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蘆丁通過抑制NF-κB信號通路緩解大鼠結(jié)腸炎的研究

2023-01-05 06:39郭建軍凌應(yīng)飛李強
安徽醫(yī)藥 2023年1期
關(guān)鍵詞:蘆丁結(jié)腸炎結(jié)腸

郭建軍,凌應(yīng)飛,李強

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是以直腸和結(jié)腸的淺表性、非特異性炎癥病變?yōu)橹鞯哪c道疾病,其患大腸癌的發(fā)生率明顯高于一般人群。近年來,UC的發(fā)病率呈逐漸上升的趨勢,已成為醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點[1]。目前潰瘍性結(jié)腸炎的病因和發(fā)病機制尚未完全闡明,大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為是免疫、遺傳、環(huán)境等多方面因素作用的結(jié)果。由于該病病程較長,易反復(fù)發(fā)作,臨床上對該病的診治較為困難[2]。當(dāng)前西醫(yī)藥用于治療UC的方法包括氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素、抗生素等,這些藥物雖有一定療效,但長期大量服用會導(dǎo)致副作用,停藥后易復(fù)發(fā)等問題[3]。有學(xué)者的研究結(jié)果表明,核因子κB(NFkB)信號通路的激活往往伴有腫瘤或炎癥的發(fā)生,并起著至關(guān)重要的作用[4-5]。因此,抑制NF-κB信號通路,有利于UC的緩解。

蘆?。≧utin)是一種從蘆丁中提取得到的黃酮類化合物,具有多種生物活性,例如抗氧化,抗炎,抗糖尿病,抗病毒,心血管保護等[6-8]。有研究報道,蘆丁通過抑制病人腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、C反應(yīng)蛋白、腦鈉尿肽等,進而起著保護心臟的作用[9]。此外,楊巧麗等[10]發(fā)現(xiàn)蘆丁對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎具有抗炎和改善腎臟功能的作用。Power等[11]的研究顯示蘆丁可減輕結(jié)腸炎的程度和組織損傷。褚旭芳等[12]發(fā)現(xiàn)蘆丁可抑制腸固有層Th細(xì)胞的應(yīng)答來緩解實驗性結(jié)腸炎的病變。但蘆丁在緩解UC中的研究較少,為此,本研究在2020年4—5月間探討了蘆丁對右旋葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的UC大鼠的治療作用,為蘆丁治療UC提供參考。且本研究符合一般動物實驗倫理學(xué)原則。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑SD雄性大鼠購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司;DSS、蘆?。兌葹?9%)、水合氯醛均購自Sigma-Aldrich(美國);小鼠TNFα ELISA試劑盒購自Biolegend公司;小鼠白細(xì)胞介素-6(IL-6)ELISA試劑盒購自Thermo Fisher Scientific公司;髓過氧化物酶(MPO)試劑盒、蛋白濃度測定試劑盒(BCA試劑盒)購自Thermo Fisher Scientific公司;核因子κB p65(NF-κB p65)、人磷酸化IκB激酶-α(p-IκBα)、IκB激酶-α(IκBα)、β-肌 動 蛋 白(β-actin)抗 體 購 自Cell Signaling Technology。

1.2 動物分組和模型建立50只雄性大鼠隨機數(shù)字表法分為五組,每組10只。分別為對照組,模型組,蘆丁組(20、40、80 mg∕kg)。大鼠用10%水合氯醛(300 mg∕kg)腹腔注射麻醉。起效后,以硅膠管輕插入其肛門處約8 cm,再向腸內(nèi)緩慢推入3%DSS溶液0.25 mL。提尾倒置大鼠30 s,確保造模液在腸腔彌散分布。造模24 h后,蘆丁組大鼠給予腹腔注射低中高濃度的蘆丁。連續(xù)給藥5 d后,脫頸椎法處死大鼠,收集大鼠結(jié)腸組織。

1.3 DAI檢測指標(biāo)在整個實驗期間,每日觀察并記錄各組大鼠的一般情況,包括精神狀況、活動、大鼠的糞便性狀及便血情況,記錄各組大鼠的生存率,并計算疾病活動指數(shù)(disease activity index,DAI)。DAI=(體質(zhì)量下降得分+糞便性狀得分+便血情況得分)∕3。評分參照DAI評分結(jié)果進行。見表1。

表1 潰瘍性結(jié)腸炎大鼠DAI評分檢測結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)值

1.4 大鼠結(jié)腸組織MPO活性的測定收集各組大鼠結(jié)腸組織后,用生理鹽水對結(jié)腸組織進行漂洗,以達到摒除其腸組織表面糞便、血液等黏附物。稱取約50 mg結(jié)腸組織,加入勻漿介質(zhì)制備成5%組織勻漿。按照MPO試劑盒說明書測定MPO活性。

