李祥蕓，朱祥祥，徐濤

糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）是糖尿病微血管最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，也是致盲的一個(gè)重要因素，且發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)［1-2］。人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞（HRCECs）損傷是DR發(fā)生的基礎(chǔ)，目前認(rèn)為高血糖是引起DR的重要因素，持續(xù)的高血糖引起的視網(wǎng)膜組織微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是DR出現(xiàn)血管病理改變的始動(dòng)因素［3］。白花蛇舌草（HDW）是一種茜草科一年生草本植物，廣泛分布在亞熱帶地區(qū)，現(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、免疫增強(qiáng)功能、神經(jīng)保護(hù)等功能［4-5］。有研究顯示，白花蛇舌草可通過(guò)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)對(duì)治療突眼有一定的效果［6］。白花蛇舌草可影響HRCECs增殖及VEGF表達(dá)［7］，但白花蛇舌草是否可影響HRCECs周期、凋亡及氧化應(yīng)激尚未明確。本研究于2019年10月至2020年6月，體外培養(yǎng)HRCECs，旨在探討白花蛇舌草注射液（HDI）對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRCECs增殖、周期、凋亡及活性氧水平影響，并進(jìn)一步研究其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器白花蛇舌草注射液購(gòu)自吉林通化振國(guó)藥業(yè)有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素、二甲基亞砜均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；CCK8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本Dojindo公司；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、活性氧檢測(cè)試劑購(gòu)自南京凱基生物科技公司；流式細(xì)胞儀和Annexin V-FITC∕PI雙染法細(xì)胞凋亡試劑盒均購(gòu)自美國(guó)BD公司；ECL試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；BCA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司；增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、細(xì)胞周期蛋白A1（CyclinA1）和活化胱天蛋白酶-3（cleaved caspase-3）抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞（HRCECs）購(gòu)自美國(guó)ScienCell公司。常規(guī)復(fù)蘇HRCECs后用含10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，同時(shí)在培養(yǎng)液中添加青霉素（100 U∕mL）及鏈霉素（100 g∕L），培養(yǎng)條件為37℃恒溫、5%體積分?jǐn)?shù)二氧化碳的濕潤(rùn)培養(yǎng)箱。取第5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCK8法檢測(cè)白花蛇舌草對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRCECs增殖的影響取生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的第5代HRCECs，以5×104個(gè)∕毫升接種于96孔板，每孔200 μL，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行試驗(yàn)。對(duì)照組加入5.5 mmol∕L的葡萄糖；高滲對(duì)照組加19.5 mmol∕L的甘露醇及5.5 mmol∕L的葡萄糖；高糖對(duì)照組加入25 mmol∕L葡萄糖；白花蛇舌草組（HDI組）加入HDI（6.25 mL∕L、12.5 mL∕L、25 mL∕L、50 mL∕L）和25 mmol∕L的葡萄糖。HDI濃度的選擇根據(jù)參考文獻(xiàn)［7］和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行篩選。每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后，棄掉已作用的培養(yǎng)液，每孔中加100 μL的新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)在避光條件下加入CCK8 10 μL，避光孵育4 h，于450 nm波長(zhǎng)，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值（OD值）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)白花蛇舌草對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRCECs周期的影響收集按照“1.2”分組處理48 h的各組細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，完全培養(yǎng)基終止消化，4℃離心（1 000 r∕min）5 min，棄掉上清，PBS洗滌細(xì)胞3次，離心。預(yù)冷無(wú)水乙醇懸浮沉淀，制備成為單細(xì)胞懸液，4℃固定過(guò)夜。檢測(cè)前，PBS洗滌以除去固定液，加200 μL RNaseA（1 g∕L），于37℃水浴中30 min，然后加入1 mL碘化丙啶染色液，混勻，避光染色30 min，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)白花蛇舌草對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRCECs凋亡的影響收集按照“1.2”分組處理48 h的各組細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞，用195 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，然后添加5 μL的碘化丙啶及5 μL的Annexin-FITC，混勻后，于室溫條件下避光反應(yīng)10 min。1 h內(nèi)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率變化。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)白花蛇舌草對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRCECs活性氧水平的影響使用二甲基亞砜溶解2'，7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（H2DCFDA），配置成1 mmol∕L的儲(chǔ)備液，染色前使用PBS配置成濃度為10 μmol∕L的工作液。收集按照“1.2”分組處理48 h的各組細(xì)胞，吸棄培養(yǎng)液，預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞3次，滴加0.5 mL現(xiàn)配的H2DCFDA，37℃培養(yǎng)箱避光反應(yīng)45 min，吸除染色液，PBS洗滌細(xì)胞3次，加入0.5 mL PBS。于488 nm激發(fā)波長(zhǎng)，525 nm發(fā)射波長(zhǎng)，激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)各組細(xì)胞活性氧水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)白花蛇舌草對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRCECs PCNA、CyclinA1和cleaved caspase-3表達(dá)的影響收集按照“1.2”分組處理48 h的各組細(xì)胞，加適量含PMSF的細(xì)胞裂解液，于冰上反應(yīng)30 min，4℃離心機(jī)離心15 min，收集上清。BCA法測(cè)定蛋白樣品濃度。按照每孔30 μg上樣蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳（90 V恒壓）3 h，取出凝膠，通過(guò)電轉(zhuǎn)PVDF膜（100 mA電流50 min），轉(zhuǎn)好的膜至于5%脫脂奶粉中，室溫孵育2 h，洗膜。將膜放置于經(jīng)1∶500稀釋的PCNA、CyclinA1和cleaved caspase-3抗體反應(yīng)液中，室溫孵育2 h，加1∶1 000稀釋的HRP標(biāo)記的二抗，室溫反應(yīng)2 h，ECL顯色。采用Image J軟件分析PVDF膜各條帶灰度值。以灰度值目的蛋白∕灰度值GAPDH表示各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0軟件對(duì)所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用±s表示，三組及三組以上差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白花蛇舌草對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRCECs增殖的影響采用CCK8法檢測(cè)6.25 mL∕L、12.5 mL∕L、25 mL∕L和50 mL∕L的白花蛇舌草注射液對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRCECs增殖的影響，見(jiàn)表1所示，與對(duì)照組比較，高糖組細(xì)胞活性明顯升高（P＜0.05）。與高糖組比較，12.5 mL∕L、25 mL∕L和50 mL∕L的白花蛇舌草組細(xì)胞活性明顯降低（P＜0.05）。6.25 mL∕L白花蛇舌草組細(xì)胞活性與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。選擇50 mL∕L的白花蛇舌草作為研究對(duì)象。

