(shí)驗(yàn)濃度的升高，金魚(yú)藻的生長(zhǎng)量逐漸降低，生長(zhǎng)受到抑制。已有研究表明，NH4+-N 在10.00 mg·L-1濃度時(shí)（pH7）抑制了金魚(yú)藻生長(zhǎng)，生物量下降[25]。水體中的NH4+-N 有兩種形式，分別是非離子氨（NH3）和離子態(tài)氨（NH4+）。研究表明，NH3對(duì)金魚(yú)藻起主要脅迫作用[26]，0.41 mg·L-1NH3即可明顯抑制金魚(yú)藻的生長(zhǎng)，其耐受范圍大約為0.683～0.820 mg·L-1。高含量NH3會(huì)降低金魚(yú)藻生長(zhǎng)速率光合速率和SOD 活性，膜脂過(guò)氧化程度增加，且存在較強(qiáng)的劑量-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系[25,26]。水體中NH3的濃度主要受水體pH的影響，因此金魚(yú)藻對(duì)NH4+-N 的耐受力與水體pH相關(guān)。在本研究中，實(shí)驗(yàn)過(guò)程N(yùn)H4+-N 溶液pH 控制在7.25±0.37，各處理組NH3濃度均在可耐受范圍內(nèi)，這可能是金魚(yú)藻仍可正常生長(zhǎng)，在較高NH4+-N脅迫下（16.00～20.00 mg·L-1）生物量仍然有所增長(zhǎng)，且有一定氮素去除能力的原因。這一結(jié)果證實(shí)了在pH 適宜的條件下，金魚(yú)藻能夠長(zhǎng)期耐受超富營(yíng)養(yǎng)水平（20.00 mg·L-1）的氮脅迫。

綜上所述，本研究結(jié)果表明：

（1）低濃度（2.00～4.00 mg·L-1）NH4+-N 溶液能夠促進(jìn)金魚(yú)藻的生長(zhǎng)，總生物量增長(zhǎng)量、可溶性蛋白、葉綠素a、植物可溶性糖和脯氨酸含量均有所增加。較高NH4+-N 脅迫下（16.00～20.00 mg·L-1），金魚(yú)藻的生長(zhǎng)量和生理指標(biāo)顯著降低，生長(zhǎng)受到抑制。

（2）隨著水溶液中NH4+-N 濃度的提高（2.00～20.00 mg·L-1），金魚(yú)藻對(duì)NH4+-N 的平均去除率逐漸降低，不同處理下分別為97.96%、99.30%、81.44%、57.46%和47.21%。金魚(yú)藻去除NH4+-N 的能力與生長(zhǎng)狀況密切相關(guān)。