張瑩瑩，張科，宋崟，馬紅英，邵佳，張弋

“川芎-當(dāng)歸”藥對出自宋代《太平惠民和劑局方》的“芎歸湯”，現(xiàn)已開發(fā)為舒腦欣滴丸，臨床用于血虛血瘀引起的偏頭痛，癥見頭痛、頭暈、視物昏花、健忘、失眠等［1］。當(dāng)歸性溫味甘辛，歸心、肝、脾經(jīng)，善補血活血，調(diào)經(jīng)止痛，潤腸通便，并能散寒，凡血虛血瘀有寒癥均宜［2］，川芎性溫味辛，歸肝、膽、心包經(jīng)，善活血行氣，祛風(fēng)止痛，治血瘀氣滯諸痛，兼寒者最宜［3］。川芎-當(dāng)歸藥對在中醫(yī)方劑中應(yīng)用廣泛，王歡等［4］利用中醫(yī)方劑數(shù)據(jù)庫對當(dāng)歸-川芎藥對不同配比的中醫(yī)應(yīng)用數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示含有川芎、當(dāng)歸的方劑共1 242首，對多種疾病有一定的治療作用?，F(xiàn)代研究表明，川芎-當(dāng)歸藥對具有擴張血管，尤其是冠狀血管，增加冠脈血量，改善心肌缺血和抑制血小板凝聚等藥理作用。但目前還沒有從分子層面上對該藥對的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制進(jìn)行研究的論述和報道。近年來，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對中藥復(fù)方進(jìn)行“藥物-成分-靶點-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)和物質(zhì)基礎(chǔ)、靶點、通路分析的研究成為熱點。該方法通過構(gòu)建多層次網(wǎng)絡(luò)，從基因、分子和細(xì)胞層面闡釋藥物的作用機制［5］。本研究擬通過該方法探究“川芎-當(dāng)歸”藥對的主要活性成分、靶點和藥理作用機制，本研究起止時間為2020年9—12月。

1 方法

1.1 成分和用靶點的收集與篩選打開TCMSP 2.3數(shù)據(jù)庫（https：∕∕tcmspw.com∕tcmsp.php），以“川芎”“當(dāng)歸”為檢索詞，檢索藥材的成分和靶點?？诜锢枚龋∣B）是藥物研發(fā)過程中關(guān)鍵藥動學(xué)參數(shù)，它表示藥物經(jīng)血管外途徑給藥后，經(jīng)肝臟進(jìn)入體循環(huán)血液藥量中的相對量，其與藥物療效密切相關(guān)。OB值與類藥性（DL）正相關(guān)，OB值高的活性成分其成為藥物的可能性越高［6-8］。目前成分常規(guī)篩選條件按照口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18［9］進(jìn)行篩選。但是由于篩選條件的限制，不能囊括所有的化學(xué)成分，對于川芎和當(dāng)歸藥材中兩個主要化學(xué)成分阿魏酸和川芎嗪，由于DL值很低被篩選排除，考慮到這兩個成分是藥材中的主要成分，且很多研究已經(jīng)證實有明顯的藥理作用。因此，將其作為候選成分進(jìn)行分析。

1.2 疾病數(shù)據(jù)的收集和靶點對應(yīng)基因的獲取根據(jù)“1.1”節(jié)所得靶點，收集TCMSP 2.3數(shù)據(jù)庫中靶點對應(yīng)的疾病，然后使用Uniprot獲取靶點相應(yīng)基因。具體方法：打開Uniprot網(wǎng)站（https：∕∕www.uniprot.org∕），選擇UniprotKB數(shù)據(jù)庫，以“reviewed：yes AND organism：Homo sapiens（Human）”檢索式進(jìn)行檢索，共獲得20 394條人的靶蛋白及對應(yīng)基因的數(shù)據(jù)，以Excel格式導(dǎo)出，再使用“VLOOKUP”函數(shù)匹配所獲得疾病靶點對應(yīng)的基因信息［10］。

1.3 “藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將“川芎-當(dāng)歸”的藥物、成分、靶點和疾病數(shù)據(jù)處理后導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件中，構(gòu)建“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)，然后使用軟件的NetworkAnalyzer進(jìn)行分析。在網(wǎng)絡(luò)中，度值（Degree）表示某一節(jié)點與其他節(jié)點連接邊的數(shù)量［11］；中介中心度（betweenness centrality，BC）表示一個節(jié)點擔(dān)任其他兩個結(jié)點之間最短路的橋梁的次數(shù)。BC值越大，表示節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)中的樞紐程度越重要［12］。目前，網(wǎng)絡(luò)分析的主要方法是選擇節(jié)點Degree值及BC值高的作為網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點［11］。本研究也采用該分析方法，探究“川芎-當(dāng)歸”的主要作用靶點、疾病及作用機制。