表1 白花蛇舌草對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRCECs增殖的影響

表1 白花蛇舌草對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRCECs增殖的影響

注：HDI為白花蛇舌草注射液，OD為吸光度。①與對(duì)照組比較，P＜0.05。②與高糖組比較，P＜0.05。

組別對(duì)照組高糖組高滲對(duì)照組HDI組（6.25mL∕L）HDI組（12.5mL∕L）HDI組（25mL∕L）HDI組（50mL∕L）F值P值重復(fù)次數(shù)3 3 3 3 3 3 3 OD值0.684±0.072 1.116±0.105①0.889±0.092 1.101±0.087 0.847±0.076②0.639±0.058②0.421±0.042②31.01＜0.001

2.2 白花蛇舌草對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRCECs周期的影響與對(duì)照組比較，高糖組G0∕G期細(xì)胞百分比明顯升高，G2∕M期和S期細(xì)胞百分比明顯降低（P＜0.05）。與高糖組比較，HDI組G0∕G期細(xì)胞百分比明顯降低，G2∕M期和S期細(xì)胞百分比明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 白花蛇舌草對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRCECs周期的影響

表2 白花蛇舌草對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRCECs周期的影響

注：HDI為白花蛇舌草注射液。①與對(duì)照組比較，P＜0.05。②與高糖組比較，P＜0.05。

組別對(duì)照組高糖組高滲對(duì)照組HDI組F值P值重復(fù)次數(shù)3 3 3 3 G0∕G期54.72±4.31 60.02±5.01①56.59±4.88 32.31±3.42②24.03＜0.001 S期30.01±3.01 26.22±2.56①28.87±2.43 49.79±4.63②32.76＜0.001 G2∕M期15.27±1.11 13.76±1.23①14.54±0.96 17.90±1.54②6.42 0.016

2.3 白花蛇舌草對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRCECs凋亡的影響對(duì)照組、高糖組、高滲對(duì)照組、HDI組的細(xì)胞凋亡率分別為（3.32±0.47）%、（17.11±1.01）%、（8.79±0.89）%、（9.72±0.73）%，四組凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=150.33，P＜0.001）。與對(duì)照組比較，高糖組細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）。與高糖組比較，HDI組細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)白花蛇舌草對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRCECs凋亡的影響

2.4 白花蛇舌草對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRCECs活性氧水平的影響對(duì)照組、高糖組、高滲對(duì)照組、HDI組的熒 光 強(qiáng) 度 分 別 為42.14±3.56、96.18±5.22、75.59±5.13、67.75±4.83，四組熒光強(qiáng)度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=66.86，P＜0.001）。與對(duì)照組比較，高糖組活性氧水平明顯升高（P＜0.05），與高糖組比較，HDI組活性氧水平明顯降低（P＜0.05）。

