王婭麗 周利利 王娜 程紅梅

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

棉花（Gossypium hirsutumLinn.） 是錦葵科（Malvaceae）棉屬（Gossypium）植物的種籽纖維，原產(chǎn)于亞熱帶。棉花不僅是重要的纖維作物和油料作物，也是含高蛋白的糧食作物和重要的戰(zhàn)略物資，其主副產(chǎn)品都有很高的利用價(jià)值。棉屬有53 種，包括46 個(gè)二倍體（2n=2x=26，基因組為A-G 和K）和7 個(gè)四倍體（2n=4x=52，基因組為AD）［1］。目前種植的栽培棉大部分都是四倍體，如陸地棉和海島棉。倍性育種是指利用人工誘發(fā)植物染色體數(shù)目變異的材料選育新品種或新種質(zhì)的育種技術(shù)，包括染色體加倍的多倍體育種和染色體減半的單倍體育種，其最大的優(yōu)勢(shì)是可縮短育種年限［2］。

在倍性育種及其應(yīng)用過程中，需要對(duì)種子的純度進(jìn)行檢測(cè)，以了解混合群體的遺傳背景和遺傳效應(yīng)，因此倍性鑒定就顯得至關(guān)重要。傳統(tǒng)的細(xì)胞倍性鑒定方法有形態(tài)鑒定法、生理生化指標(biāo)鑒定法、生育狀況鑒定法、細(xì)胞學(xué)鑒定法和染色體計(jì)數(shù)法等［3］。這些方法已在多種植物中應(yīng)用，如西瓜（Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum.et Nakai）［4］、金魚草（Antirrhinum majusL.）［5］、白菜（Brassica rapa var.GlabraRegel）［6］、葡萄（Vitis viniferaL.）［7］等。棉花的倍性鑒定方法有多種，Mustafa 等［8］利用細(xì)胞學(xué)鑒定法分析了3 種二倍體棉花經(jīng)秋水仙素處理后染色體的數(shù)目。王坤波等通過熒光原位雜交（FISH）進(jìn)行了草棉［9］和海島棉［10］的核型分析。Hao 等［11］利用基因組原位雜交（GISH），對(duì)亞洲棉和比克氏棉雜交后代的根細(xì)胞染色體進(jìn)行核型分析，結(jié)果表明該雜交后代為異源四倍體。但這些傳統(tǒng)的檢測(cè)方法存在材料易受環(huán)境因素影響、實(shí)驗(yàn)操作困難等不足。

流式細(xì)胞分析是一種現(xiàn)代分析技術(shù)，其在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域被廣泛使用，具有“實(shí)驗(yàn)室的CT”之稱。雖然流式細(xì)胞術(shù)在植物研究中起步較晚，但由于它具有制樣簡(jiǎn)單用量少、操作高效快速且數(shù)據(jù)重復(fù)性高等優(yōu)勢(shì)，已逐漸發(fā)展為一種常用的植物基因組大?。?2-15］或植物倍性研究方法［16-17］。閆東玲等［18］應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了東北地區(qū)6 種主要越桔屬（Vaccinium vitisidaeaL.）植物的染色體倍性。田路明等［19］采用流式細(xì)胞儀鑒定了21 種梨（Pyrus spp）種質(zhì)資源的倍性。閆蕊等［20］采用流式細(xì)胞儀鑒定了97 份油茶（Camellia oleiferaAbel.）種質(zhì)資源的染色體倍性。閆佼［21］利用流式細(xì)胞術(shù)完成了183 份栽培香蕉和野生香蕉（Musa nanaLour.）以及雜交后代的倍性分析。目前棉花中利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞染色體倍性的方法較少，因此，本研究建立了一種利用流式細(xì)胞儀快速檢測(cè)棉花細(xì)胞倍性的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 珂字棉312 老葉和嫩葉均采自本實(shí)驗(yàn)室溫室。在盛花期取棉花的嫩葉和老葉，置于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，用預(yù)冷的清水洗去葉片表面的灰塵，然后用吸水紙擦干備用。

1.1.2 試劑及儀器設(shè)備 WPB 解離液（0.2 mol/L Tris-HCl，4 mmol/L MgCl2·6H2O，2 mmol/L EDTA·Na2·2H2O，86 mmol/L NaCl，10 mmol/L 焦亞硫酸鈉，1% PVP-10 和1%（V/V）Triton X-100）和LB01 解離液（15 mmol/L Tris，2 mmol/L Na2EDTA，0.5 mmol/L 四鹽酸精胺，80 mmol/L KCl，20 mmol/L NaCl，0.1%（V/V）Triton X-100 和15 mmol/L β 巰基乙醇），均購(gòu)自北京酷來搏科技有限公司。PI染色液購(gòu)自北京百靈威科技有限公司。LSRFortessa型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司）。

1.2 方法

去除主脈的棉花嫩葉和老葉各取兩份，分別放至預(yù)冷的一次性塑料培養(yǎng)皿中，其中一份加入3 mL預(yù)冷的WPB 解離液，另一份加入3 mL 預(yù)冷的LB01解離液，并使葉片完全浸沒在解離液中。用預(yù)冷的刀片垂直快速切碎葉片，靜置10 min 以獲得完整的細(xì)胞核。再用70 μm 濾膜將懸浮液過濾至2 mL 離心管中，隨后加入25 μL RNase A，輕柔顛倒混勻后靜置5 min。再加入50 μL 預(yù)冷的熒光染料PI，顛倒混勻后4℃避光染色5 min。最后將制備好的細(xì)胞核懸浮液移至上樣管，上機(jī)檢測(cè)，用BD FACSDiva 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