1.5 血清TNF-α和IL-6水平測定稱取20 mg各組大鼠結(jié)腸組織,用電動混勻器把結(jié)腸組織磨成勻漿,3 000g離心5 min,取上清液。按照ELISA試劑盒說明書檢測各組大鼠結(jié)腸組織勻漿上清液中TNF-α、IL-6的釋放水平。

1.6 免疫印跡分析取各組結(jié)腸組織20 mg,加入200 μL組織蛋白裂解液,冰浴充分研磨后裂解20 min,在4℃、12 000g轉(zhuǎn)速下離心10 min,取上清液,用BCA測定總蛋白濃度。30 μg上樣,以10%的SDS凝膠分離,完成后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。再用5%脫脂牛奶封閉1 h,加入一抗p65、p-IκBα、IκBα,4℃下孵育過夜,隨后加入二抗,室溫下孵育控制在1 h左右。然后用Supersignal West Pico系統(tǒng)顯影。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計,計量資料以xˉ±s表示,采用one way ANOVA對多組間數(shù)據(jù)進行性比較檢驗,行LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蘆丁對DSS誘導(dǎo)DAI評分的影響從造模開始后即對各組大鼠每日進行固定時間評估其DAI評分,結(jié)果見表2。模型組大鼠造模后出現(xiàn)排便次數(shù)增加,軟便、水樣便、大便隱血、血便等情況。蘆丁組大鼠情況有一定的改善。第5天時,模型組DAI評分為(2.98±0.57)分,顯著高于對照組的0分(t=16.53,P<0.001);而蘆丁組(20、40、80 mg∕kg)的DAI評分[(1.97±0.46)、(1.38±0.38)、(1.09±0.39)分]顯著低于模型組(2.98±0.57)分(t=4.36,7.39,8.65,均P<0.001),并呈劑量依賴性。

2.2 蘆丁對DSS誘導(dǎo)的MPO活性的影響與對照組(0.52±0.09)U∕g相比,模型組大鼠結(jié)腸組織中MPO活性(1.26±0.07)U∕g明顯升高(t=20.52,P<0.001);而蘆丁組(20、40、80 mg∕kg)MPO活性[(0.98±0.06)、(0.75±0.08)、(0.74±0.04)U∕g]顯 著 低 于 模 型 組(1.26±0.07)U∕g(t=9.60,15.17,20.40,均P<0.001),且高劑量組(80 mg∕kg)的MPO活性最低。結(jié)果提示,蘆丁可以有效降低DSS誘導(dǎo)的大鼠UC中MPO活性的異常升高。

2.3 蘆丁對DSS誘導(dǎo)的TNF-α和IL-6的影響采用ELISA法檢測各組大鼠結(jié)腸組織中IL-6、TNF-α的水平。模型組中TNF-α水平[(5.19±0.93)μg∕L]顯著高于對照組(0.36±0.07)μg∕L(t=16.38,P<0.001);蘆丁組(20、40、80 mg∕kg)的TNF-α水平(4.26±0.87)、(3.75±0.72)、(3.16±0.52)μg∕L均顯著低于模型組(5.19±0.93)μg∕L(t=2.31,3.87,6.03,均P<0.05)。同樣地,模型組中IL-6水平(6.54±0.85)μg∕L顯著高于對照組(0.18±0.03)μg∕L(t=23.65,P<0.001);蘆丁組(20、40、80 mg∕kg)的IL-6水平(5.12±0.93)、(4.28±0.72)、(3.72±0.65)μg∕L均顯著低于模型組(6.54±0.85)μg∕L(t=3.56,6.41,8.33,均P<0.05)。結(jié)果表明蘆丁可以抑制UC大鼠局部結(jié)腸組織TNF-α和IL-6的水平。

2.4 蘆丁對DSS誘導(dǎo)的NF-κB的影響最后,采用蛋白質(zhì)印跡法研究了蘆丁對DSS誘導(dǎo)的NF-κB信號通道的影響。DSS誘導(dǎo)可明顯激活p-IκBα[對照組的(3.24±0.31)倍]和核p65[對照組的(2.64±0.25)倍]的表達(t=22.85,20.74,均P<0.001),而蘆?。?0、40、80 mg∕kg)處理可有效地降低p-IκBα[對照組的(2.76±0.24)、(2.43±0.22)、(1.16±0.09)倍](t=3.87,6.74,20.38,均P<0.05)和核p65[對照組的(1.74±0.21)、(1.46±0.14)、(1.25±0.11)倍](t=8.72,13.02,16.09,均P<0.001),且高劑量組(80 mg∕kg)時p-IκBα和核p65的表達最低。結(jié)果表明,蘆丁可有效下調(diào)DSS激活的NF-κB信號通路。