2.5 白花蛇舌草對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRCECs PCNA、CyclinA1和cleaved caspase-3表達(dá)的影響與對(duì)照組比較，高糖組PCNA、CyclinA1和cleaved caspase-3表達(dá)均明顯升高（P＜0.05），與高糖組比較，HDI組PCNA、CyclinA1和cleaved caspase-3表達(dá)均明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖2，表3。

表3 PCNA、CyclinA1和cleaved caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量∕xˉ±s

圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)PCNA、CyclinA1和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)

3 討論

DR嚴(yán)重危害病人的視功能，其特點(diǎn)是視網(wǎng)膜新生血管形成，目前其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確［7］。白花蛇舌草是一種茜草科一年生草本植物，目前對(duì)DR HRCECs生長(zhǎng)的影響尚未明確。本研究中CCK8結(jié)果顯示，高糖可促進(jìn)HRCECs增殖，12.5 mL∕L、25 mL∕L和50 mL∕L的 白 花 蛇 舌 草 對(duì) 高 糖 環(huán) 境 下HRCECs增殖具有抑制作用。這與既往研究結(jié)果一致［8］。由于50 mL∕L的白花蛇舌草對(duì)HRCECs增殖抑制更明顯，因此選擇作為研究對(duì)象。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，白花蛇舌草組S期細(xì)胞的數(shù)量明顯增加，即白花蛇舌草可引起HRCECs發(fā)生S期阻滯。細(xì)胞的各個(gè)周期所調(diào)控的蛋白不同，在S期至G2∕M期過(guò)程中，CyclinA1發(fā)揮作用，其參與DNA合成、復(fù)制及細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂，是S期至G2∕M期過(guò)程的一個(gè)必須因子［9-10］。PCNA為細(xì)胞核內(nèi)多聚酶輔助蛋白，其表達(dá)水平與細(xì)胞增殖存在正相關(guān)關(guān)系［11］。在細(xì)胞增殖過(guò)程中PCNA表達(dá)具有周期性，G0期PCNA基本上不表達(dá)，在G1晚期至S中期PCNA表達(dá)達(dá)到峰值，而在G2∕M期PCNA表達(dá)迅速下降，能準(zhǔn)確地反映出細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)及生長(zhǎng)速度［12］。多項(xiàng)研究表明，高糖可影響PCNA和CyclinA1表達(dá)，而抑制其表達(dá)可減弱HRCECs增殖［13］。本研究結(jié)果顯示，白花蛇舌草組S期PCNA及CyclinA1表達(dá)均明顯降低。提示白花蛇舌草對(duì)HRCECs增殖調(diào)控與調(diào)節(jié)PCNA及CyclinA1表達(dá)有關(guān)。

氧化應(yīng)激是指機(jī)體內(nèi)活性氧、活性氮類(lèi)自由基（RNS）等高活性分子產(chǎn)生過(guò)多，消除降低，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)酶及蛋白變性，生物膜脂質(zhì)的過(guò)氧化，DNA損害，引起細(xì)胞發(fā)生凋亡或死亡，進(jìn)而引起組織受損［14-15］。異常代謝可引起血糖升高，而活性氧累積所造成的氧化應(yīng)激可損害視網(wǎng)膜血管，最終導(dǎo)致DR的發(fā)生［16-17］。眾所周知，氧化應(yīng)激激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)是其引起細(xì)胞凋亡的重要途徑［18］。caspase-3是caspase家族成員關(guān)鍵酶，也是執(zhí)行凋亡的最主要因子，其激活可使凋亡不可逆［19］。多項(xiàng)研究表明，高糖可引起細(xì)胞的氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及caspase-3的表達(dá)，而抑制氧化應(yīng)激及凋亡對(duì)細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用［20-21］。白花蛇舌草是否可影響高糖誘導(dǎo)的HRCECs凋亡及氧化應(yīng)激還未明確。本研究結(jié)果顯示，高糖可引起HRCECs凋亡增加，活性氧水平增加，cleaved caspase-3表達(dá)增加，而白花蛇舌草可減弱高糖對(duì)HRCECs凋亡、活性氧水平及cleaved caspase-3表達(dá)影響。提示白花蛇舌草可通過(guò)降低HRCECs凋亡及活性氧水平而減弱高糖引起的細(xì)胞損傷。

綜上所述，白花蛇舌草可減弱高糖對(duì)細(xì)胞增殖、周期、凋亡、活性氧水平及PCNA、CyclinA1和cleaved caspase-3表達(dá)影響。提示白花蛇舌草對(duì)DR具有潛在保護(hù)和治療作用，但還需更多研究證實(shí)。