1.4 GO富集分析和KEGG通路富集分析將篩選得到的川芎-當(dāng)歸藥對靶點基因進(jìn)行基因功能注釋分析和功能富集分析，探究特定基因或蛋白的生物學(xué)意義［13］。具體方法，打開DAVID 6.8（https：∕∕david.ncifcrf.gov∕tools.jsp）數(shù) 據(jù) 庫，選 擇“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”選項，選擇“Homo Sapiens”選項，提交靶點基因列表，進(jìn)行分析。經(jīng)數(shù)據(jù)庫處理后，導(dǎo)出數(shù)據(jù)，設(shè)定閾值P＜0.05，對生物學(xué)過程和信號通路進(jìn)行篩選，并進(jìn)行繪圖［14］。

2 結(jié)果

2.1 川芎-當(dāng)歸藥對化學(xué)成分的確定在TCMSP 2.3數(shù)據(jù)庫中檢索到川芎-當(dāng)歸化學(xué)成分314個，其中當(dāng)歸125個，川芎189個。按照OB≥30%和DL≥0.18和結(jié)合現(xiàn)有研究結(jié)果進(jìn)行自選的條件篩選，共得到11個化學(xué)成分，主要包括：黃酮類、有機酸類、豆甾醇、β-谷甾醇、阿魏酸和川芎嗪等成分，見表1。

表1 川芎-當(dāng)歸中9個化學(xué)成分信息

2.2 “藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)分析“川芎-當(dāng)歸”藥對的“藥物-成分-靶標(biāo)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖含有274個節(jié)點［2個藥物，10個成分，其中洋川芎醌（senkyunone）沒有對應(yīng)靶點，71個靶標(biāo)，191種疾?。莺?43條邊線，選擇Degree和BC排名靠前作為關(guān)鍵節(jié)點。網(wǎng)絡(luò)中Degree值≥10的成分、靶標(biāo)和Degree值≥5的疾病節(jié)點見表2。結(jié)果顯示：（1）Degree值＞10的成分有4個，其中DG-1（β-谷甾醇）、DG-2（豆甾醇）、CX-2（楊梅黃酮）、DG-3（阿魏酸）Degree分別為39、32、26、15，遠(yuǎn)高于其他化合物節(jié)點，為網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵節(jié)點；（2）Degree≥10的關(guān)鍵靶標(biāo)12個，包括：環(huán)氧化酶2（PTGS2）、過氧化物酶體增生激活受體γ（PPARG）、雌激素受體（ESR1）、β2腎上腺素能受體（ADRB2）、周期蛋白依賴激酶2（CDK2）、熱休克蛋白90（HSP90）、促分裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）、膽堿能受體2（CHRM2）、5羥色胺受體2A（HTR2A）、凝血因子Ⅱ受體（F2R）、鹽皮質(zhì)激素受體（NR3C2）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（NOS3）；（3）Degree值≥5的疾病11種，包括：疼痛、心血管疾病、乳腺癌、阿爾茨海默病、炎癥、癌癥、焦慮癥、精神分裂癥、前列腺癌、實體腫瘤、腦損傷。

表2 “藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)節(jié)點及其參數(shù)

2.3 GO富集分析結(jié)果DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫得到GO功能富集分析的結(jié)果：GO條目237個（P＜0.05），其中生物過程（biological process，BP）178個，分子功能（molecular function，MF）26個，細(xì)胞組成（cellular component，CC）33個，具體信息見圖1，表3。

表3 川芎-當(dāng)歸藥對相應(yīng)基因GO富集分析結(jié)果（閾值P＜0.05，BP、MF、CC的P值前5注釋）

圖1 川芎-當(dāng)歸靶標(biāo)的GO富集分析（P＜0.05，BP、MF、CC的P值前5）

2.4 KEGG通路富集分析結(jié)果KEGG通路富集分析結(jié)果得到66條（P＜0.05）信號通路。主要神經(jīng)活性配體-受體相互作用、鈣離子信號通道、癌癥通路、5-羥色胺能突觸、大腸癌、雌激素信號通路、心肌細(xì)胞的腎上腺素能信號、甲狀腺激素信號通路、cAMP信號通路、血管內(nèi)皮生長因子信號通路等；各個信號通路基因富集結(jié)果見表4，其中神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路涉及的30個基因，主要包括：GABRB3、CHRM2、GABRA2、CHRM3、GABRA1、CHRM1、CHRNA2、GABRA5、CHRM4、CHRNA7、F2R、ADRB1、ADRB2、HTR2A、OPRM1、ADRA1B、NR3C1、ADRA1A、ADRA2B、ADRA2A、DRD1。

表4 川芎-當(dāng)歸相應(yīng)基因京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析結(jié)果（閾值P＜0.05）

3 討論

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對川芎-當(dāng)歸藥對的作用機制進(jìn)行研究。結(jié)果顯示：從川芎-當(dāng)歸藥對314個已知化學(xué)成分中，按照OB≥30%和DL≥0.18以及結(jié)合現(xiàn)有研究結(jié)果進(jìn)行自選的條件篩選，共得到12個化學(xué)成分，主要包括：β-谷甾醇、豆甾醇、阿魏酸、谷甾醇、楊梅黃酮、亞油酸乙酯、川芎萘呋內(nèi)酯、