不同解離液解離不同棉花葉片的細(xì)胞核相對(duì)DNA 含量結(jié)果如圖1所示。LB01 解離棉花老葉制備的細(xì)胞核懸浮液經(jīng)染色后上機(jī)檢測(cè)，得到的碎片較多，雜峰面積較大而無法形成正常的主峰，且收集到的細(xì)胞核數(shù)目較少。與老葉相比，LB01 解離棉花嫩葉制備的細(xì)胞核懸浮液經(jīng)染色后上機(jī)檢測(cè)，雖然收集到的細(xì)胞核數(shù)目依然不多，但能看到大概的峰型，只是雜峰面積依然較大，仍不能形成明顯的主峰。WPB 解離棉花老葉和嫩葉制備的細(xì)胞核懸浮液經(jīng)染色后上機(jī)檢測(cè)，可以看到二者都可以得到單一的主峰，但WPB 解離棉花老葉得到的峰圖中存在一些背景碎片，而解離棉花嫩葉得到主峰離子團(tuán)清晰而集中，背景碎片少，峰圖效果較好，可以得到明顯的主峰；雜峰更少，且收集到的細(xì)胞核數(shù)目更多。以上結(jié)果表明，WPB 提取棉花細(xì)胞核的效果明顯優(yōu)于LB01，棉花嫩葉較老葉更宜作為倍性檢測(cè)的材料。

圖1 不同解離液解離不同棉花葉片的細(xì)胞核相對(duì)DNA 含量Fig.1 Nucleus relative DNA contents of cotton leaves dissociated by different dissociation solutions

3 討論

植物的核DNA 含量和倍性水平是植物學(xué)研究中重要的基礎(chǔ)研究指標(biāo)。流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用，提高了植物核DNA 含量檢測(cè)的準(zhǔn)確度和檢測(cè)速度。提取高質(zhì)量的細(xì)胞核用于倍性檢測(cè)至關(guān)重要，Peng 等［22］比較了刀切法和研磨法提取棉花細(xì)胞核的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，刀切法提取的細(xì)胞核質(zhì)量更高，因此我們選擇刀切法來提取棉花細(xì)胞核。根據(jù)其他植物材料已有的研究報(bào)道，植物取材需要考慮樣品易獲性、細(xì)胞核型的穩(wěn)定性和保存性等因素。如果材料選取不當(dāng)，會(huì)導(dǎo)致提取的細(xì)胞核顆粒較少，生成大量的雜質(zhì)，甚至形成變異系數(shù)較大的DNA 峰。本研究以棉花的老葉和嫩葉為材料制備樣品進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明棉花幼嫩葉片檢測(cè)效果好，完全可以作為倍性鑒定試材。

不同的檢測(cè)樣品有不同的特性，為了盡可能降低內(nèi)源物質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，需要明晰檢測(cè)樣本的特性［2］。棉花是多糖多酚植物，這些糖類和酚類物質(zhì)會(huì)影響提取的細(xì)胞核純度［22］。除物理破碎外，還需加入特定的解離液，使植物細(xì)胞破碎，分散細(xì)胞器，進(jìn)而解離出細(xì)胞核。此外，解離液還可以防止細(xì)胞間相互粘連，抵消次生代謝物帶來的消極影響，并維持一定的滲透壓，保證細(xì)胞核的完整性。如果解離液和待測(cè)材料不匹配，不僅不能保證細(xì)胞核形態(tài)的完整性，還可能促進(jìn)細(xì)胞核的破碎。因此篩選適宜提取細(xì)胞核的解離液，制備高純度的單顆粒細(xì)胞核懸浮液，對(duì)倍性檢測(cè)至關(guān)重要。本研究根據(jù)已有的文獻(xiàn)報(bào)道選取了WPB 解離液和LB01 解離液，二者最大的區(qū)別就是WPB 解離液里面含有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）［23］，在制備棉花細(xì)胞核懸液時(shí)加入體積濃度為1%的PVP 可去除酚類等物質(zhì)，減少干擾。結(jié)果表明，含有PVP 的解離液提取的細(xì)胞核成峰效果更好。

流式細(xì)胞儀測(cè)定染色體含量，是以大量染色體熒光峰的熒光強(qiáng)度值表示染色體的相對(duì)含量，但無法反應(yīng)更具體的染色體其他信息，如染色體形態(tài)特征、核型分類等。流式細(xì)胞儀克服了傳統(tǒng)鑒定方法操作難、時(shí)間長(zhǎng)等不足，可進(jìn)行快速、大量的染色體倍性分析，為后續(xù)棉花倍性育種提供技術(shù)支撐。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)比較了WPB 和LB0 解離液制備棉花嫩葉和老葉細(xì)胞核懸液流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)效果。結(jié)果表明WPB 解離液提取棉花嫩葉細(xì)胞核檢測(cè)效果更好。