3 討論

DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型具有簡單,快速,可重復(fù)性和可控性等優(yōu)點,廣泛應(yīng)用在炎癥性腸病的研究中,該模型能夠模擬人UC,出現(xiàn)腹瀉、血便、體質(zhì)量減輕等癥狀[13]。本研究采用DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型,研究了蘆丁對結(jié)腸炎的保護作用及潛在的機制,結(jié)果表明蘆丁能有效抑制DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎,降低MPO、TNF-α、IL-6水平,并抑制NF-κB信號通路的激活。

DAI評分是一種大鼠精神狀況、活動、糞便性狀及便血情況的綜合評價指標(biāo),可反映結(jié)腸炎的狀況。DSS誘導(dǎo)后,模型組DAI評分顯著升高,而給予蘆丁后,蘆丁組(20、40、80 mg∕kg)DAI較模型組顯著降低,且高劑量組(80 mg∕kg)的DAI評分最低。結(jié)果提示,蘆丁可有效緩解DSS誘導(dǎo)的UC。MPO為血紅素蛋白,是嗜中性多形核粒細(xì)胞功能活性及其狀態(tài)的產(chǎn)物,可直接誘發(fā)MPO下的中性粒細(xì)胞浸潤性改變[14]。我們的研究結(jié)果顯示:模型組MPO水平顯著高于對照組;而蘆丁處理則可以有效地降低DSS誘導(dǎo)MPO的異常升高,且高劑量組(80 mg∕kg)的MPO活性最低。結(jié)果表明,蘆丁可以有效抑制DSS誘導(dǎo)UC大鼠結(jié)腸組織MPO的活性。此外,DSS誘導(dǎo)大鼠結(jié)腸炎后,可引起TNF-α和IL-6等促炎因子大量釋放[15]。TNF-α是炎癥和免疫反應(yīng)中的一種重要介質(zhì),由多種細(xì)胞分泌,包括脂肪細(xì)胞、活化的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞[16]。IL-6作為網(wǎng)絡(luò)中細(xì)胞因子的主產(chǎn)物,在提示急性炎癥反應(yīng)環(huán)節(jié)發(fā)揮了關(guān)鍵性作用,該指標(biāo)水平的異常升高,誘導(dǎo)C反應(yīng)蛋白和降鈣素原的生成,促進炎癥的發(fā)生和發(fā)展[17]。TNF-α和IL-6受NF-κB信號通路的調(diào)控,其水平異常升高將導(dǎo)致大鼠結(jié)腸組織發(fā)炎和損傷,嚴(yán)重可誘發(fā)結(jié)腸癌。本研究評估了蘆丁對DSS誘導(dǎo)UC的TNF-α和IL-6水平,發(fā)現(xiàn)蘆?。?0、40、80 mg∕kg)處理可以有效地降低結(jié)腸組織TNF-α和IL-6水平,且高劑量組(80 mg∕kg)的TNF-α和IL-6水平最低。結(jié)果表明,蘆丁可有效緩解DSS誘導(dǎo)TNF-α和IL-6水平的異常升高。

NF-κB在炎癥中負(fù)責(zé)調(diào)控炎癥基因轉(zhuǎn)錄,為最重要的基因轉(zhuǎn)錄因子。NF-κB激活后,導(dǎo)致p65從細(xì)胞質(zhì)進入細(xì)胞核中并發(fā)生易位,調(diào)控炎性細(xì)胞因子的分泌,同時NF-κB又被這些炎性因子進一步激活[18]。IκBα是NF-κB的抑制劑,刺激因子誘導(dǎo)IκB磷酸化,從而釋放NF-κB,調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)的合成與釋放[19]。有研究發(fā)現(xiàn),UC病人腸上皮細(xì)胞和黏膜巨噬細(xì)胞中,活化的NF-κB表達明顯增加[20]。因此,我們評估了蘆丁對NF-κB信號通路的影響,以明確蘆丁緩解UC的機制,結(jié)果顯示:蘆?。?0、40、80 mg∕kg)處理后p-IκBα和核p65的表達較模型組顯著下降,且高劑量組(80 mg∕kg)時p-IκBα和核p65的表達最低。結(jié)果證實,蘆丁可有效下調(diào)DSS誘導(dǎo)UC的NF-κB信號通路的激活。

綜上所述,蘆丁可有效緩解DSS誘導(dǎo)的大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的癥狀和炎癥反應(yīng),其作用機制可能通過下調(diào)NF-κB信號通路實現(xiàn)。

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