洋川芎醌、川芎哚、葉酸、川芎嗪。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析表明，“川芎-當(dāng)歸”藥對中Degree值前四的活性成分為：β-谷甾醇、豆甾醇、楊梅黃酮、阿魏酸。研究顯示，在體外β-谷甾醇可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖［15］。李慶勇等［16］通過對豆甾醇抗腫瘤活性以及活性氧（ROS）的研究，發(fā)現(xiàn)豆甾醇通過ROS的氧化，鈣離子濃度上升的級聯(lián)反應(yīng)和阻滯細(xì)胞周期的S期和G2∕M期從而誘導(dǎo)人肝癌細(xì)SMMC-7721凋亡。邢樹剛等［17］研究發(fā)現(xiàn)：楊梅黃酮可以降低小鼠腦膠質(zhì)瘤中GL261細(xì)胞的MMP-2和MMP-9mRNA的表達(dá)水平誘導(dǎo)其凋亡，起到抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的作用。在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究過程中，必要時可以將一些不符合常規(guī)篩選條件的，但已經(jīng)證實有明顯的藥理作用成分作為候選成分進(jìn)行分析。同時，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究也不能兼顧中藥方劑配伍后成分的變化和中藥成分在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，使得研究預(yù)測的結(jié)果存在一定的局限性。因此，在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究過程中，對于成分篩選的方法還是有待于進(jìn)一步驗證和改良的。

網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析表明主要靶點包括：環(huán)氧化酶2、過氧化物酶體增生激活受體γ、雌激素受體、β2腎上腺素能受體、周期蛋白依賴激酶2、熱休克蛋白90、促分裂原活化蛋白激酶14、膽堿能受體2、5羥色胺受體2A、凝血因子Ⅱ受體、鹽皮質(zhì)激素受體、內(nèi)皮型一氧化氮合酶等關(guān)鍵靶點，發(fā)揮對多種疾病的治療作用。例如與疼痛、炎癥、腫瘤相關(guān)的靶點環(huán)氧化酶2（PTGS2）、過氧化物酶體增生激活受體γ（PPARG）、雌激素受體（ESR1）的Degree值分別為39、22、19，遠(yuǎn)高于其他靶點節(jié)點，推測“川芎-當(dāng)歸”藥對可能通過作用這幾個關(guān)鍵靶標(biāo)對各種疼痛、炎癥和腫瘤等發(fā)揮作用。環(huán)氧化酶2是前列腺素E2合成的主要限速酶，主要在細(xì)胞因子、生長因子等促炎癥因素下發(fā)揮作用。前列腺素E2與機體的發(fā)熱、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞生長及分化等生理活動密切相關(guān)。近年研究發(fā)現(xiàn)環(huán)氧化酶2與多種類型的腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān)［18］。研究表明，PPARG激動劑通過作用于PPARG受體保護(hù)神經(jīng)元，抑制活化的小膠質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，最終調(diào)節(jié)和控制多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥變性疾病，例如阿爾茨海默病、帕金森病以及多發(fā)性硬化［19］。研究表明，雌激素可以通過激活雌激素受體，減少氧化應(yīng)激導(dǎo)致的腦缺血及再灌注期間血管功能障礙，從而改善微血管功能，在體循環(huán)中發(fā)揮舒張血管和保護(hù)神經(jīng)的作用［20］。

KEGG通路富集結(jié)果顯示，其中一些基因富集在神經(jīng)活性配體-受體相互作用、鈣離子信號通道、5-羥色胺能突觸、雌激素信號通路、心肌細(xì)胞的腎上腺素能信號、甲狀腺激素信號通路、cAMP信號通路、血管內(nèi)皮生長因子信號通路等，其中一些信號通路與神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)。結(jié)合“藥物-成分-靶標(biāo)-疾病”網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果，阿爾茨海默病、焦慮癥、精神分裂癥和腦損傷為該藥對網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵疾病節(jié)點，因此推測大腦可能是“川芎-當(dāng)歸”藥對作用的靶器官，同時表明“川芎-當(dāng)歸”藥對通過調(diào)控上述信號通路發(fā)揮腦血管疾病的治療作用。動物試驗研究證實：芎歸湯提取液可以明顯改善東莨菪堿致癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，縮短小鼠水迷宮潛伏期，延長小鼠跳臺潛伏期和減少跳臺錯誤次數(shù)［21］；川芎和當(dāng)歸通過水蒸氣蒸餾提取的揮發(fā)油，均可改善化學(xué)性腦缺氧小鼠的能量代謝和中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的功能，起到保護(hù)缺氧組織和維持小鼠正常的能量活動的作用［22］。另外還有一些基因富集在腫瘤通路、大腸癌通路、血管內(nèi)皮生長因子信號通路等與腫瘤直接相關(guān)的信號通路上，這也提示“川芎-當(dāng)歸”藥對可能會在多種腫瘤的治療方面發(fā)揮作用，值得進(jìn)一步研究。